5 amostras utilizadas em análises toxicológicas

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Coleta de amostras
A coleta de amostras se encontra na fase pré-analítica. A
confiança em um resultado analítico final depende da
correta e adequada realização dos procedimentos desde esta
fase. Portanto, é importante para manter a qualidade das
amostras e consequente qualidade na fase Analítica.
Escolha da amostra⇾ coleta⇾ transporte⇾
conservação
A escolha da amostra depende da finalidade da análise,
da natureza química, forma e concentração do analito.
As amostras utilizadas podem ser biológicas ou não
biológicas.
➔ Biológicas: sangue, urina, saliva, cabelo;
◆ oriundas de pacientes e/ou de cadáveres.
➔ Não-biológicas: produtos de limpeza, substâncias
psicotrópicas (análise forenses), alimentos, ar
atmosférico, água (rios- contaminação);
Um fator que influencia na escolha da amostra é a janela
de detecção, o período no qual é possível detectar o
consumo de drogas.
---------------------------------------Urina---------------------------------------
➔ Consiste em um ultrafiltração do sangue formado
continuamente pelos rins;
➔ Composição: substâncias orgânicas (ureia, ácido úrico,
creatinina) e inorgânicas (íons cloreto e sódio)
dissolvidas em água;
➔ Principal via de eliminação de xenobióticos ⇾ matriz
biológica de escolha tradicional em análises
toxicológicas.
◆ são principalmente analisados os metabólitos,
tendo em vista que precisa passar pela
biotransformação para ser eliminada.
➔ Vantagens:
◆ coleta fácil e não invasiva.
◆ grandes volumes disponíveis para análise.
◆ menor número de interferentes quando
comparado com o sangue, por exemplo.
◆ estabilidade por longos períodos (20ºC).
◆ janela de detecção maior que o sangue.
➔ Desvantagens:
◆ amostra de fácil adulteração (coleta não vigiada)
◆ quantidade de líquido ingerido pelo indivíduo e
perda de líquidos podem alterar o resultado
(diluição do toxicante).
◆ exposição recente (2 a 5 dias).
◆ não permite identificar com exatidão o tempo
decorrido da exposição.
➔ Coleta post-mortem: punção, aspiração da bexiga ou
lavado vesical, quando se tem ausência de urina;
◆ às vezes pode ocorrer de não ter urina na bexiga,
sendo assim, é realizada uma lavagem com algum
tampão salino (lavado vesical) para tentar
encontrar resquícios dos intoxicantes absorvidos
na bexiga.
-------------------------------------Sangue-------------------------------------
➔ É um tecido conjuntivo líquido que circula o sistema
vascular em animais com sistema circulatório fechado,
formado por uma porção celular (elementos figurados
do sangue) que circula em suspensão em um meio
fluido (o plasma);
◆ plasma: onde o toxicante é encontrado.
➔ Podem ser usados na análise toxicológica:
◆ sangue total: é coletado com a presença de
anticoagulante.
◆ plasma: parte líquida do sangue, coletado com
anticoagulante, o qual, quando centrifugado,
obtém-se uma parte dos componentes separados.
◆ soro: parte líquida do sangue sem anticoagulante,
consequentemente sem fibrinogênio (utilizado
para formar o coágulo) e fatores da coagulação.
Sangue sem anticoagulante⇾ consumo do fibrinogênio
⇾ ativação da cascata de coagulação⇾ coagulação do
sangue
O soro é preferível, por correr menos risco de sofrer
interferência pelos anticoagulantes, porém não é tão
estável. Portanto, para análises toxicológicas no sangue, o
que se usa mais é o sangue total ou plasma, havendo a
necessidade de se usar anticoagulantes.
No entanto, deve ter atenção ao tipo de anticoagulante
usado, pois alguns podem inferir no resultado final, por
interagir com o toxicante.
➔ Anticoagulantes:
◆ Fluoreto de sódio: proteção contra produtos
bacterianos e auxílio no retardo da degradação de
substâncias quimicamente lábeis; ação
conservante; Muito utilizado para realizar
glicemia.
◆ EDTA: pode quelar alguns toxicantes; além de
quelar cálcio (que é um coagulante), pode quelar
outras substâncias como metais pesados,
interferindo numa análise de intoxicação por esta
substância, resultando num falso negativo; muito
utilizado para realizar hemograma, pois é o que
menos interfere na morfologia celular;
◆ Heparina: pode interagir com alguns fármacos.
