Hematologia - Técnicas de coloração

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Técnicas de coloração
Extensão Sanguínea
Coloca-se uma gota de sangue, a qual
será distribuída de forma homogênea
na ponta da extensora, e a extensão é
feita num ângulo de 45º. A extensão
pronta será utilizada para fazer a
coloração.
May-Grünwald
É uma mistura de eosina e azul de
metileno (não oxidados), que
quimicamente se transforma em
eosinato de azul de metileno.
Dissolve-se 0,3 grama do sal em 100
mL de metanol. Deixa-se o corante
“envelhecer” em local fresco e escuro,
em frasco âmbar durante 7 dias,
homogeneizando-o diariamente. Após
esse tempo, o corante está pronto
para uso.
Giemsa
É uma mistura de azur II (mistura
equimolar de azul I e azul de metileno)
e eosinato de azur II (corante
formado pela combinação equimolar
de azur I, azul de metileno e eosina
amarelada).
Dissolve-se 1 grama do sal em 66 mL
de glicerol, deixa-se em banho-maria
a 56 °C, durante 2 horas,
homogeneizando-o periodicamente
com auxílio de um bastão de vidro.
Após esse tempo, deixa-se a solução
adquirir a temperatura ambiente e
adiciona-se 66 mL de metanol. Coloca-
se a solução corante em frasco
âmbar, deixa-se em local fresco e
escuro durante 7 dias.
Sobre a lâmina, colocar 2 mL do
corante de May-Grünwald. Deixar
entre 3 e 4 min. 
Sem retirar o May-Grünwald,
adicionar 2 mL de solução tampão ou
água sem derramar o corante. Deixar
1 min.
Desprezar a solução corante-tampão
ou água.
Adicionar 2 mL do corante de Giemsa
(pronto para uso). Deixar entre 15 a
20 minutos.
Lavar a lâmina em água corrente,
limpar a parte de trás para retirar
restos de corante. Deixar secar ao ar
e então a lâmina estará pronta para
a leitura.
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Os corantes ácidos (eosina) têm
afinidade por estruturas celulares
básicas (vermelhas ou rosadas), e os
básicos (azul e azures de metileno), por
estruturas celulares ácidas (o núcleo da
célula, por exemplo). Se o citoplasma
estiver mais azulado, haverá resíduos de
núcleo ou atividade nuclear
acontecendo, mas também pode ser um
erro de coloração (tempo prolongado)
ou as proporções de azul de metileno
estão erradas.
O pH da solução tampão ou água é
muito importante. Em pH neutro, os
corantes atuam na estrutura celular pela
qual têm afinidade. 
Técnica de Coloração May-Grünwald
Giemsa
Quando o pH está ácido, há
favorecimento da ação da eosina, e a
coloração torna-se avermelhada,
dependendo da acidez da solução
tampão ou água. Em pH alcalino, a
coloração torna-se basofílica, com
intensidade de azul proporcional ao
aumento do pH.
Wright
É uma mistura dos derivados do azul
de metileno com sais de eosina-azul
de metileno.
Dissolvem-se 3 gramas do corante em
100 mL de glicerol. Após a dissolução,
completa-se o volume da solução para
1.000 mL com metanol. Deixa-se o
corante “envelhecer” em frasco
âmbar, em local escuro e fresco
durante 7 dias, homogeneizando-o
diariamente.
Sobre a lâmina, colocar o corante
de Wright, cobrindo-a totalmente.
Em geral, são necessários 2 mL do
corante. Deixar entre 3 e 4 min.
Sem retirar o Wright, adicionar
igual quantidade de solução
tampão ou água sem derramar o
corante. Deixar de 10 a 15 minutos.
Lavar a lâmina em água corrente,
limpando a parte de trás, para
retirar restos de corante. Deixar
secar ao ar e então a lâmina
estará pronta para a leitura.
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O tempo que o corante fica sobre a
lâmina e o tempo da mistura corante-
solução-tampão ou água devem ser
estabelecidos pelo profissional que
realiza a contagem diferencial, pois,
de modo geral, esses corantes podem
variar o tempo de coloração a
depender da técnica, da
concentração, da idade do corante
(os corantes envelhecidos têm
estabilidade e coloração um pouco
menor do que os recém-preparados).
Os tempos acima foram sugeridos,
pois, de um modo geral, são os mais
utilizados na rotina laboratorial.
Leishman
É uma mistura dos derivados do azul
de metileno com sais de eosina-azul
de metileno. Foi muito utilizada para
identificar leishmaniose e outros
hemoparasitas.
Dissolve-se 0,2 grama do corante de
Leishman em 100 mL de metanol.
Deixa-se o corante “envelhecer” em
frasco âmbar, em local escuro e
fresco durante 7 dias,
homogeneizando-o diariamente.
Técnica de Coloração Wright
Técnica de Coloração Leishman
Sobre a lâmina, colocar o corante
de Leishman, cobrindo-a
totalmente. Em geral, são
necessários 2 mL do corante.
Deixar entre 3 e 4 min.
Sem retirar o Leishman, adicionar
igual quantidade de solução
tampão ou água sem derramar o
corante. Deixar de 10 a 15 minutos.
Lavar a lâmina em água corrente,
limpando a parte de trás, para
retirar restos de corante. Deixar
secar ao ar e então a lâmina
estará pronta para a leitura.
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Obs.: As técnicas são muito
semelhantes, o que muda é a
composição e a proporção de eosina,
azul metileno, metanol e glicerol.
Panótico – Corante Rápido
Corante 1: metanol e tem a
finalidade de fixar as extensões;
Corante 2: eosina e tem a
finalidade de fazer a coloração
citoplasmática;
Corante 3: azul de metileno ou dos
azures de metileno, tem a
finalidade de fazer a coloração de
estruturas nucleares.
Os corantes rápidos são baseados no
método de Field que tinha como
objetivo fazer uma coloração rápida
nas preparações de gota espessa
para a pesquisa do Plasmodium spp
(protozoário que causa malária).
Esses corantes foram adaptados para
a coloração de extensões sanguíneas,
sendo compostos de três corantes:
Técnica de Coloração Panótico
Colocar o berço com as lâminas no
corante 1 e deixar por 10
segundos. Durante esse tempo,
nenhum movimento deve ser
executado.
Retirar o berço do corante 1 e
deixar escorrer por 5 segundos.
Colocar o berço no corante 2 e
deixar por 10 segundos. Durante
esse tempo, nenhum movimento
deve ser executado.
Retirar o berço do corante 2 e
deixar escorrer por 5 segundos.
Colocar o berço no corante 3 e
deixar por 20 segundos. Durante
esse tempo, nenhum movimento
deve ser executado.
Retirar o berço do corante 3,
deixar escorrer por 5 segundos e
lavar em água corrente.
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O que deve ser entendido a respeito
dos corantes rápidos é que eles são
limitados quanto à capacidade de
fornecer informações mais detalhadas
sobre a disposição da cromatina e de
revelar detalhes de estruturas
citoplasmáticas e nucleares. A
coloração rápida pode ser bastante
adequada, desde que seja realizada
com rigor técnico.