Relátorio de coloração de Gram e Papanicolaou

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UNIVERSIDADE SANTO AMARO- UNISA
Biomedicina
Gabrielle B. Rodrigues
Kamila Silva Bueno Miranda
Luana Feliciano de Moura
Mayara Candido de Oliveira Santos
Mayara da Silva Pereira
Relatório de coloração de Gram e Papanicolaou
São Paulo
2021
Gabrielle B. Rodrigues
Kamila Silva Bueno Miranda
Luana Feliciano de Moura
Mayara Candido de Oliveira Santos
Mayara da Silva Pereira
Relatório de coloração de Gram e Papanicolaou
Relatório de aula prática para a obtenção de
nota parcial do curso de Biomedicina para a
disciplina de Citopatologia e Histotecnologia
da Universidade Santo Amaro-UNISA para a
Prof° Ms. Priscila Paruci.
São Paulo
2021
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Materiais utilizados na coloração de Gram…………………………………...7
Figura 2: Materiais utilizados na coloração de Papanicolaou ……………………....…8
Figura 3: Verniz, pipeta pasteur e lamínula usados na finalização……………….. ….8
Figura 4: Lâmina recém corada de Gram……………………………. ………………...10
Figura 5: Lâmina recém corada de Papanicolaou…………………...……………..…..12
Figura 6: Resultado da coloração de Gram…………………………………….……….13
Figura 7: Resultado da coloração de Gram…………………………..………………....13
Figura 8: Resultado da coloração de Papanicolaou………………....………………...14
Figura 9: Resultado da coloração de Papanicolaou…………………….…………….. 15
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ...………………………………………………………………………….5
2. OBJETIVO ………………………………………………………………………………..6
2.1 Objetivo Geral ……………………………………………………………………..6
2.2 Objetivo Específico ………………………………………………………………...6
3. MATERIAIS ……………………………………………………………………………….7
3.1 Coloração de Gram ………………………………………………………………..7
3.2 Coloração de Papanicolaou ……………………………………………………...7
4. MÉTODOS ………………………………………………………………………………..9
4.1 Coloração de Gram ………………………………………………………………..9
4.2 Coloração de Papanicolaou ……………………………………………………..10
5. RESULTADO …………………………………………………………………………….13
5.1 Coloração de Gram ……………………………………………………………….13
5.2 Coloração de Papanicolaou ……………………………………………………..14
5.3 Questões realizadas em sala sobre a Coloração de Papanicolaou ...……….15
6. DISCUSSÃO …………………………………………………………………………….17
7. CONCLUSÃO …………………………………………………………………………..18
REFERÊNCIAS ………………………………………………………………………….19
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1. INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é um importante teste realizado nos laboratórios de
microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnóstico de doenças bacterianas.
A coloração de Gram envolve uma série de procedimentos antes de chegar à
etapa final de leitura da lâmina preparada: envolve a confecção do esfregaço, sua
fixação e passa pela coloração propriamente dita ¹.
Neste estudo avaliou-se a influência de variações na referida coloração
considerando os tempos de exposição aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de
Gram e o emprego ou não de lavagens com água entre as etapas ¹.
A citopatologia é uma técnica de diagnóstico que examina células de vários
locais do corpo para determinar a causa ou a natureza da doença ².
Os espécimes de células são processados em lâminas e examinados
microscópicamente para o diagnóstico de câncer, condições pré-cancerosas,
tumores benignos e algumas doenças infecciosas ².
O primeiro teste de citopatologia desenvolvido foi a coloração de
Papanicolaou. Sendo uma coloração para exames como a colpocitologia oncótica
ou citologia cervico-vaginal.
Para esta técnica utiliza-se três corantes: a Hematoxilina de Gill (substituída
também pela Hematoxilina de Harris), Orange G e Eosina Alcoólica (EA-36) ².
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2. OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
A aula teve como objetivo realizar duas colorações que são: Coloração de
Gram e coloração de Papanicolaou. Sendo realizada desde a coleta da amostra oral,
materiais, métodos e procedimentos, incluindo tempo, ordem e funções dos corantes
até a fase de análise dos resultados e observar se há presença de alterações.
2.2 Objetivo Específico
As principais características a serem observadas são as diferenças entre as
colorações e como as células coram em cada processo. Na coloração de Gram, as
células Gram-positivas aparecem coradas em violeta escuro e as Gram-negativas
em vermelho ou rosa escuro, porém esta coloração é mais utilizada em coloração de
bactérias. A coloração de Papanicolau é utilizada para a leitura de células colhidas
por raspagem em cavidades como a cervico-vaginal e mucosa oral, sendo a mais
utilizada para o rastreamento de câncer no colo do útero.
