AULAS PRÁTICAS

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MEIOS DE CULTURA 
Estudo de microrganismo: isolamento 
 
 
Técnicas e MEIOS DE CULTURA: induzir sua reprodução 
e seu desenvolvimento 
 
Ø Associação qualitativa e quantitativa de 
substâncias que fornecem nutrientes necessários 
ao desenvolvimento de microrganismos fora do 
seu ambiente natural 
Ø Alguns microrganismos têm exigências: cultivo 
in vivo 
Ø Meio + técnica de semeadura 
(cultivo eficiente, crescimento, isolamento, 
estudo da morfologia colonial, patogenicidade, 
característica bioquímica) 
 
Classificação 
o Líquido (caldo): nutrição em solução aquosa 
turvação 
o Sólido (ágar): 1,5 a 2% tubos ou placas de Petri 
placas: forma colônias isolamento estudo 
morfológico 
o Ágar inclinado (tubo): somente crescimento com 
obtenção de uma biomassa 
o Semissólido: pequeno percentual de ágar (0,5) 
permite observar a mobilidade da bactéria 
 
Função 
o Meio simples: pouco exigentes (caldo) 
o Meio de enriquecimento: adiciona-se substrato 
simples (sangue soro ou extrato de leveduras 
etc) 
o Meio seletivo: crescimento de determinados 
organismos em detrimento de outros 
o Meu diferencial: desenvolvimento de grupos com 
características relativamente definidas permite 
diferenciação de grupo e espécie (ágar sangue) 
o Meio de manutenção: manter a viabilidade (ágar 
sangue) 
o Meio de transporte: simples, impede a 
multiplicação excessiva 
 
Composição 
o Complexas: substâncias químicas simples 
(extrato de carne sangue soro) economicamente 
mais barato 
o Sintéticos: composição química definida 
• Evidenciar as reações enzimáticas e 
bioquímicas 
• Determinação do número e tipo de 
microrganismos em uma mostra condições 
amplas isolamento de todos os 
microrganismos 
 
 
 
 
 
 
 
Coloração de Gram 
Principais técnicas utilizadas para a visualização 
microscópica da forma e dos arranjos dos diferentes 
tipos de bactérias 
Método diferencial 
 
Bactérias Gram-negativas 
Parede celular composta de uma fina camada de 
peptidoglicano, sobre a qual se encontra a membrana 
externa composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, 
proteínas e lipopolissacarídeos. 
 
Bactérias Gram-positivas 
 Possuem parede celular mais espessa em comparação 
às Gram negativas, de peptidoglicano (representando 
aproximadamente 90%) e ácido tecóico. 
 
 
Não se aplica 
• micoplasmas, bactérias desprovidas de parede 
• micobactérias pela presença de muitos lipídios 
insolúveis na parede 
• espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco 
permeável aos corantes 
 
Procedimento 
Meio líquido 
• Com auxílio da alça de inoculação previamente 
esterilizada, colocar 2 – 3 alíquotas da amostra em uma 
lâmina de vidro 
• Espalhar bem sobre a superfície da lâmina, fazendo 
movimentos circulares 
• Deixar secar ao ar 
• Flambar a alça na chama do bico de gás antes de 
recolocá-la em seu lugar. 
 
Meio sólido 
• Com auxílio da alça de inoculação, previamente 
esterilizada, colocar uma gota 
de solução salina na superfície de uma lâmina de vidro 
• Flambar a alça, deixar esfriar e coletar uma alíquota 
da cultura bacteriana 
• Misturar na gota de solução salina, fazendo uma 
suspensão homogênea 
• Deixar secar ao ar 
• Flambar a alça na chama do bico de gás antes de 
recolocá-la em seu lugar 
 
Fixação dos Esfregaços 
• Após a secagem, fixar os esfregaços, passando as 
lâminas cerca de 3 vezes 
sobre a chama da lamparina 
• Deixar esfriar e corar 
 
Coloração de Gram 
• Colocar a lâmina no recipiente para a colorações 
• Cobrir o esfregaço com solução de violeta de genciana 
ou cristal violeta. 
Aulas Práticas Microbio 
Aguardar 3 minutos e desprezar o corante no recipiente 
• Cobrir com lugol, aguardar 2 minuto, e desprezar no 
recipiente 
• Lavar a lâmina rapidamente com água corrente 
• Inclinar a lâmina, gotejar éter acetona até que não haja 
desprendimento de 
corante 
• Lavar a lâmina rapidamente em água corrente 
• Cobrir com fucsina ou safranina, aguardar 30 
segundos e lavar a lâmina 
• Secar com papel filtro sem esfregar a lâmina 
 
