ok metabolomica_denv_chikv2016 Traduzido

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Análise metabolômica do soro de pacientes com chikungunya e dengue mono / coinfecções revela assinaturas metabólicas distintas nas três diferentes condições de infecção
Tradução: Camila Amato Montalbano
Scientific Reports | 6:36833 | DOI: 10.1038/srep36833
www.nature.com/scientificreports/
received: 19 July 2016
accepted: 17 October 2016
Published: 15 November 2016
Jatin Shrinet, Jayanthi S. Shastri, Rajni Gaind, Neel Sarovar Bhavesh2 & Sujatha Sunil
Resumo. Chikungunya e dengue são infecções arbovirais com sintomas clínicos sobrepostos. Uma condição diversa da infecção por chikungunya pode ocorrer como coinfecções com dengue, resultando em complicações durante diagnóstico e manejo do paciente. O presente estudo foi realizado para identificar o metaboloma global de soros de pacientes monoinfectados com chikungunya e coinfectados com dengue. Utilizou-se espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), para verificar o metaboloma de soro das três condições de doença, ou seja, chikungunya e dengue como monoinfecções e a co-infecção de ambos, sendo então comparados com indivíduos saudáveis. Além disso, as coortes foram analisadas com base na idade, aparecimento de febre e envolvimento articular. Aqui, mostramos que muitos metabólitos no soro são significativamente regulados de forma diferente durante a monoinfecção por chikungunya, bem como durante a coinfecção com dengue. Observamos que glicina, serina, treonina, galactose e pirimidina são os metabólitos cujas vias encontram-se mais perturbadas em condições de mono e coinfecção. As vias afetadas em nosso estudo se correlacionam bem com as manifestações clínicas, como febre, inflamação, prostração e dores nas articulações durante as infecções. Esses resultados podem servir como um ponto de partida para validações e identificação de biomoléculas distintas que podem ser exploradas como candidatos a biomarcadores, ajudando assim no melhor manejo do paciente.
Introdução 
Dengue (DEN) e chikungunya (CHIK) estão entre os arbovirus mais importantes, afetando juntas cerca de 40 milhões de pessoas globalmente1–3. A dengue é uma doença viral sistêmica aguda que se disseminou globalmente em ciclos de transmissão endêmicos e epidêmicos4. Com mais de um terço da população mundial vivendo em áreas de risco desta infecção, o vírus da dengue é uma das principais causas de adoecimento e morte nos trópicos e subtrópicos5. O mapa de distribuição global da dengue estimou e previu que a Índia seria a mais afetada6. Cerca de 34% do total das infecções globais por dengue vêm da Índia, tornando-a um centro de transmissão7. O vírus Chikungunya (CHIKV) representa uma séria ameaça à saúde pública10, conhecido por gerar infecções únicas ou coinfecções com dengue8,9, propagando-se por diversas regiões do planeta11. No subcontinente indiano, enquanto cerca de 1,2 milhões de indivíduos foram afetados pelo CHIK em 200612, as tendências recentes mostraram que sua disseminação está diminuindo, embora os números ainda sejam grandes13.
Um dos principais desafios que os médicos enfrentam durante o diagnóstico de CHIK e DEN são os sintomas sobrepostos dessas duas infecções, resultando em diagnósticos incorretos, muitas vezes graves e manejo inadequado do paciente14. Estudos recentes têm mostraram que quase dez por cento dos casos suspeitos de dengue estão, na verdade, co-infectados com o vírus chikungunya, tornando-se difícil distinguir a diferença entre as duas infecções para um melhor manejo clínico do paciente15. Adicionalmente, o diagnóstico incorreto também obstrui a verdadeira incidência de chikungunya dentro de uma região, fornecendo assim informações incorretas de epidemiologia da doença e evolução do vírus. Existem marcadores associados à monoinfecção disponíveis para chikungunya e dengue e foram estudados para acompanhar a progressão de chikungunya da fase aguda para a fase crônica16, e a progressão da dengue desde a froma não complicada para as mais grave condições17,18. No entanto, poucos estudos foram dedicados a compreender as características de diferenciação subjacentes entre essas duas infecções15,19.