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3. MATERIAIS
3.1 Coloração de Gram
- Amostra do paciente (coleta oral realizada em sala de aula);
- Lâmina;
- Abaixador de língua;
- Álcool 95%;
- Corante Cristal violeta;
- Água destilada;
- Lugol;
- Etanol- acetona;
- Corante Fucsina.
Figura 1: Materiais utilizados na coloração de Gram.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
3.2 Coloração de Papanicolaou
- Amostra do paciente (coleta oral realizada em sala de aula);
- Lâmina;
- Abaixador de língua;
- Álcool 95%;
- Álcool 70%;
- Álcool 50%;
- Corante Hematoxilina de Harris;
- Hcl 0,2%;
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- Água destilada;
- Corante Orange G;
- Corante Eosina Alcoólica 36;
- Álcool absoluto;
- Xilol;
- Verniz;
- Pipeta Pasteur;
- Lamínula.
Figura 2: materiais utilizados na Coloração de Papanicolaou.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
Figura 3: Verniz, pipeta pasteur e lamínula usados na finalização do processo da coloração.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
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4. MÉTODOS
4.1 Coloração de Gram
O método consiste no tratamento de uma amostra, sendo usado como
corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol.
Nesse momento a amostra adquire uma coloração violeta devido à formação de um
complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas.
Em seguida, um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O
solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das amostras
Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descurando as células.
Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das amostras
Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as
impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem
coradas.
A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente
provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de amostras, podendo produzir
resultados falsos.
Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina
básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecem coradas em violeta
escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.
Procedimento feito em aula:
Foi feita a raspagem da boca com o abaixador de língua para se obter a
amostra, em seguida foi espalhada sobre a lâmina e fixada com álcool 95%.
Após a fixação foi feito os seguintes passos:
1. Colocar o corante cristal violeta por toda a lâmina e deixar por 60 segundos;
2. Lavar a lâmina com água destilada;
3. Colocar o lugol por toda a lâmina e deixar por 60 segundos;
4. Lavar a lâmina novamente com água destilada;
5. Colocar o etanol - cetano por toda a almina e deixar por 20 segundos;
6. Lavar a lâmina novamente com água destilada;
7. Colocar o corante fucsina por toda a lâmina e deixar por 60 segundos;
8. E lavar a lâmina novamente com água destilada.
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Figura 4: Lâmina recém corada
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
9. Após este processo, a lâmina precisa secar para poder ser lida no
microscópio.
4.2 Coloração de Papanicolaou
Esta técnica utiliza três corantes: a Hematoxilina de Harris, Orange G e a
Eosina alcoólica. É um sistema de coloração utilizado para a leitura de células
colhidas por raspagem em cavidades como a cervico-vaginal e mucosa oral.
A coloração atua na concentração dos corantes e nas soluções, as estruturas
celulares ácidas tendem a atrair cátions, tanto por adsorção como em reações
químicas e as básicas com os radicais aniônicos dos corantes. O citoplasma, sendo
formado por estruturas ácidas e básicas, atrairia combinações de corantes,
enquanto o núcleo celular, possuindo ácidos nucléicos, seria predominantemente
ácido.
A primeira etapa é a fase de hidratação,a lâmina fixada em álcool 95° são
mergulhadas em cubas contendo álcool em concentração decrescente (95%, 70% e
50%) assim, mudando o meio celular e deixando que água entre na célula. O
primeiro corante usado é o hematoxilina, que é responsável pela coloração do
núcleo (é um corante básico que cora substâncias ácidas, deixando basofílico).
Então essa amostra passa por um processo de desclarificação citológica, no qual é
mergulhada em uma cuba contendo HCl a 0,2% e, em seguida, lavada com água
corrente.
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A segunda etapa é a fase de desidratação, a amostra é submetida a
concentrações de álcool crescente (50%, 70% e 95%) para permitir a coloração
definitiva do núcleo e proporcionar a absorção de dois corantes pelo citoplasma, o
primeiro corante dessa fase é o Orange G que é o diferenciador de citoplasma (é um
corante ácido que cora substâncias básicas, deixando acidofílico), após é necessário
sequência de dois álcool 95%, e o segundo corante é a Eosina Alcoólica – EA36,
responsável pela coloração das estruturas ácidas do citoplasma (é um corante
básico que cora substâncias mais ácidas do citoplasma, deixando cianofilica) e duas
sequências de álcool 95 novamente para desidratar a amostra, tornando-o
hidrofóbico.
A terceira etapa é a fase de diafanização, responsável pela desidratação total
das células, utilizando álcool absoluto e os espaços anteriormente com água são
preenchidos por uma substância oleosa, xilol, responsável pela manutenção e
preservação da morfologia celular.
