Biotecnologia e PCR

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CONCEPÇÃO II - Genética 1º AF (P2–B) Mª Diva C. Alves 
Biotecnologia 
CONCEITO 
o Conjunto de técnicas que envolvem a 
manipulação de organismos vivos para a 
obtenção de produtos específicos ou 
modificação de produtos; 
o A biotecnologia também utiliza o DNA em 
técnicas de DNA recombinante; 
o Engenharia genética: técnicas modernas em 
biologia molecular que vêm revolucionando o 
antigo processo de biotecnologia. 
 
ENGENHARIA GENÉTICA 
o Aplicação na saúde - benefícios: 
 Medicina preventiva (escolha do embrião); 
 Terapia celular e geneterapia (correção de 
genes defeituosos); 
 Produção de antibióticos (produzido pelas 
próprias bactérias e fungos), hormônios 
(criação da insulina) e outros produtos 
farmacêuticos; 
 Reprodução assistida (fecundação in vitro); 
 
GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
TÉCNICAS 
o Manipulação de DNA; 
o Enzima de restrição; 
o PCR e suas especializações; 
o Clonagem – plasmídios e vetores; 
o Eletroforese; 
o Sequenciamento de DNA; 
o Biblioteca de DNA genômico e cDNA; 
 
MANIPULAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 
o Extração de DNA; 
o É o primeiro passo de muitas aplicações 
biotecnológicas: 
 PCR 
 Clonagem 
 Transferência de genes 
 Tipagem molecular 
 Marcadores moleculares (sequência de 
DNA que revelam as predisposições que o 
indivíduo tende a ter) 
 Sequenciamento 
 
 
“Não é o gene que causa a predisposição, o que 
causa é a mutação dele”. 
 
 
Etapas para um diagnóstico molecular: 
 Coleta do material biológico; 
 Extração do DNA ou RNA; 
 Amplificação; 
 Análise dos resultados; 
 
Coleta: 
 Sangue total; 
 Líquido amniótico; 
 Soro; 
 Plasma; 
 Urina; 
 Tecidos parafinados; 
 Raspados bucais, cervicais e uretrais; 
 
o É preciso preservar o vírus (não 
necessariamente ativo, mas conservado) em 
solução tampão – pH 8; 
o Separa-se o DNA de todas as outras 
moléculas: 
 Soluções desnaturantes de proteínas e 
lipídios (rompe as membranas e deixa tudo 
bagunçado/misturado); 
 
 Extração de DNA com fenol; 
 
 
o Após isso, o DNA vai estar misturado com 
água, então é adiciona sal (para quebrar a 
ligação) e etanol gelado (para mantê-lo 
unido por causa da temperatura); 
 
 
Equipamentos: 
 
 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Extração de DNA e RNA: 
o Consiste em obter DNA/RNA de alta 
qualidade em quantidade, de forma rápida e 
eficiente; 
o Separar os ácidos nucléicos de todos os outros 
componentes indesejáveis; 
o Manter a integridade das sequências é 
fundamental; 
o Métodos podem variar de acordo com: 
 Vírus 
 Bactérias, fungos 
 Célula vegetal/animal 
 
MÉTODOS 
o DNA e RNA em eucariotos envolvidos por 
membrana (núcleo e mitocôndrias); 
o Nos procariotos o DNA é desprovido de 
membranas; 
o Presença de parede celular pode dificultar a 
extração; 
 
ETAPAS 
o Lise física ou bioquímica das paredes celulares 
e membranas; 
o Purificação dos ácidos nucléicos: 
desnaturação/inativação de proteínas 
celulares; 
o Precipitação; 
 
Rompendo membranas e paredes celulares: 
o Lise das células: liberação dos componentes 
citoplasmáticos e/ou nucleares; 
o Estratégia: de acordo com o tipo de célula 
envolvida (deve ser o mais gentil possível); 
EXTRAÇÃO DE DNA/RNA COM KITS COMERCIAIS 
Vantagens: 
o Reprodutividade; 
o Qualidade; 
o Tempo reduzido; 
 
Desvantagens: 
o Alto custo; 
 
QUANTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO 
o Medir a quantidade e qualidade do DNA/RNA 
extraído; 
o Existem duas formas: 
 Espectrofotômetro 
 Eletroforese (gel de agarose): aplicando-se 
as amostras de DNA juntamente com 
padrões de concentração conhecida. 
o Desvantagens: interferência com material 
para extração, inabilidade de diferenciar 
entre DNA e RNA; 
 
