Resumo aula de Imunologia Aplicada - TESTES SOROLÓGICOS - HIV

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TESTES SOROLÓGICOS – HIV 
O HIV é uma partícula viral envelopada, onde no envelope apresenta a proteína 
transmembrânica denominada gp41 e a proteína do envelope denominada gp120. Além 
disso possui um nucleocapsídeo onde o antígeno mais importante é o p24 e o no interior 
do nucleocapsídeo tem o material genômico, constituído por RNA, enzimas que vão 
participar da multiplicação viral como protease, integrasse e a transcriptase reversa. O 
HIV, por ser um retrovírus, possui a transcriptase reversa que é capaz de sintetizar a partir 
de seu RNA uma fita de DNA complementar. A família dos retrovírus se divide em 
oncovírus e lentivírus. 
Quando se deseja investigar HIV2 se procura o gp36, que se trata de uma proteína 
transmembrana específica desse tipo. 
A partir do momento que indivíduo se infecta, o primeiro marcador que irá aparecer é o 
RNA viral e logo depois o antígeno p24 que é do nucleocapsídeo. IgM e IgG, muitas 
vezes não é possível distinguir entre os dois tipos, então no caso de HIV é preferível 
detectar IgG ou IgG+IgM, mas nunca IgM sozinha. 
A evolução da infecção por HIV tem 4 fases: 
1. Flu-like (influenza-like): sinais e sintomas semelhantes ao Influenza, é 
considerada a fase aguda e dura cerca de 4-8 semanas. 
2. Latência clínica: dura de 2-12 anos, quando o ocorre a soroconversão. Na fase 
inicial o indivíduo ainda não montou a resposta imune então dessa forma o que se 
vai observar é uma multiplicação viral no interior da célula e quando o indivíduo 
começa a produzir os anticorpos (soroconversão) contra o vírus e células contra o 
vírus a carga viral reduz no plasma e o indivíduo entra na fase de latência. Os 
primeiros anticorpos que ele vai produzir são os anti-p24 e em seguida o anti 
antígenos do envelope. O vírus tanto pode ser quantificado/detectado pelo seu 
RNA viral ou pelo p24. Pode haver uma queda da carga viral, mas não significa 
cura. O HIV infecta as células TCD4, monócitos, macrófagos e células 
dendríticas, essas células são os principais alvo do HIV, portanto nesse período 
da latência clínica o vírus vai estar no interior dessas células nos órgãos. É 
chamado de latência clínica porque o vírus não vai estar completamente latente e 
sim se multiplicando vagarosamente dentro das células até um ponto em que 
começa a ser perceptível no plasma. 
3. Sintomática: quando ocorre o aumento do vírus no plasma se torna evidente o 
declínio das células T específicas, assim estará na fase sintomática apresentando 
uma variedade de infecções. 
4. AIDS: é uma condição que ocorre dentro da evolução do HIV. Existem doenças 
que são definidoras da AIDS e condições laboratoriais que consideram o 
indivíduo com estando com AIDS. Com isso salienta-se que AIDS não é 
sinônimo de HIV. 
Quanto aos principais antígenos a nível de diagnóstico confirmatório, inicialmente temos 
3 grupos gênicos: gag, pol e env. O env codifica as proteínas do envelope, o gag codifica 
as proteínas do cerne viral e o pol codifica as enzimas que vão participar da multiplicação 
viral. A poliproteína é quando duas ou mais proteínas estão ligadas entre si e o vírus tem 
uma protease que vai clivar essas poliproteínas gerando proteínas funcionais. A gp160 é 
uma poliproteína que cindindo vai formar a proteína do envelope gp120 e a proteína 
transmembrana gp41 (HIV-1). No gag a proteína p55 ao cindir vai dar origem à proteína 
p24, p17 e p9. 