➔ Vantagens:
◆ fornece correlação da concentração do toxicante
no sangue com o estado clínico do indivíduo.
◆ é mais utilizado em situações de emergência e
prognóstico monitramento terapêutico).
◆ eventualmente, é possível predizer o tempo de
exposição ao toxicante.
➔ Desvantagens:
◆ obtenção através de um método invasivo;
◆ risco de contaminação;
◆ janela de detecção restrita;
◆ principalmente para drogas de rápida
metabolização;
◆ presença de muitos interferentes (pois possui uma
matriz biológica muito complexa);
◆ método tem que ser muito específico ou tem que
haver remoção desses interferentes através de
uma extração;
➔ Tanatologia: fenômeno da redistribuição do sangue;
◆ no cadáver, devido ao fenômeno de redistribuição,
recomenda-se a coleta do sangue oriundo de
origens diferentes, para que seja feita uma
comparação dos analitos e saber a proporção do
fenômeno de distribuição.
◆ o sangue periférico sofre menos efeitos do
fenômeno, há uma menor difusão do sangue de
outras regiões, então a sua constituição é
semelhante à de quando o indivíduo estava vivo;
normalmente é feito na veia femoral, porém é
uma coleta de difícil execução, devido à
coagulação do sangue e colabamento das veias.
◆ a coleta diretamente do coração é arriscada, pois
corre o risco de haver contaminação com células e
fluidos cardíacos e pulmonares.
◆ considerações para a coleta de sangue
post-mortem: o ideal é coletar o sangue em mais
de um local e registrar essa informação, deve-se
observar a produção de etanol endógeno por
microorganismos em cadáveres em avançado
estado de putrefação, possibilidade de
biotransformação post-mortem de xenobióticos
por microorganismos em estados avançados de
putrefação.
--------------------------------------Cabelo--------------------------------------
➔ Matriz biológica complexa composta de 65-95% de
queratina, 15-35% de água, 1,9% de lipídios e pequena
quantidade de minerais;
➔ Possibilidade de determinação da exposição pregressa
(à muito tempo) às drogas;
◆ grande janela de detecção.
➔ Mecanismo de deposição de drogas:
◆ incorporação através de difusão do sangue para o
folículo capilar.
● o bulbo é vascularizado e permite essa
passagem do toxicante.
◆ incorporação através do suor e secreções
provenientes das glândulas sudoríparas
adjacentes.
◆ depósito de substâncias externas na fibra capilar.
● deposição segue sentido do crescimento do
cabelo (0,6 a 1,42cm/mês).
◆ na matriz que dará origem ao fio, o fio vai
crescendo e o toxicante permanece impregnado
juntamente ao fio por bastante tempo.
◆ a partir do crescimento do cabelo dá para obter
uma estimativa de quando foi realizado o uso ou
se o uso é frequente (contínuo).
● coleta de 100 mg de cabelo rente ao couro
cabeludo.
➔ Vantagens:
◆ ampla janela de detecção (dias, meses, anos);
◆ coleta fácil e não invasiva;
◆ fácil transporte e armazenamento;
◆ alta estabilidade;
◆ difícil adulteração;
➔ Desvantagens:
◆ não permite visualizar exposição recente.
◆ dificuldade em indivíduos com cabelo de curto
comprimento.
◆ pode sofrer influência de tratamentos cosméticos.
◆ necessidade de métodos analíticos de elevada
sensibilidade.