A metabolômica analisa quantitativamente a regulação diferencial de metabólitos quando o sistema vivo é perturbado com condição de doença ou uma mudança no estilo de vida. Nos últimos tempos, o perfil metabólico de biofluidos forneceu informações sobre o prognóstico de doenças e para desenvolver biomarcadores diagnósticos20-22. Entre as várias ferramentas utilizadas para metabolômica, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) surgiu como uma ferramenta útil e método poderoso devido à sua não invasividade, rapidez, reprodutibilidade, necessidade de pequenos volumes de amostra e alta precisão no perfil metabólico23,24. Abordagem metabolômica baseada em NMR tem sido usada para entender a desregulação metabólica em humanos após infecções virais como hepatite25–27 e HIV28,29.
O presente estudo foi realizado para identificar o metaboloma global de soros de pacientes infectados com chikungunya, sejam eles monoinfectados ou co-infectados com dengue. Metaboloma de soros coletados de indivíduos saudáveis e de pacientes monoinfectados com dengue foram avaliados e usados ​​para comparar com o metaboloma mono / co-infectado de chikungunya. As coortes foram estratificadas com base na idade e data de início da febre. Metabólitos séricos de pacientes com Chikungunya e suas vias foram analisadas para correlacionar com a fase crônica da infecção. Assinaturas únicas de metabólitos foram identificadas para monoinfecções por chikungunya e coinfecções com dengue.
Materiais e métodos
Autorização ética. As amostras de soro foram obtidas a partir de uma coorte de amostras que cujos indivíduos foram recrutados para fazer parte de dois estudos longitudinais multicêntricos, um estudo sobre a divergência de chikungunya na Índia e o outro, sobre avaliação
o de coinfecções por chikungunya e dengue. Indivíduos com mais de 12 anos foram recrutados para o estudo e lhes foi solicitado consentimento por escrito com base nas informações do folheto de informações dado previamente ao paciente. No caso de participantes menores de 18 anos, o consentimento foi obtido dos pais / responsáveis. Os estudos foram aprovados pelo Comitê de revisão ética institucional dos três institutos participantes: Vardhman Mahavir Medical Hospital College-Safdarjung, Nova Delhi (VMMC / SJH / 2013/13, IEC / VMMC / SJH / 2014/575), BYL hospital Nair, Mumbai (No: 153) e ICGEB (ICGEB / IEC / 2010/01, ICGEB / IEC / 2014/01). Todos os métodos seguidos no estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.
Amostras clínicas. Os pacientes foram recrutados como parte de um estudo em andamento referente a chikungunya e divergência da dengue e outro da situação de coinfecção na Índia. Dois hospitais: VMMC e Safdarjung Hospital, Nova Delhi e o hospital BYL Nair, em Mumbai, fizeram parte deste estudo. Ambos os hospitais são centros de cuidados terciários e importantes centros de referência para doenças infecciosas. Indivíduos acima de 12 anos de idade que se apresentam com sintomas semelhantes aos da dengue, incluindo febre ou história de febre nos últimos sete dias, dor de cabeça, náuseas, vômitos, dor nas articulações, articulações inchadas, dores e incômodos, erupções cutâneas, dor nos olhos ou manifestações hemorrágicas foram inscritos neste estudo. No momento da inscrição, o formulário de registro de caso (CRF) de cada paciente foi preenchido juntamente com índice de atividade da doença (CDAI) e sua atividade de viagem recente. O sangue total foi coletado em tubo sem aditivo e Tubos de coleta de sangue contendo EDTA e imediatamente processados ​​para soro / plasma. Amostras de soro e plasma foram armazenados a -80 ° C até uso posterior. As amostras foram avaliadas tanto sorologicamente quanto por RT-PCR quanto à presença de CHIK e DEN. As amostras de soro foram testadas para CHIK / DEN IgM e DEN NS1 usando kits fornecidos por NIV, Pune. Além disso, o ácido nucleico foi extraído do soro e processado paraverificar as cópias do RNA em todas as amostras inscritas. Após testadas, as amostras positivo para um ou ambos os vírus, pelos procedimentos acima citados, foram agrupados em monoinfecção CHIK, monoinfecção DEN e co-infecção CHIK / DEN.