A classificação de Fiebig mostra a evolução laboratorial dos marcadores na infecção por 
HIV. O primeiro marcador a estar presente é RNA viral e ocorre em torno de 10 dias após 
a infecção. Antes desse período não há marcador detectável. O segundo que se apresenta 
é o p24, que se apresenta em torno de 16 dias. O terceiro marcador são os anticorpos no 
imunoensaio de 3ª a partir do 21º dia. Western-blot só vai estar realmente reagente a partir 
do 30º dia, ele pesquisa anticorpos contra antígenos de diferentes pesos moleculares. 95% 
dos indivíduos infectados com HIV apresentam anticorpos detectáveis até 90 dias. Em 
torno de 5% apresentam produção (soroconversão) tardia possivelmente por dificuldade 
individual de conseguir ter uma resposta imune adequada com o vírus, com isso o 
prognóstico desses indivíduos é pior e evoluem muito rapidamente para AIDS. 
A Janela Imunológica é o período em que o indivíduo infectado ainda não produziu 
anticorpos ou que possui níveis tão baixos que não conseguem ser detectados pelos testes 
disponíveis. Já a Janela Diagnóstica é o período em que o indivíduo infectado ainda não 
apresenta um determinado marcador, seja ele material genético, antígeno ou anticorpo 
detectável pelos testes disponíveis. Então a diferença é que a primeira diz respeito 
especificamente aos anticorpos e a diagnóstica a qualquer marcador. 
O p24 já está presente na fase aguda, mas não há um teste para detectar só ele porque 
ele aparece em apenas 20-30% dos indivíduos e, com o aparecimento dos anticorpos, o 
p24 se torna indetectável e permanece assim por anos e vai reaparecer quando a carga 
viral tiver aumentada. Sua detecção isolada não serve para diagnóstico. 
ELISA para HIV 
O ELISA é um teste de triagem porque possui uma alta sensibilidade diagnóstica (SD) 
desde que passado a janela imunológica, mas a sua especificidade diagnóstica (ED) não 
chega em 100%. Ou seja, se o resultado dá negativo, o indivíduo não tem a doença, mas 
se o indivíduo não tá infectado e o resultado der positivo significa falso positiva, que é o 
que o ELISA apresenta risco. Saiu uma nota dizendo que possui reatividade cruzada com 
H1N1, ou seja, o anticorpo está reagindo com algum antígeno de um outro patógeno que 
não está relacionado com o objeto de estudo. O H1N1 não tem nenhuma similaridade 
com o HIV, é de outra família de vírus, no entanto se observou a possibilidade de 
reatividade cruzada. Portanto, diante de um resultado positivo no ELISA se faz 
necessário realizar outro exame para confirmar, como Western Blot. 
Possui 4 gerações: 
1. Constituída de antígenos obtidos a partir de cultura de células. Esse tipo resultava 
em alta taxa de falsa positividade e, portanto, foi descartado; 
2. Utiliza na fase sólida peptídeos recombinantes ou sintéticos de HIV-1 mas só 
detectava anti HIV-1 e, portanto, também foi descartada. 
3. Pesquisa anticorpos HIV-1 e HIV-2. 
4. Além de detectar anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2 ela também pode detectar 
antígeno p24. Ele não pode ser detectado isoladamente, mas pode ser detectado 
em associação. Nesse teste, na fase sólida no mesmo poço tem antígenos de HIV-
1 e HIV-2 e anticorpos contra p24. Na etapa de incubação do soro, pode ser que 
ele tenha p24 e vai se ligar. Pode ser que ele tenha anticorpos contra outras partes 
do HIV-1 e HIV-2 e também se liga. Se incuba, lava e se coloca o conjugado. 
Assim forma o sanduíche com o Anti-p24 e antígenos HIV 1 e 2 marcados com 
peroxidase. A próxima etapa depois do conjugado seria o substrato, cromógeno e 
a revelação. Independente se tem antígeno ou anticorpo ligado ele vai resultar 
numa coloração e esta não vai distinguir se se trata de anticorpo ou antígeno, pois 
a função do ELISA é apenas saber se tem antígeno ou anticorpo ligado e dá o 
sinal. 