----------------------------------Fluido oral-----------------------------------
➔ Mistura de células da mucosa bucal, restos de
alimentos e saliva, secretada pelas glândulas presentes
na mucosa bucal;
➔ As drogas podem ser detectadas nesta matriz na forma
não metabolizada;
➔ Principal aplicação: monitoramento de condutores de
trânsito e toxicologia ocupacional;
➔ Exposições recentes (2 dias);
➔ Possibilidade de contaminação por drogas utilizadas
por via oral e não é uma amostra muito limpa até
mesmo pela alimentação;
---------------------------------Humor vítreo---------------------------------
➔ Matriz de grande interesse na análise post-mortem;
➔ Trata se do líquido gelatinoso contido naparte
posterior do olho, constituído basicamente por água
(99%) sais e pequena quantidade de proteína (0,2%);
➔ Ausência de esterases (ausência de degradação de
substâncias como cocaína, heroína e morfina);
◆ nem todo o toxicante chegar até essa região
➔ Drogas chegam pela passagem pela barreira
sangue/retina, por meio de transporte ativo e passivo;
➔ Predominância da droga original em relação aos
metabólitos;
➔ Coleta: punção na lateral do olho;
➔ Uma desvantagem desse método é o pequeno volume,
que limita um pouco as análises;
-----------------------------Preparo da amostra-----------------------------
Processo que visa isolar o analito de interesse a partir da
matriz, minimizando e eliminando os interferentes, além
de propiciar a concentração da substância, sendo um
processo geralmente indispensável para o emprego de
técnicas de detecção e quantificação de substâncias.
Propicia a concentração da substância para se chegar a
sensibilidade ideal para o método escolhido.
Processo de extração ideal
➔ Perda mínima de amostra;
➔ Remoção eficaz dos interferentes;
➔ Mas é comum não removê-los totalmente;
➔ Alta recuperação do analito;
➔ O quanto daquele analito que irá sobrar depois do
processo de extração;
➔ Baixo tempo de análise;
➔ Baixo custo;
-------------------Tratamento prévio das amostras-------------------
○ Remoção das proteínas
➔ Usada em amostras ricas em proteínas (plasma e
tecidos- post mortem), nas quais esses compostos
possam servir como interferentes;
➔ Útil para liberar toxicantes ligados a proteínas;
➔ Realizado por meio de precipitação de proteínas:
solventes orgânicos, sais, precipitação isoelétrica;
Precipitação isoelétrica
➔ Uso de ácidos ou bases para se chegar ao ponto
isoelétrico das proteínas, ponto onde a solubilidade
delas é mínima;
◆ ponto isoelétrico de proteínas: pH onde a carga
líquida da molécula vai ser nula em relação aos
grupamentos amino e ácido carboxílico;
➔ Em pH elevado (básico): o grupamento ácido
carboxílico vai estar carregado negativamente (ácido
em meio básico se dissocia). Já o grupamento amino
(base em meio alcalino, ficará desprotonada) ficará em
sua forma não ionizada, sem carga;
◆ pH maior que o PI = forma aniônica.
◆ haverá proteínas carregadas positivamente.
◆ cargas iguais das proteínas irão se repelir,
havendo maior solubilidade pois elas ficarão
distantes umas das outras e o solvente irá
conseguir adentrar facilmente.
➔ Em pH baixo (ácido): o ácido carboxílico vai estar em
sua forma protonada (ácido em meio ácido não se
dissocia) e grupamento amino (base) fica protonada
positiva;
◆ PH menor que o PI = forma catiônica.
◆ Cargas positivas vão se repelir, o que favorece
também o aumento da solubilidade.
➔ Mas se o pH é igual ao PI haverá cargas distintas, e as
proteínas irão se agregar e se precipitam. Assim, para
haver esse processo, na minha amostra eu adiciono
uma base ou um ácido, depende do PH da amostra,
para levar todas as proteínas ao ponto isoelétrico, se
precipitando e o sobrenadante sobrando.
◆ carga líquida = 0: pH suficiente onde o
grupamento amino (+) esteja protonado e o ácido
desprotonado (-).
Salting out
➔ Precipitação induzida por sais: diminuição da
solubilidade das proteínas com adição de grandes
quantidades de sal;
◆ geralmente utiliza-se bastante o sulfato de
amônio.
◆ a adição de pequenas quantidades de sal promove
o fenômeno denominado salting in, ou seja, ajuda
as proteínas a separarem-se uma das outras, uma
vez que as envolvem, logo há um aumento na
solubilidade; elas não irão se agregar nem
precipitar.
➔ O sal compete com as proteínas por moléculas de água
que, por sua vez, tem maior capacidade de solvatação
para partículas menores (os íons);
◆ com isso, há tantos íons solvatados (sal
solubilizado) que resta pouca água para dissolver
as proteínas, que acabam por se agregarem e
precipitarem.
◆ precipitação e sal (diálise para remover o sal do
solvente).