Espectroscopia de NMR. Todas as amostras de soro positivas foram processadas para espectroscopia de RMN de 1H. 160 μl de tampão de NMR foi adicionado a 40 μl de amostra de soro para perfazer o volume total de 200 μl. Os experimentos de NMR foram
realizada a 298 K usando espectrômetro BrukerAvance III equipado com sonda TCI de ressonância tripla criogênica, operando na intensidade do campo de prótons de 500 MHz. A sequência de eco Carr – Purcell – Meiboom – Gill (CPMG) foi usado para suprimir parcialmente os sinais de proteína53. Um atraso total de CPMG de 300 ms foi usado com um tempo de eco de 200 ms. Todos os espectros de RMN de 1H unidimensionais foram medidos com 32 varreduras com um retardo de relaxamento de 4 segundos. Para cada decaimento de indução livre de amostra (FIDs) foi coletado com uma largura espectral de 10.000 Hz e tempo de aquisição de 3,28 s (t1max). Os picos foram processados ​​usando Topspin 2.1 (Bruker AG, Falländen, Suíça). A linha de base correção; o alinhamento do pico e o escalonamento dos picos foram realizados e referenciados a DSS a 0 ppm. Os picos da região de 6,0–4,5 ppm foram excluídos para remover os sinais de água.
Análise estatística de dados. Os picos foram escolhidos para cada amostra separadamente e foram posteriormente analisados e por causa da alta dimensionalidade e complexidade dos dados de NMR, a análise estatística multivariada dos dados torna-se necessária. Todas as análises estatísticas e descrição de vias foram realizadas usando a webferramenta MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca). O MetaboAnalyst aceita diferentes tipos de formato de dados gerados a partir de NMR ou	Comment by CAMILA AMATO MONTALBANO: Minha análise é multivariada?
Experimentos de MS. A ferramenta realizou uma verificação de integridade de dados. Os valores ausentes foram imputados usando o valor singular Algoritmo de decomposição (SVDIMPUTE). Os dados de linha foram normalizados usando a mediana da amostra, transformação de log foi realizada para normalização dos dados e para escalonamento destes, o algoritmo de escalonamento automático foi também usado. Para multi análise de grupo, ANOVA oneway foi realizada seguida por análises post-hoc usando HSD de Tukey. Na identificação de características importantes na análise de dados em pares, três testes foram realizados: análise de fold change com valor limite 2, teste t e o gráfico do vulcão, que é uma combinação dos dois testes anteriores. Os recursos com valor limite> 2 e valor de p <0,05 foram considerados significativos. Para prever a variância nas amostras, foram realizadas análises quimiométricas como Análise de Componentes Principais (PCA- Principal Component Analysis), Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA: Partial Least Squares Discriminant Analysis).	Comment by CAMILA AMATO MONTALBANO: qual é mesmo a diferença de usar o oneway e o individual?
Os picos de NMR encontrados como significativamente modulados foram anotados usando COLMAR54 e MetaboMiner web servers55. Esses servidores realizam a busca pelos picos no Metabolome Data Bank (www.hmdb.ca)56 e anotam os picos identificando os metabólitos correspondentes. As vias significativas envolvidas nas infecções também foram identificadas usando a ferramenta MetaboAnalyst.
Resultados
Um total de cinquenta e três amostras (Saudável: quinze, chikungunya (CHIK): quinze, Dengue (DEN): onze, chikungunya / dengue coninfecção (C / D): doze) foram analisados. As características clínicas básicas das amostras são mostradas em Tabela 1.
Tabela 1. Detalhes das amostras clínicas mostrando idade média, duração da febre e pontuação na escala visual analógica (VAS).
Todas as amostras foram submetidas a ELISA para teste de CHIKV-IgM e RT-PCR para detecção de RNA de CHIKV. Das quinze amostras de CHIK, todas as amostras foram positivas por RT-PCR e três dessas amostras foram positivas por Teste de CHIKV-IgM também. No caso de amostras DEN, duas amostras foram testadas positivas por ambos os testes DEN-IgM e RT-PCR, três amostras foram positivas apenas para IgM e as demais amostras foram consideradas positivas por RT-PCR. Da mesma forma em amostras de coinfecção, uma amostra testou positiva por CHIKV-IgM e DENV-IgM, três amostras foram positivo por RT-PCR (CHIK), DENV-IgM e RT-PCR (DEN), cinco amostras apresentaram resultado positivo por RT-PCR (CHIK) e DEN-IgM e todas as outras amostras foram consideradas positivas pelo método de RT-PCR para ambos os vírus.