Western-blot 
É uma técnica de confirmação para HIV, HTLV e Hepatite C. Baseia-se na associação de 
eletroforese de proteínas com transferência para membranas com objetivo de pesquisa de 
anticorpos contra proteínas de diferentes pesos moleculares. 
Inicialmente é necessário um gel de poliacrilamida (gel de alta resolução) para a 
eletroforese que normalmente é realizada em condições desnaturantes contendo docecil 
sulfato de sódio e beta mercaptoetanol. E assim sendo vai separar por peso molecular. 
Depois segue uma etapa de transferência em que se transfere o conteúdo do gel para uma 
membrana de nitrocelulose e depois tem que bloquear os sítios reativos, então se incuba 
com anticorpos primários, depois anticorpos secundários e faz arevelação. Anticorpos 
primários são os anticorpos da amostra de soro, anticorpos secundários são compostos 
pelo conjugado que pode ser marcado com peroxidase ou com fosfatase alcalina e a 
revelação é com o substrato correspondente a eles e o cromógeno específico e partir disso 
se vê a reação que chamamos in situ. Significa o anticorpo reagindo localmente com 
aquele antígeno de determinado peso molecular. 
1ª etapa: preparação do gel (analítico). Nessa técnica se pesquisa anticorpos contra HIV, 
logo os anticorpos estão no soro do paciente e no gel é colocado o antígeno que é o HIV. 
O HIV é obtido através de síntese ou de peptídeos recombinantes. 
A eletroforese em gel de poliacrilamida é chamada de PAGE (gel de poliacrilamida) esse 
gel normalmente é feito numa eletroforese vertical, com 2 placas de vidro com um 
espaçador (que vai dar a espessura do gel). O gel é um líquido que na presença de 
catalisadores vai polimerizar dentro das placas de vidro e, para evitar que escape solução, 
são colocados prendedores. Nesse gel polimerizado vão ser colocadas as poliproteínas, 
peptídeos e o que quiser analisar. A corrida do gel ocorre em cubas e no laboratório clínica 
utiliza géis de 10x10cm (géis maiores são utilizados em laboratórios de química). É 
preciso decidir que tipo de pente vai ser utilizado: 
• Analítico: quando terminar a polimerização, ao retirá-lo será visualizado uma 
série de canaletas para fazer uma análise da amostra, que serve para verificar 
que amostra foi melhor purificado/sintetizada e qual melhor protocolo de 
extração. 
• Preparativo: quando já escolheu qual amostra e qual protocolo de extração e 
vai fazer um gel preparativo. 
A poliacrilamida é obtida através da reação de acrilamida + bis acrilamida na presença de 
catalisadores (TEMED/ Persulfato de amônio). Se escolhe a concentração desejada, 
coloca na presença de catalisadores e obtém o gel. A trama formada vai fornecer poros 
por onde vão passar os polipetídeos. O mínimo de concentração de acrilamida que se pode 
colocar no gel é 5% e o máximo é de 24%. Quando se utiliza o mínimo, a trama formada 
é frouxa, ou seja, com orifícios grandes. Na concentração alta, se tem uma trama muito 
mais fechada para analisar polipetídeos menores. A eletroforese em gel de poliacrilamida 
é de alta resolução (consegue diferenciar polipetídeos de pequena diferença de peso 
molecular) e separa muito bem polipetídeos de 5 a 250 kDa, por isso é importante definir 
a concentração de acrilamida. Na hora de polimerizar é colocado o pente analítico, depois 
se retira e no local do pente formou-se os poços onde serão colocados nas amostras que 
queremos analisar. É necessário um padrão de peso molecular conhecido para saber se a 
banda que temos nas amostras corresponde àquilo que é colocado na literatura. 