 
Coloração 
de Esporos Bacterianos 
Ø Estrutura de parede espessa formada no interior 
de algumas bactérias (esporo, já sofreu lise e foi 
liberado endósporo não) 
Ø Resistente ao calor, à dessecação e outros 
agentes químicos e físicos. 
Ø Proteína (mais externamente), capa do esporo: 
várias camadas de proteínas ricas em ligações de 
dissulfetos, responsáveis pela resistência do 
esporo a agentes químicos e físicos, e, mais 
internamente fica o córtex do esporo, formado 
por camadas de peptideoglicano. 
 
 
Procedimento 
Mesmos procedimentos iniciais da coloração 
de Gram 
 
Coloração 
Adicional verde malaquita e aquecer com emissão de 
vapor por 5-8 minutos 
• Lavar suavemente em água corrente 
• Corar com safranina, por 30 segundos 
• Lavar suavemente em água corrente 
• Secar com papel filtro e observar ao 
microscópio 
Observação ao microscópio 
• Colocar 1 gota de óleo mineral ou óleo de 
imersão sobre o esfregaço 
• Focalizar com objetiva de imersão (100x) 
 Observar a forma os endósporos no interior do bacilo 
e/ou os esporos externos às células vegetativas 
Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com 
algodão e éter-álcool 
 
Célula veg vermelho, esporo verde 
 
 
Agentes químicos 
As taxas de crescimento e morte microbianas são 
fortemente influenciadas por vários fatores ambientais 
 
série de procedimentos com a finalidade de reduzir a 
quantidade, eliminar ou impedir a multiplicação de 
microrganismos existentes em um determinado 
equipamento, ambiente, em alimentos ou em superfícies 
vivas (desinfecção, antissepsia, sanitização, 
esterilização- assepsia) 
Após a coleta vai para a estufa a 37C por 24-28 hr 
PvPi: Redução significativa 
Álcool iodado: bem boa 
Hipoclorito: seleção, boa 
Desinfetante comercial: não tão eficiente 
Desinfetante hospitalar: bem eficiente 
Álcool 70%: boa redução 
Álcool gel 70%: bem eficiente 
Sabonete normal: redução boa 
 Sabonete antisséptico: pior que o normal 
 
Agentes Físicos 
Álcool 70% 
Incineração: flambagem da alça ou agulha de inoculação 
(prevenir a formação de aerossóis) 
Ponto térmico de morte: temp elimina em 10 min, ph 
neutro por 24 h 
Tempo de morte térmica: tempo necessário, para uma 
determinada temp., eliminar todas as bactérias 
Autoclave: controle (fita e tubo c/ esporos) 
 
Radiação UV: ação superficial, formação de dímeros de 
pirimidina, que impede o pareamento, formando 
uma lacuna no DNA replicado 
 
 
DILUIÇÃO E CONTAGEM EM PLACA 
 
Princípio 
Cada célula vegetativa viável, em condições adequadas, 
se dividirá e formará uma colônia visível 
• Célula X UFC (unidade formadora de colônia) 
• Diferentes condições – contagem de diferentes 
microrganismos 
 
Precisão 
Dispersão homogênea dos microrganismos 
• Muitas vezes para a contagem “viável” é 
necessário diluir (diluição em série) 
• Agitar antes de realizar as diluições 
• Agitar amostras e diluições antes de semear 
• Semear diversas placas por diluição, mínimo 
duplicata (quanto mais diminuir, mais eficiente) 
• Microrganismos não viáveis não serão contados 
 
Amostra pura: Contagem = 167 x 10 = 1670 = 1,67 x 103 
UFC x mL-1 
 Amostra diluição 10-1: Contagem = 26 x 101 x 10 = 
2600 = 2,6 x 103 UFC x mL-1 
 Amostra diluição 10-2: Contagem = 12 x 102 x 10 = 
12000 = 1,2 x 104 UFC x mL-1 
 
 
 