Todas as amostras foram agrupadas de acordo com suas respectivas condições e foram analisadas usando MetaboAnalyst tool30. Essas amostras continham um total de 10722 picos de metabólitos com uma média de 202,3 picos por amostra. Os picos proximais são agrupados com base em sua posição usando uma janela móvel de 0,03 ppm e uma etapa de 0,015 ppm. Os picos do mesmo grupo foram somados se forem de uma amostra. Picos aparecendo em menos da metade das amostras em cada grupo foram ignoradas. Variáveis ​​ausentes foram imputadas usando SVDIMPUTE. Normalização por linha foi realizada usando a mediana da amostra. A transformação de dados foi feita pelo método de normalização de log e o algoritmo de escalonamento automático foi utilizado para escalonamento de dados. Análises univariadas e multivariadas foram realizadas e o resultados significativos (p-valor <0,05) foram posteriormente submetidos à análise de via.
Perfil global de metabólitos de soro e análise de vias em infectados por CHIK, DEN e co-infectados por CHIK / DEN. Perfil global de metabólitos de CHIK, DEN e amostras de soro co-infectadas foram realizadas e em comparação com amostras não infectadas (controle). No total, cinquenta e três amostras contendo 10722 picos com uma média de 202 picos por amostra foram analisados. Um total de 149 grupos de pico foram formados. Análise de variância unilateral (ANOVA) foi realizada para reconhecer a significância das coortes amostrais analisadas, seguido de análises post-hoc usando LSD de Fisher para identificar as diferenças entre os níveis nos conjuntos de dados. Análises ANOVA identificaram sessenta características significativas com valor de p <0,05. As análises PLS-DA e PCA dos conjuntos de dados foram realizadas para estudar a variação nos dados entre os cinco componentes derivados dessas análises. Na análise PLS-DA, o Componente 1 apresentou variação de 17,5%, o Componente 2 com 8,4%, o Componente 3 (8%), o Componente 4 (5,8%) e o Componente 5 mostrou uma variância de 5,1%. O gráfico de pontuação entre o Componente 1 e o Componente 2 é mostrado na Fig. 1a. A análise também identificou quinze características importantes com base nas pontuações VIP (Fig. 1b). O gráfico 2D de pontuação da análise de PCA é mostrado na Fig. 1 suplementar. 
Figura 1. A figura representa o gráfico de pontuação e metabólitos importantes. (a) Gráfico de pontuação do PLS-DA análise. (b) Metabolitos importantes selecionados com base na pontuação VIP.
A análise de pares entre as condições saudáveis ​​e as três doenças foi realizada para chegar a uma avaliação significativa da regulação dos metabólitos. No caso de infecção por CHIK, onze compostos mostraram regulação considerável; dos quais, nove metabólitos (ácido azelaico, ácido mandélico, metilguanidina, D-maltose, etanol, ácido 2-hidroxicapróico, gluconolactona, carnitina, galactitol) apresetaram up regulation com log2 (FC)> 2 e valor de p <0,05; dois metabólitos (Etanolamina, 1,3-Diaminopropano) foram detectados com down regulation (Tabela Suplementar 1). As vias significativas (valor p <0,05) são mostradas na Tabela 2. No caso da regulação de vias em CHIK, a via metabólica de Glicina, serina e treonina, a via do metabolismo da galactose e a via do ciclo do citrato (ciclo do TCA) mostrou significativo valor de p de 1,23E-04, 8,27E-04 e 0,018921 respectivamente.Da mesma forma em DEN, quatorze compostos mostraram significante alteração da regulação, dos quais doze metabólitos foram encontrados com aumento em seus níveis (log2 (FC)> 2; p-valor <0,05) e dois (ácido N-Metil-a-aminoisobutírico e Sarcosina) foram encontrados em níveis reduzidos quando comparados ao conjunto saudável. Análise de pathway revelou seis vias significativamente reguladas, sendo elas o metabolismo da glicina, serina e treonina (valor p = 8,16E-05), metabolismo da galactose (valor de p = 0,0072443), metabolismo de amido e sacarose (valor de p = 0,012559), metabolismo de glioxilato e dicarboxilato (valor p = 0,012559), via da pentose fosfato (valor p = 0,0394) e metabolismo do propanoato (p-valor = 0,046418) (Tabela 2).
Tabela 2. A tabela mostra as vias significativas identificadas após CHIK, DEN e coinfecção com valor de p <0,05.
Papel da idade na regulação dos metabólitos e suas vias durante a mono e coinfecção.
