Aula 5 (bloco 2)

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
Aula 5: 
Genoma e Tecnologias do DNA recombinante
*
Sequenciamento de Genomas :
Construção de uma série de mapas descritivos de cada cromossomo do organismo, determinando a sequência de nucleotídeos do DNA.
Metodologia:
1.Divisão dos cromossomos em fragmentos pequenos que possam ser propagados e caracterizados. 
2. Determinação da sequência de nuceotídeos (tecnologias de sequenciamento de DNA)
Tipos de sequenciamento:
 DNA genômico
 ESTs
3. Montagem do genoma (ordenar as sequências em suas respectivas posições nos cromossomos). 
4. Anotação do genoma (bioinformática)
Genoma: toda a informação genética de uma espécie
*
Problema do seqüenciamento
A tecnologia disponível hoje em dia seqüência, no máximo, 750pb por vez.
DNA precisa ser fragmentado em pequenos pedaços, seqüenciados separadamente e por fim, usa-se programas de computação que procura as seqüências sobrepostas entre os fragmentos.
*
*
		Amplificação de um Segmento de DNA:   
 O enorme tamanho e a imensa variabilidade da molécula do DNA são os principais obstáculos ao isolamento e sequenciamento de genes. Assim, técnicas especiais são necessárias para a seleção e amplificação de partes da molécula do DNA, gerando fragmentos menores e mais facilmente analisáveis. São duas as metodologias empregadas atualmente:
  
1. Reação em Cadeia da Polimerase - "Polimerase Chain Reaction", ou PCR. 
2. Clonagem de Genes
Tecnologia do DNA Recombinante
*
- São proteínas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. 
  
Reconhecem seqüências específicas de 4 a 8 pares de base (pb) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. 
O sítio de reconhecimento é normalmente uma seqüência palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta. 
- Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. 
Tecnologia do DNA Recombinante: Enzimas de restrição 
*
Tecnologia do DNA Recombinante: Enzimas de restrição 
*
Tecnologia do DNA Recombinante: vetores
PLASMÍDEOS:
Elementos genéticos extra cromossomais – pequenas moléculas de DNA dupla fita - contendo os elementos necessários para sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico
Para ser um bom vetor de clonagem, precisa ter:
1.Origem de replicação, ou seja, sequência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira
2. Múltiplos sítios de clonagem: apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para enzimas de restrição
3. Gene de resistência a um antibiótico: possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da não transformada
*
Tecnologia do DNA Recombinante: vetores
*
		A Criação do DNA Recombinante: 
 - Envolve a união de um fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-se uma endonuclease de restrição e a DNA ligase. 
A clivagem do DNA com a mesma enzima de restrição cria extremidades complementares adesivas que são unidas pela ação da DNA ligase 
Desta forma, um fragmento de DNA pode ser inserido em uma molécula maior, que passa a ser recombinante. 
Assim, um determinado gene do genoma humano pode ser inserido no genoma de uma bactéria, por exemplo, e lá ser amplificado ou mesmo transcrito várias vezes.
Tecnologia do DNA Recombinante: clonagem
*
Tecnologia do DNA Recombinante: clonagem
*
Tecnologia do DNA Recombinante: clonagem
*
*
*
Método de isolamento e amplificação de um segmento de DNA - envolve a produção "in vitro" de milhões de cópias do segmento em estudo 
- Foi desenvolvido por Kary Mullis (Cetus Corporation, Emeryville). Ele recebeu $20,000 de bonus e depois o Prêmio Nobel. Mais tarde, a patente foi vendida para Hoffman-LaRoche por $300,000,000 
Reação de PCR:
1. Pequenos "primers" de DNA que se ligam às extremidades 3' ends do DNA 
2. Os 4 nucleotídeos: A, C, G, T 
3. DNA polimerase especial (Taq polimerase): funciona em altas temperaturas; isolada de micoorganismos que vivem em fontes termais (Termus aquaticus )
Ocorre em 3 etapas:
A desnaturação da dupla fita do DNA, em alta temperatura
 (90oC )
2. O pareamento dos "primers", a baixa temperatura - 37o C 
3. A duplicação do segmento isolado através da reação da 
DNA polimerase 
O processo é cíclico e pode ser repetido "n" vezes, 
dependendo do grau de amplificação que se deseja 
Reação enCadeada da Polimerase (ou Reação da Polimerase em Cadeia)
PCR
*
Taq é uma enzima, que foi isolada pela primeira vez em 1971 de uma bactéria termófila (Thermus aquaticus) que vive nos geisers do Parque Nacional de Yellowstone!!!
Perfeita para resistir as variações de temperatura nas reações de PCR!!!
*
Reação enCadeada da Polimerase (ou Reação da Polimerase em Cadeia)
PCR
*
Reação enCadeada da Polimerase (ou Reação da Polimerase em Cadeia)
PCR
*
Reação enCadeada da Polimerase (ou Reação da Polimerase em Cadeia)
PCR
*
		Aplicações da Manipulação do DNA: 
  
 São enormes e promissoras as aplicações desta tecnologia: 
Na identificação e tratamento de doenças condicionadas geneticamente; 
No diagnóstico muito sensível de doenças infecciosas; 
No diagnóstico pré-natal; 
Na manipulação terapêutica de genes; 
Na criação de organismos híbridos e transgênicos na medicina, agricultura e pecuária; 
Na indústria farmacêutica; 
Em estudos evolutivos e de descendência; 
Na medicina legal, etc.