E a última etapa é a fase de fixação, as células são fixadas com verniz e uma
lamínula, sendo finalizada para a leitura.
Procedimento feito em aula:
Foi feita a raspagem da boca com o abaixador de língua para se obter a
amostra, em seguida foi espalhada sobre a lâmina e fixada com álcool 95%.
Após a fixação foi feito os seguintes passos:
1. Fase de hidratação: sequência decrescente de álcool (95%, 70% e 50%) - 45
mergulhos em cada cuba;
2. Colocar na cuba com corante Hematoxilina e deixar por 5 minutos;
3. Colocar na água ácida - 1 mergulho;
4. Lavar na água destilada por 5 minutos;
5. Fase de desidratação: sequência crescente de álcool (50%, 70% e 95%) - 45
mergulhos em cada cuba;
6. Colocar no corante Orange G e deixar por 4 minutos;
7. Lavar com álcool 95 - 45 mergulhos e após isso, lavar novamente com o
álcool 95 - 45 mergulhos;
8. Colocar no corante Eosina alcoólica 36 e deixar por 4 minutos;
9. Lavar com álcool 95 - 45 mergulhos e após isso, lavar novamente com o
álcool 95 - 45 mergulhos;
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10. Fase diafanização: colocar no álcool absoluto por 5 minutos - 2 vezes;
11. Colocar no xilol por 5 minutos - 2 vezes;
12. Fase de fixação: com a pipeta Pasteur - pegar um pouco de verniz e pipetar
por cima da lâmina e colocar a lamínula por cima.
Figura 5: Lâmina recém corada
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
13. Após este processo, a lâmina precisa secar para poder ser lida no
microscópio.
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5. RESULTADO
5.1 Coloração de Gram
Após a coleta de material, foi feita a coloração de Gram que durou cerca de 5
minutos para ser realizada. Ela apresentou os seguintes resultados:
Figura 6: Resultado da coloração de Gram vista pelo microscópio.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
Figura 7: Resultado da coloração de Gram vista pelo microscópio.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
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Nessas imagens da lâmina é possível observar células da camada superficial
oral, onde apresentam o núcleo e o citoplasma. É possível observar que essas
células se coraram em rosa, devido à absorção da fucsina que é um corante básico
que tem como princípio corar estruturas ácidas como o citoplasma
5.2 Coloração de Papanicolaou
A coloração de Papanicolaou dura de 30-40 minutos devido às várias
repetições em determinadas etapas da coloração. Essa coloração apresentou os
seguintes resultados:
Figura 8: Resultado da coloração de Papanicolaou vista pelo microscópio.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
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Figura 9: Resultado da coloração de Papanicolaou vista pelo microscópio.
(Fonte: Arquivo pessoal, 2021)
De acordo com as fotos da lâmina, foram encontradas células superficiais
devido ao núcleo picnótico e denso, presença de grânulos no citoplasma.
Citoplasma plano, transparente e acidófilo.
5.3 Questões realizadas em sala sobre a Coloração de Papanicolaou:
1) Como se chama a primeira fase da coloração de papanicolaou?
R: Fase de hidratação
2) Quais são os componentes iniciais dessa fase de hidratação?
R: Os álcoois 95%, 75% e 50%.
3) Qual é a função da sequência decrescente de álcool?
R: Serve para a hidratação, pois os corantes são hidrofílicos, então tem afinidade
com a água
4) Qual é o primeiro corante a ser usado? E qual é sua função?
R: O corante Hematoxilina, que é uma corante basofílico que cora substâncias
ácidas, corando o núcleo por conta do DNA.
5) Qual é a sequência após o corante Hematoxilina?
R: É feito uma lavagem com água ácida
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6) Qual é a composição da água ácida?
R: É composta por 400 mL de álcool 50% + 0,2 mL de HCL
7) Como se chama a próxima fase da coloração de Papanicolaou?
R: Fase de desidratação.
8) Quais as concentrações de álcoois a seguir?
R: Álcool 50%, 70% e 95%
9) Qual é o corante usado?
R: Orange G.
10) Qual é a função dos duplos álcoois?
R: Lavar e fixar a coloração
11) Qual é o corante usado?
R: Eosina alcoólica.
12) Como é chamada a próxima fase?
R: Fase de Diafanização.
13) Quais as substâncias que fazem parte da fase de Diafanização?
R: Álcool absoluto e xilol.
14) Qual é o nome da última fase?
R: Fase de fixação.
15) Qual é a função do verniz?
R: Fixação e proteção da coloração.