2ª etapa: digerir a amostra. Como será avaliada por peso molecular, quando submete a 
amostra numa corrida eletroforética ela vai migrar em direção ao seu ponto isoelétrico, 
então para que não haja interferência da carga nativa da proteína (para não avaliar pela 
carga e sim pelo peso molecular) é necessário que tornar a proteína/polipetídeo negativo, 
para que só haja diferença de tamanho de cadeia polipeptídica. Por isso é necessário 
realizar a digestão. Em artigos costuma-se ver SDS PAGE, o que significa que aquele gel 
de poliacrilamida está sob condições desnaturantes. No caso de DNA não precisa ser 
desnaturado uma vez que já é negativo. Como tornar a proteína negativa? Digerindo. É 
um protocolo de desnaturação da proteína com o detergente Dodecil Sulfato de Sódio, 
que vai desenovelar a proteína carregando-a negativamente. Então a carga nativa da 
proteína não vai interferir e o que vai diferenciar é o tamanho! Se a proteína tiver 
subunidade, que normalmente têm pontes de sulfeto, vão ser clivadas na presença do β-
mercaptoetanol. 
3ª etapa: corrida eletroforética e coloração do gel. Terminado a preparação do gel 
analítico, uma vez polimerizado o gel está pronto para receber as amostras. Na primeira 
canaleta normalmente é colocada a amostra referência que é um padrão de pesos 
moleculares conhecidos. Nas canaletas seguintes são colocadas amostras que se quer 
analisar, submete a uma corrente elétrica e então os fragmentos maiores vão migrar menos 
e os menos fragmentados vão migrar mais, de forma que na parte inferior do gel se tem 
as moléculas menores e na parte superior do gel as moléculas maiores. Uma vez terminada 
a corrida, precisa fixar o gel o que geralmente é feito na 
presença de ácido acético e etanol e a seguir corar com um 
corante específico para proteínas. A exemplo da figura ao 
lado, se o que interessa for a proteína de 68kDa, se tem que 
a amostra 4 foi a melhor preparada, pois apresentou 
menos proteínas contaminantes, que são aquelas que 
acabaram restando após a purificação do preparado e 
provocam um arraste no gel, o que não é interessante. Por 
outro lado, pode ser que se esteja interessado na banda 5, e 
para saber qual o peso molecular se faz um gráfico com a 
distância em centímetros da migração da banda com o seu peso molecular correspondente. 
Feito esse gráfico, realiza a interpolação dessa banda e assim descobre exatamente o peso 
molecular. Se a de interesse for a 4, leva-a para um gel preparativo. 
4ª etapa: realização de um gel preparativo. Nesse gel se usa um pente com um dente 
grande e um pequeno (para ficar uma pequena cavidade onde vai ser colocado o padrão 
de peso molecular no gel). No preparativo há uma área bastante extensa onde toda a região 
vai ter a amostra escolhida em uma quantidade maior. Se por exemplo na análise foi 
utilizado 5-10µL, agora será utilizado 100-120 µL da mesma amostra. Se foi escolhida a 
amostra 4, se faz a digestão e a coloca no gel preparativo e se submete à corrente elétrica 
e inicia a corrida. Quando submete à corrente elétrica, não se submete mais à coloração. 
5ª etapa: transferência. se os polipetídeos ficarem no gel, que é como uma gelatina, ele 
vai quebrar e se desfazer, por isso transfere os polipetídeos para um suporte que seja 
permanente. Normalmente se utiliza nitrocelulose, mas também existem outras 
membranas. A de nitrocelulose é bastante resistente, a ligação das proteínas é basicamente 
definitiva e pode ser guardada a 4ºC ou no 
congelador, pois resiste bem, e tem alta afinidade 
às proteínas por meio de ligações hidrofóbicas. 