Precipitação com solventes
➔ Diminuição da constante dielétrica (solubilidade) da
solução formada com a adição do solvente orgânico
(acetona, metanol…), o que acarreta na diminuição da
solubilidade das proteínas, fazendo com que as
proteínas se precipitem;
➔ Constante dielétrica: Está relacionada com a
polaridade do solvente;
◆ grandeza que mede a capacidade de um solvente
se colocar entre moléculas de soluto e separá-las,
solvatando-as.
◆ a água é considerada como um meio com alta
constante dielétrica, por isso é um solvente
universal.
◆ como o solvente diminui essa constante, ele vai
fazer os analitos se juntarem e, portanto,
precipitarem.
Hidrólise de conjugados
➔ A maioria dos xenobióticos sofrem reações de fase II
(reações de conjugação) para serem eliminados pela
urina em muitos casos, é necessário remover o
conjugado para fazer a análise dos compostos
excretados na urina em sua forma original;
◆ isso pode ser feito com hidrólise ácida ou
enzimática.
Extração líquido-líquido
➔ Separação da amostra entre duas fases imiscíveis:
aquosa (polar) e orgânica (apolar);
◆ quanto maior a lipossolubilidade, maior a
afinidade pela fase orgânica.
◆ os compostos de maior densidade ficam na parte
de baixo do tubo (ex.: clorofórmio- fase orgânica)
e de menor densidade ficam em cima (ex.: urina-
fase aquosa).
◆ numa situação em que a fase orgânica é o
clorofórmio acidificado, são extraídos compostos
ácidos (mais lipossolúveis).
◆ numa situação em que a fase orgânica é o
clorofórmio alcalinizado, o toxicante básico seria
extraído, pois seria o que iria migrar para esta
fase.
➔ Eficiência da extração: afinidade do agente tóxico pelo
solvente de extração;
➔ A maioria dos toxicantes são ácidos ou bases fracas,
podendo estar presentes em solução sob as formas
ionizadas ou não-ionizadas ⇾ pode ser feita
modificação do pH da amostra para facilitar a extração;
◆ ácido fraco em meio ácido fica na forma não
ionizada, de maior lipossolubilidade.
◆ base fraca em meio ácido fica na forma ionizada,
de menor lipossolubilidade, então para extrair um
toxicante de natureza básica, deve-se alcalinizar o
meio, de modo que tenha mais lipossolubilidade e
uma quantidade maior possa ser extraída.
◆ os métodos de extração baseiam-se na basicidade
ou na acidez do composto a ser extraído.
➔ Vantagens:
◆ técnica simples.
◆ pode-se utilizar grande número de solventes
(ampla faixa de solubilidade e seletividade).
◆ geralmente é feito para extração de compostos da
urina, que geralmente pode-se conseguir um
volume maior.
➔ Desvantagens:
◆ necessidade de grandes volumes de amostra e
solvente.
◆ problemas de descarte e toxicidade de alguns
solventes orgânicos (poluição/ contaminação).
◆ pode ocorrer formação de emulsão (evitar
agitação vigorosa para que não haja perda do
toxicante).
Extração em fase sólida (SPE)
➔ Técnica cromatográfica em que uma fase sólida
extratora retém substâncias com afinidade química e os
interferentes são eliminados através de lavagens com
solventes orgânicos;
◆ existem diversos tipos de fases fixas, utilizadas de
acordo com a afinidade do composto.
◆ um segundo solvente, com mais afinidade pelo
composto do que a fase fixa, é utilizado na fase de
eluição para extrair o composto.
◆ é um dispositivo descartável, pois há chance de
restarem resíduos após a eluição.
➔ Vantagens:
◆ uso de pequeno volume de solventes.
◆ pouco manuseio da amostra.
◆ não forma emulsão.
◆ facilidade na automação.
➔ Desvantagens:
◆ maior custo por amostra.
Extração por headspace
➔ Técnica para a extração de toxicantes voláteis;
➔ A amostra é inserida em recipiente hermeticamente
fechado e termostatizado, por determinado tempo de
incubação, permitindo adequado equilíbrio dinâmico
entre as fases líquida e gasosa da amostra (fase
headspace);
➔ A fase gasosa é recolhida e analisada por cromatografia
gasosa;
➔ Vantagem:
◆ permite remoção de interferentes (proteínas e
lipídeos) sem necessidade de solvente orgânico.
➔ Desvantagem:
◆ só pode ser realizada para a extração de
toxicantes voláteis.