Técnicas de semeadura 
Finalidade: permitir a transferência (inoculação) de 
bactérias ou de uma cultura bacteriana de um material 
(secreção, alimento, etc) ou de um meio de cultura para 
outro (s) garantindo que apenas os microrganismos em 
questão sejam semeados 
� De acordo com o tipo de meio de origem e destino bem 
como da finalidade específica da inoculação, diferentes 
técnicas são executadas 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coloração de Ziehl-Neelsen 
Þ Mycobacterium são bacilos longos, delgados, retos ou 
ligeiramente encurvados, imóveis, aeróbios estritos e 
formadores de esporos (podem sobreviver por longos 
períodos no solo) 
Þ São patogênicosao homem e aos animais 
Þ As micobactérias apresentam crescimento lento e 
alto conteúdo lipídico (ácidos micólicos) na parede 
celular – responsáveis pela estabilidade ácida: 
quando coradas resistirem ao descoramento por 
soluções álcool-ácido (BAARs – Bacilos álcool-ácido 
resistentes) 
 
o M. tuberculosis – tuberculose humana e de 
primatas. Método de Ziehl-Neelsen pode ser 
utilizado para confirmar o diagnóstico 
o M. bovis – tuberculose bovina e da zoonótica em 
humanos 
o M. avium – tuberculose aviária e em humanos 
imunossuprimidos (Tuberculose atípica) 
o M. leprae – hanseníase, uma doença que se 
caracteriza por lesões da pele, mucosas e nervos 
periféricos 
 
Mesmo procedimento que a coloração de Gram 
Coloração 
• Colocar a lâmina no recipiente para a colorações 
• Cobrir o esfregaço com fucsina fenicada de Ziehl, 
aquecendo a lâmina até a emissão de (5-8 minutos) 
• Escorrer o corante e lavar com água corrente 
• Lavar com a solução álcool-ácido clorídrico 3% 
(diferenciador, dos bacilos das demais cels que ficam 
incolores) 
• Lavar com água corrente 
• Cobrir a lâmina com solução de azul de metileno por 1 
minuto (contra corante) 
• Lavar, secar e observar ao microscópio 
 
Observação no microscópio 
• Colocar 1 gota de óleo mineral ou óleo de imersão sobre 
o esfregaço 
• Focalizar com objetiva de imersão (100x) 
• Observar os BAAR em vermelho e demais células em 
azul 
• Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com 
algodão e éter-álcool 
 
ANTIBIOGRAMA 
Þ O uso adequado e criterioso de antimicrobianos é 
muito importante para prevenção da seleção de 
amostras bacterianas multirresistentes 
 
Þ O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou 
antibiograma permite o esclarecimento objetivo do 
perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de 
drogas eficazes no tratamento 
 
Þ O antibiograma é indicado para qualquer 
microrganismo relacionado ao processo infeccioso 
mas, principalmente, àqueles cuja sensibilidade a 
drogas normalmente empregadas na terapia não seja 
previsível como por exemplo: S. aureus, bacilos 
gram-negativos não fermentadores (Pseudomonas), 
bacilos Gram negativos fermentadores 
(enterobactérias) etc. 
 
A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser 
determinada direta (método de diluição) ou 
indiretamente (difusão) 
 
• Método de diluição: concentrações variadas do 
antibiótico, obtidas pela diluição em caldo são inoculadas 
com o microrganismo. A concentração mais baixa do 
antibiótico que evita o desenvolvimento após a 
incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória 
mínima 
 
• Método de difusão: discos de papel impregnados com 
o antibiótico são colocados uniformemente na superfície 
do ágar semeado com o microrganismo. Forma-se, então, 
um gradiente de concentração pela difusão do 
antimicrobiano a partir do disco com, consequente, 
inibição do desenvolvimento do microrganismo sensível 
ao (s) determinado (os) antimicrobiano (os) 
 
DIFUSÃO 
Þ Por sua simplicidade e rapidez, o método de difusão 
com discos tem preferência sobre os de diluição para 
os testes de rotina, mas é indispensável que sejam 
rigorosamente padronizados: 
– meio enriquecedor Muller-Hinton, que é um 
meio padronizado, de pH neutro 
– cultura pura e recente 
– inóculo com concentração conhecida 
 
Þ A base para o julgamento de sensibilidade é o 
tamanho real do halo de inibição, mas o tamanho do 
halo sozinho não é uma medida quantitativa da 
atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que 
quanto maior o halo, mais potente seja o antibiótico. 
Þ Comparações diretas dos diâmetros dos halos 
produzidos por antibióticos não relacionados são 
falsas e não devem ser realizadas 
 