Uma vez que transferiu, pode descartar o gel. A 
transferência úmida usa uma câmera, que é colada 
dentro da cuba onde vai ter o tampão de 
transferência e é feito o sanduíche. O gel é colocado 
com os polipetídeos, e como estes estão carregados 
positivamente, devem ser deixados no polo 
negativo (há uma diferença de cor na placa), e papel 
de filtro umedecido e faz o sanduíche, coloca dentro da câmera e depois dentro da cuba 
que vai tá imersa no tampão de transferência. Essa transferência pode ser de 4-16h. Os 
polipetídeos no gel vão estar no polo negativo e vão migrar para o polo positivo para onde 
está a membrana, onde vai se aderir definitivamente. Além da transferência em câmara 
úmida, também pode ser feita em sistema semi-dry (sistema próprio) que apresenta como 
vantagem mais rapidez e usa quantidade muito pequena de solução, no entanto o custo do 
equipamento é alto. De qualquer forma, ambos tipos de técnicas são utilizados e levam a 
bons resultados. O corante de Ponceau: é um corante que se liga às proteínas e as cora de 
vermelho e na presença de água ele facilmente sai, com o objetivo de visualizar se a 
transferência foi bem sucedida. Na figura acima se observa uma amostra que foi colocada 
no gel analítico utilizando um pente preparativo que tem como vantagem que a membrana 
resultante da transferência do gel vai ter toda a extensão das mesmas proteínas de forma 
que quando tiver que cortar cada tira vai resultar em um aproveitamento melhor das 
mesmas e com certeza um número muitomaior numa membrana de 10x10cm. Ou seja, 
toda a extensão vai estar impregnada com a poliproteína, podendo chegar a 18 tiras. 
6ª etapa: pesquisa de anticorpos contra antígenos de diferentes pesos moleculares de 
amostras de soro cuja ELISA foi positivo. Cada uma das tiras é colocada em uma cuba 
de Western Blot (que tem 6 canaletas). Pode ser manual ou semiautomatizado. O agitador 
ideal tem que ser em gangorra. Na etapa de bloqueio se tem as proteínas e polipeptídeos 
que impregnaram na membrana mas há toda uma região livre, em que podem se ligar 
proteínas do soro e resultar em reação inespecífica, portanto é necessário realizar o 
bloqueio de sítios reativos. Pode ser realizado com albumina sérica bovina, soro de 
carneiro normal, soro fetal bovino ou leite desnatado (mais utilizado). Demora de 2-16h 
e em seguida é colocada o anticorpo primário, do soro do paciente e é uma etapa mais 
demorada, e é importante colocar os controles positivos e negativos. Após essa incubação 
é lavado e colocado o anticorpo secundário, importante decidir qual anticorpo vai utilizar: 
anti-IgG marcado com fosfatase alcalina ou com peroxidase. Essa escolha vai depender 
se vai fazer o teste convencional (quando se usa enzima, substrato e cromógeno ou 
lumiscente), que é para fosfatase alcalina, cujo substrato é o BCIP e o corante é o NBT, 
ela é 10x mais sensível que a peroxidase. Essa outra pode ser utilizada tanto em teste 
convencional (substrato é a peroxidase e o cromógeno é a diaminobenzidina) como no 
quimioluminescente (substrato é a peroxidase e o luminogênio é o luminol). É importante 
lembrar que o cromógeno é diferente do ELISA, pois aqui ele tem que resultar em 
precipitado, e no caso do quimioluminescente é necessário um fotodocumentador, pois o 
resultante da reação vai reagir com o luminol que vai emitir um fóton de luz captado por 
este aparelho. 
Síntese das etapas: 
A solução contendo as proteínas é 
digerida quando submetida a um 
gel com condições desnaturantes, é 
separada e depois é transferida para 
uma membrana de nitrocelulose, é 
realizado o bloqueio dos sítios 
reativos, depois cortado e incubado 
com os antircorpos primários, que 
são os anticorpos do soro dos 
pacientes e também com os 
anticorpos do controle positivo e 
negativo. Depois de incubação com 
conjugado enzimático anti-
imunoglobulinas e lavagem, a seguir é realizada uma reação de revelação, seja pelo 
método convencional ou quimioluminescente. 
No Western-blot é considerado positivo a presença de 
anticorpos contra proteínas de 2 grupos gênicos, sendo um 
obrigatoriamente do envelope (anti-gp160, anti-gp120, antigp-
41). É negativo quando não há nenhuma banda. 