Cuidados: 
o Autoclavagem de materiais e tampões; 
o Armazenamento de DNA e RNA: 
 DNA: 4° ou -20° (maior tempo) 
 RNA: -70° e manter sempre no gelo quando 
manipulado; 
 
Análise de resultados (PCR) 
o Eletroforese 
o Sequenciamento 
o Bioinformática 
 
ELETROFORESE 
É um processo que consiste na separação dos 
componentes de um sistema através da 
aplicação de um campo elétrico; 
o Usado para separar e analisar biomoléculas: 
 Ácidos nucléicos (DNA e RNA) 
 Proteínas 
 Enzimas 
o As moléculas são separadas umas das outras 
conforme o tamanho, a carga elétrica e a 
forma; 
o Separam-se partículas de mesma carga, 
porém com quantidades diferentes de carga; 
o Tipos: 
 Agarose 
 Acrilamida 
 
ETAPAS 
o Preparar a amostra (DNA total, produtos de 
PCR, proteínas, etc...); 
o Preparar o gel; 
o Aplicar as amostras no gel; 
o Eletroforese; 
o Coloração do gel, fixação, documentação; 
 
PRINCÍPIO 
Ácido nucléico exposto a campo elétrico migra 
para eletrodo na velocidade ou mobilidade 
proporcional a força do campo e a carga líquida 
da molécula. 
 Mobilidade: inversamente proporcional ao 
coeficiente friccional. 
 Coeficiente friccional: função do tamanho e 
forma da molécula e viscosidade do meio. 
 
o Moléculas grandes migram lentamente, 
enquanto moléculas pequenas movem-se 
rapidamente; 
o A concentração do gel definirá o tamanho 
dos poros a serem atravessados pelas 
moléculas de migração; 
o Geis muito concentrados oferecerão maior 
resistência à migração das moléculas; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR 
CONCEITO 
Reação de polimerização em cadeia é a técnica 
que permite a amplificação do DNA in vitro, 
utilizando-se basicamente de uma reação 
enzimática catalisada pela polimerase (enzima 
termoestável) cuja atividade depende dos íons 
Mg++. 
o Diagnóstico mais preciso de doenças, afasta a 
medicina de focar apenas em sintomatologia; 
o Método rápido, eficiente e com alta 
especificidade e reprodutibilidade; 
o Qualquer sequência alvo de DNA pode ser 
amplificada por PCR; 
 
HISTÓRICO 
o Inventada em 1985 por Kary B. Mullis; 
o Sugeriu a utilização da DNA polimerase 
“termoestável”; 
o Ganhou o Nobel de química em 1993; 
o Mullis inovou: conseguiu com especificidade 
na cópia de apena segmentos específicos, 
introduzindo o conceito de primer de PCR, e 
na utilização de uma DNA polimerase 
termoestável; 
 
 
EM QUE CONSISTE A PCR? 
o Técnicas de amplificação de fragmentos 
específicos de DNA a partir de uma pequena 
porção; 
o Á medida que o processo progride, o DNA 
gerado é usado como base para nova 
replicação; 
o A replicação é feita em ciclos (cada ciclo 
origina duas novas cadeias de DNA); 
o Dá-se início a uma reação em cadeia em que 
o DNA é ampliado exponencialmente; 
 
 
 
 
“Esse processo precisa de várias enzimas, porém 
cada uma precisa ter sua respectiva temperatura 
e pH, o que é um grande problema”. 
 
 
COMO SUBSTITUIR AS ENZIMAS? 
Helicase: separa a fita dupla de DNA. 
 Substituída pelo calor, pois as pontes de 
hidrogênio são ligações fracas, precisam de 
pouca energia para serem rompidas. 
 
Girase/Topoisomerase: estabiliza o lado oposto 
do DNA que está sendo aberto. 
 Como o DNA será completamente aberto por 
causa do calor, não é necessária essa enzima. 
 
Ligase: liga os fragmentos de Okazaki. 
 Não será necessária porque o DNA será 
replicado de uma ponta a outra, não irá existir 
uma fita contínua e uma descontínua, pois as 
duas serão sintetizadas de uma forma 
contínua. 
 
Primase: forma os primers. 
 As empresas podem fazer esses fragmentos, 
não é necessária uma enzima pra isso. 
 
CARACTERÍTICAS: 
o É muito rápido (identificação de um agente 
patogênico em 20 minutos); 
o Eficiente com alta especificidade (não existe 
reação cruzada na PCR); 
o Reprodutível (caso a técnica seja repetida 10x, 
o resultado será sempre o mesmo); 
o Segura; 
o Pode ser feita por qualquer pessoa; 
 
“Qualquer sequência alvo de DNA pode ser 
exemplificada por PCR”. 
 