Þ Deve-se interpretar a sensibilidade de acordo com os 
dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação aos 
dados de tabelas 
 
Þ 37c por 24 horas 
Þ Avaliação dos resultados 
 
CATALASE 
Þ Enzima responsável pela neutralização de formas 
tóxicas do oxigênio ao microrganismo (peróxidos e 
superóxidos) 
 
Procedimento 
 
Þ Utiliza-se o peróxido de hidrogênio (H2O2): + 
microrganismo produz catalase – H2O2 será 
degradado em H2O e 1⁄2 O2 (desprendimento de 
bolhas gasosas) 
 
Þ Pode ser realizada com o microrganismo obtido em 
qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, 
pois este possui catalase, levando a resultados falso-
positivos 
Þ Prova utilizada para diferenciar membros da família 
Micrococcaceae e da família Streptococcaceae 
Þ Auxilia na identificação de Mycobacterium 
 
 
Coagulase 
Coagulase livre: enzima produzida e liberada pelo 
microrganismo 
 
Þ Enzima + fator de coagulação do plasma = substância 
semelhante, mas não idêntica, à trombina, que 
converte fibrinogênio em fibrina 
Þ Teste em tubo: mais sensível (detecta tanto 
acoagulase livre quanto a ligada) 
Þ Plasma citratado humano ou de coelho + cultura a 
ser testada: incubação 37°C 
Þ Leitura a cada hora até 6 horas e depois em 24 
horas: algumas espécies produzem cinases, que 
dissolve o coágulo formado 
 
 
 
OXIDASE 
 
Þ Utilizado na identificação de bactérias Gram 
negativas – distingui não fermentadoras (oxidase 
positiva) de enterobactérias (oxidase negativa) 
Þ Bactérias aeróbicas: cadeia de elétrons para obter 
energia, porém nem todas as cadeias são iguais 
Þ Algumas bactérias têm na sua cadeia transportadora 
de elétrons, o citocromo C, outras não 
Þ O citocromo C-oxidase é a última enzima que 
transfere elétrons ao oxigênio 
Þ Princípio 
 No sistema da cadeia de elétrons os aceptores 
eletrônicos naturais podem ser substituídos por 
substratos artificiais, que na presença de 
oxigênio atmosférico, são oxidados pela 
citocromo oxidase, formando um composto 
colorido 
Procedimento 
• Papel filtro umedecido com solução de oxalato de p-
aminodimetilanilina a 1% + microrganismo 
• Leitura: em 15 segundos a 1 minuto 
 
Camp 
 
 
Testes Bioquímicos 
▪ auxiliar a identificar grupos ou espécies de bactérias 
através da verificação das transformações químicas, que 
ocorrem num determinado substrato, pela ação das 
enzimas de um dado microrganismo 
▪ processo de identificação dos microrganismos é 
efetuado através da determinação de um número 
mínimo de propriedades, portanto, quanto menor o 
número de observações efetuadas, maior o risco de erros 
de identificação 
▪ utiliza meios de cultivo especiais contendo o substrato 
a ser analisado 
▪ Família Enterobacteriaceae: maioria dos bacilos 
Gram- clinicamente importantes 
o mesmo complexa, menos de 20 espécies são 
responsáveis por cerca de 95% das infecções (30 
35% de todas as septicemias, por mais de 70% das 
infecções do trato urinário e por muitas das 
infecções intestinais) 
o encontram-se no solo, na água, na vegetação e 
fazem parte da microbiota intestinal normal de 
muitos animais 
 
ENTEROBACTERIACEAE 
Características comuns 
 ▪ Bacilos Gram- 
 ▪ Não esporulados 
 ▪ Catalase positivos 
 ▪ Requerimentos nutricionais simples 
 
Podem ser 
 ▪ Móveis (peritríquio) ou imóveis (Klebsiella, 
Shigella e Yersinia) 
 ▪ Aeróbios, anaeróbios ou anaeróbios facultativos 
 ▪ Algumas podem fermentar a lactose (p.ex. E. coli, 
Klebsiella...) 
 ▪ Ter cápsula (a maioria das Klebsiella) 
 ▪Possuir fímbrias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ORDEM: TSI, SIM, ureia citrato, glicose, lactose, 
controle, lisina e ornitina 
 
PRIMEIRA COISA É IDENTIFICAR A MORFOLOGIA E A 
COLORAÇÃO DE GRAM, ISOLADO DE ONDE (água, solo, 
ouvido, ambiental)