Indeterminado é quando se tem qualquer outro perfil, como 
por exemplo anti-p24 isoladamente (em amostras sequenciais). 
Como mostra a figura ao lado. 
Testes rápidos 
➢ Imunocromatografia: é diferente do Western-blot. Há uma tira com a membrana 
de nitrocelulose, em uma das extremidades tem anti-IgG e anti-IgM marcado com ouro 
coloidal ou com látex colorido. Em uma região da tira vai ter fixado antígenos do HIV-1 
e HIV-2 (tem laboratórios que juntam os antígenos), e em outro ponto tem aderido anti-
IgG /IgM. É obrigatório ter 2 kits de procedências ou princípios metodológicos diferentes. 
O procedimento: se coloca o soro, plasma ou punção digital + eluente. O anticorpo do kit 
vai então se ligar a IgG e IgM da amostra, que vão fluir por capilaridade. Se tiver anti-
HIV1 ou anti-HIV2 vai se ligar nas suas respectivas regiões. Toda amostra tem IgG e IgM 
que vão ser capturadas na outra região, essa captura é feita para validar o kit (é o controle 
positivo). O teste é positivo quando reage nas duas regiões. 
➢ Duplo percurso: utilizado para fluido oral, coletado por swab na região gengival 
e a amostra é colocada em um frasco eluente. Depois de uma leve agitação, pinga-se duas 
gotas no primeiro poço do teste, se espera um tempo e depois é colocado o conjugado 
marcado com ouro coloidal no segundo poço. Há uma janela de leitura que possui HIV e 
anti-IgG aderido. A amostra com eluente vai correr e se ligar nas bandas, para depois o 
conjugado se ligar aos anticorpos. Se houver uma ausência de banda em T é porque deu 
negativo. 
➢ DOT-ELISA/DOT-BLOT/IMMUNOBLOT: O Ministério da Saúde utiliza esses 
testes como sinônimos, antigamente os pesquisadores usavam Imunoblot como sinônimo 
de Western-blot. Há um pente com 3 dentes, nesses vai ter membrana de nitrocelulose 
onde vai estar aderido uma gota de anti-IgG de partículas de HIV1 e 2. Há também 
canaletas onde cada uma vai ter uma solução: poço A tem o diluente, poço B tem solução 
de lavagem, poço C tem o conjugado, poço D tem lavagem, substrato, cromógeno e 
lavagem de novo. Procedimento: fura os orifícios que vão ser utilizados e coloca o pente, 
no poço A colocamos por exemplo uma amostra de controle negativo, do lado o controle 
positivo e do lado o soro do paciente e então fica imergindo e emergindo o pente por 2 
minutos, depois retira o excesso em um papel e passa para solução de lavado, colocado o 
conjugado anti-IgG, deixa por mais 5 minutos, depois lava novamente, coloca no 
substrato+cromógeno, deixa por mais 2 minutos, lava de novo e por fim observa. Em um 
dente do pente vai ter o controle positivo, no outro o negativo e no outro o resultado para 
HIV1 ou HIV2. 
Há um teste mais sofisticado em que o indivíduo vai ter um pente com 2 dentes e em vez 
de ter todas as partículas de HIV juntas, neste vão estar separadas (controle, p24, p31, 
gp120, gp41 e gp36). Esse teste pode ser utilizado para confirmação. Cada cubeta vai 
receber a amostra duas vezes. Para ser positivo precisa reagir dois grupos gênicos, sendo 
um obrigatoriamente do envelope. 
➢ Teste do pezinho: é realizado entre 3-30 dias, sendo mais ideal entre 3º e 7º dia. 
Pesquisa IgM mas só serve para rastreio sorológico. É realizada uma punção e coletada 
amostras que vão ser eluidas e testadas para: toxoplasmose congênita, sífilis congênita, 
citomegalovirose congênita, doença de chagas congênita, rubéola congênita e HIV1/2 
congênito. Se der positivo para alguma dessas, o Recém Nascido é encaminhado para 
um protocolo mais específico.