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6. DISCUSSÃO
As duas colorações podem apresentar diferenças. Sendo que o método de
Papanicolaou é mais utilizado pela grande demanda diagnóstica, e é a coloração
aplicada em amostras de colpocitologias para diagnóstico de câncer ginecológico ³.
O método de papanicolaou é usado para o diagnóstico de infecções
principalmente cervicais, possibilitando a visualização de células indicadoras,
alterações celulares, indicação de qual o tipo de células ⁴, o grau de maturação e a
atividade metabólica celular ³.
Além de ser um método preciso e eficaz, que possibilita a visualização de
alterações celulares causadas pelo HPV (Papiloma Vírus Humano), que ao longo do
tempo pode causar câncer ⁴.
Já a coloração de Gram é útil para diagnósticos rápidos, para apontar se há
presenças de bactérias e se são classificadas em Gram positiva ou Gram negativa
de acordo com a sua sensibilidade ⁴. É um teste que apresenta leve sensibilidade,
especificidade e valor preditivo positivo e possui as vantagens de ser um teste de
fácil padronização ⁵.
A coloração de Papanicolaou ou outra coloração citopatologia, não permite a
identificação de algumas morfologias bacterianas, como os cocos, havendo a
necessidade do diagnóstico microbiológico, como a coloração de Gram ⁶.
A inflamação no trato genital inferior feminino, que não seja relacionada ao
HPV, e as infecções que podem ser encontradas com o exame citológico
cervico-vaginal, são poucas estudadas em conjunto com a microbiologia,
dependendo ainda de qual ou quais tipos de agentes patogênicos estudados ⁶.
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7. CONCLUSÃO
As colorações de Gram e Papanicolaou são técnicas realizadas de diferentes
formas, porém, com um único objetivo: corar as propriedades celulares para uma
boa avaliação e diagnóstico. Na coloração de Gram, foram utilizados os corantes
Cristal Violeta e Fucsina e na coloração de Papanicolaou foram utilizados a
Hematoxilina de Harris, Orange G e Eosina alcoólica.
Na coloração de Gram, são levados como resultados positivos ou negativos,
sendo importante para identificar se há presenças de bactérias, as células
Gram-positivas se coram na cor violeta e as Gram-negativas se coram na cor rosa.
Com o resultado da coloração de Gram foi possível observar células da
camada superficial, onde há presença de núcleo e o citoplasma. As células se
coraram em rosa, devido à absorção da fucsina queé um corante básico que tem
como função corar estruturas ácidas como o citoplasma.
E na coloração de Papanicolaou, é possível identificar se há infecções cérvico
vaginais, observando as células afetadas, o grau em que se encontra e as
conformidades que as mesmas podem apresentar.
O resultado da coloração de Papanicolaou, foram encontradas células
superficiais que têm estruturas visíveis como grânulos no citoplasma, núcleo
picnótico e denso, citoplasma plano, transparente e acidófilo e não apresenta
alterações nessas células.
São técnicas que conseguem ter uma boa finalização das células, porém para
uma diferenciação de lesão em cervico vaginal, a técnica de coloração de
Papanicolaou apresenta um melhor resultado para o foco de rastreamento de
lesões, infecções ou câncer no colo do útero.
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REFERÊNCIAS
1. Freitas VR, Picoli SR. A Coloração de Gram e as Variações na sua Execução.
NewLabs. 2007; ed.82; 124-128.
2. Laborclin. Coloração de Papanicolaou. Pinhais; 2018.
3. Caputo LFG, Mota EM, Gitirana LB. Conceitos e Métodos para formação de
profissionais em laboratórios de saúde. In. Caputo LFG, Mota EM, Gitirana
LB. v.2. Rio de Janeiro: EPSJV; 2010.
4. Morais JA, Ferraz RRN, Leonardi MJ, Barnabé AS, Fonseca SUL, Caseiro
AC, Evengelista AA, Ramos AL, Arçari DP, Abrão L, Nunes V, Fornari JV.
Comparação entre os métodos de coloração de Papanicolaou e teste de
Gram para o diagnóstico de vaginose bacteriana. Unisepe. 2018 jun; 44-46.
5. Barreto RG. Alterações inflamatórias e processos displásicos do colo do útero
e sua relação com o papilomavírus humano (HPV) em adolescentes e
mulheres jovens. [dissertação]. Ouro Preto: Universidade Federal de Ouro
Preto; 2007.
6. Silva MPS. Alcances e limites do exame citopatológico com coloração de
Papanicolaou no diagnóstico das cérvicos vaginites: um estudo citológico e
microbiológico de 2169 casos de um total de 10.064. [dissertação]. Recife:
Universidade Federal de Pernambuco; 2004.