PRÍNCIPIOS DA PCR 
Ocorre em três etapas: 
Melting: desnaturação, consiste na separação da 
dupla fita do DNA a ser amplificado. 
 DNA fita simples continuaíntegro por causa de 
suas ligações covalentes. 
Annealing: anelamento ou hibridização, ligação 
do iniciador ou “primer” ao DNA a ser 
amplificado. 
Extesion: extensão, ou seja, a polimerização 
propriamente dita. 
 
Alternância de temperaturas a cada ciclo: 
 
“Quanto menos aquecer, melhor, pois depois de 
um tempo começa a se degradar”. 
 
Desnaturação (94° a 96°) 
 Separa a fita dupla do DNA molde em duas 
fitas simples. 
 
Anelamento (37° a 65°) 
 Primers se ligam aos sítios específicos na fita 
simples. 
 
Extensão (72°) 
 DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, de 
acordo com o pareamento de bases. 
 
AUTOMAÇÃO DA PCR 
 
o Um aparelho de PCR, ou um termociclador, 
repete o correspondente ao programa de 
temperaturas; 
o Muitas mudanças têm sido introduzidas 
melhorando cada vez mais e ampliando a sua 
utilização; 
 
Reagentes necessários: 
 DNA polimerase termoestável 
 Par de primers 
 Cloreto de magnésio (MgCl2) 
 dNTPs 
 Tampão 
 DNA molde 
 
PRIMERS 
o É um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 
bases, geralmente baseado na sequência já 
conhecida do ácido nucléico, sintetizado 
quimicamente por instrumentos automáticos; 
o Fornecem grupos OH para o início da síntese; 
o Definem os limites do DNA a ser amplificado; 
o Estabelecem especificidade; 
 
TAMPÃO 
o Mantém o pH ótimo para a atividade da 
enzima; 
 
MAGNÉSIO 
o Íons de Mg são necessários para estimular a 
Taq polimerase; 
 
dNTPs 
o Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima 
propriamente dita para a síntese das fitas-
filhas. São compostos por nucleotídeos (dATP, 
dTTP, dCTP, dGTP). 
 
CINÉTICA DA PCR 
Fase de screening (ciclos iniciais) 
o Os primers procuram o molde de DNA com as 
sequências que lhes são complementares. 
 
Fase intermediária 
o O processo de amplificação está ocorrendo 
levando ao acúmulo exponencial dos 
fragmentos de DNA. 
 
Fase tardia ou fase de platô 
o A amplificação já é sub-ótima devido à 
limitação dos reagentes. 
 
 
VANTAGENS E DESVANTAGENS DA PCR 
Vantagens 
o Muito sensível, podendo amplificar uma única 
molécula de DNA/RNA; 
o Grande quantidade de DNA em pouco 
tempo; 
o Baixo custo; 
o A amostra de DNA não necessita estar 
altamente purificada; 
o O produto do PCR pode ser digerido com 
enzimas de restrição, sequenciado ou 
clonado. 
 
Desvantagens 
o Requer técnicas específicas para conduzir o 
teste e avaliar o resultado; 
 
VARIAÇÕES DA PCR 
Nested PCR 
o Duas amplificações, inicialmente um 
fragmento maior e depois um menor; 
o Aumentar a quantidade de produto final; 
o Aumentar a sensibilidade da técnica; 
 
RT-PCR 
o Não parte diretamente do molde de DNA da 
amostra; 
o Fornece a RNA que é convertido em DNA 
completamente; 
Ex. Ferrementa útil em estudos de HIV. 
 
Clonagem 
o Isolamento do gene a ser clonado; 
o Amplificação do gene por PCR; 
o Inserção dos genes em plasmídeos; 
o Introdução do plasmídeo no organismo e 
expressão do gene; 
 
PCR em tempo real/qPCR 
o Metodologia de PCR + Sistema de detecção 
de sinais fluorescentes; 
o Detecção, quantidade e amplificação de 
DNA em uma única etapa; 
o Agilidade na obtenção de resultado; 
o Técnica quantitativa; 
 Quantificação do número de moléculas 
produzidas a cada ciclo 
 
A quantidade de DNA final segue uma função 
exponencial, onde: 
 
Portanto, a concentração final do DNA molde na 
solução é muito maior do que a inicial, 
possibilitando a sua identificação. 
 
VANTAGENS EM RELAÇÃO À PCR CONVENCIONAL 
o Sem manipulação pós-PCR; 
o Resultados quantitativos; 
o Requer concentrações de DNA menores; 
o Tempo de reação reduzido; 
o Maior reprodutibilidade, sensibilidade e 
precisão;