A idade tem impacto na progressão da doença em infecções como o chikungunya. População geriátrica foi relatada ser afetado de forma mais pronunciada e com uma fase crônica mais prolongada em comparação com indivíduos de idade mais jovem afetada pela infecção31. Nossa amostra de coorte no presente estudo também revelou que a idade mediana foi o máximo no caso de CHIK (Tabela 1). Para entender o impacto que a idade pode ter nos perfis de metabólitos; estudamos nossos conjuntos de dados de metabólitos com base na idade nas três doenças.
As amostras de CHIK foram divididas em dois grupos de idade, 12–40 anos e 41–70 anos. Análise de Fold chance (FC) dos dados identificou dezenove características importantes, enquanto a análise do teste t previu cinco características importantes com valor de p <0,05. A análise de PCA revelou que o componente principal 1 (PC1) apresentou variação máxima, ou seja, 22,2%, seguido por PC2 (18,7%), PC3 (14,5%), PC4 (9,9%) e PC5 (6,8%) (Fig. 2 complementar). Na análise PLS-DA, todos os cinco componentes também mostraram o padrão de separação semelhante à análise de PCA, ou seja, o componente 1 apresentou variação de 16,5%, componente 2 com 9,2%, componente 3 (11,8%), componente 4 (13,7%) e componente 5 apresentou variação de 12% (Fig. 2a). No conjunto de dados CHIK, três compostos (Trimetilamina, Putresina e ácido Mevalônico) mostrou regulação; Destes, dois metabólitos (Trimetilamina, Putresina) estavam apresentando aumento em seus níveis (log2 (FC)> 2 e valor de p <0,05) e os níveis de ácido mevalônico foram considerados substancialmente baixos (Tabela complementar 2) na faixa etária (41-70). Metabolismo de D-Glutamina e D-glutamato e o metabolismo de Alanina, aspartato e do glutamato mostrou valor p significativo de 0,022661 e 0,04891, respectivamente (Tabela 3).
Figura 2: A figura representa os gráficos de pontuação da análise PLS-DA de diferentes grupos de idade. (a) Pontuação PLS-DA enredo de CHIK. (b) Gráfico de pontuação PLS-DA de DEN. (c) Gráfico de pontuação PLS-DA de coinfecção.
As amostras de DEN foram divididas em duas faixas etárias, 12–25 anos e 26–51 anos. Análise de Fold chance (FC) dos dados identificou 35 características importantes, enquanto a análise do teste t previu sete características importantes com valor de p <0,05. As análises PCA e PLS-DA das amostras foram realizadas para estudar a variância dos dados. Na análise de PCA, componente principal 1 (PC1) apresentou variação máxima, ou seja, 25,8%, seguido por PC2 (18,7%), PC3 (15,9%), PC4 (11,9%) e PC5 (10,6%) (Fig. 2 complementar). Na análise PLS-DA, o componente 1 mostrou 17,2% de variância, o componente 2 com 18,3%, o componente 3 (14,3%), o componente 4 (12,5%) e o componente 5 mostrou 11,6% de variância (Fig. 2b). No conjunto de dados DEN, dois compostos, ácido cáprico e sarcosina, apresentaram alteração de regulação, o ácido cáprico apresentou aumento em seus níveis com log2 (FC)> 2 e valor de p <0,05 e houve diminuição dos níveis de sarcosina (Tabela Suplementar 2) na faixa etária (26–51). As vias com valor de p <0,05 encontram-se na Tabela 3. Metabolismo de tirosina e metabolismo de alanina, aspartato e glutamato apresentaram valor de p significativo de 0,0092504 e 0,04891, respectivamente.
Tabela 3. A tabela representa as vias significativas durante a infecção. As faixas etárias comparadas para cada conjuntos de dados são mostrados entre parenteses.
As amostras co-infectadas foram divididas em duas faixas etárias, 12–34 anos e 35–60 anos. Análise de Fold chance (FC) dos dados identificou 23 características importantes, enquanto a análise do teste t previu três características importantes com valor de p <0,05. Os resultados da análise do gráfico do Vulcão são mostrados na Tabela Suplementar 2. Na análise PCA, o principal componente 1 (PC1) apresentou variação máxima, ou seja, 25%, seguido por PC2 (12,8%), PC3 (15,5%), PC4 (9,1%) e PC5 (8,3%) (Fig. 2 complementar). Na análise PLS-DA, o componente 1 mostrou 18,4% de variância, componente 2 com 12,8%, o componente 3 (15,5%), o componente 4 (9,1%) e o componente 5 mostraram 6% de variância (Fig. 2c). No grupo de co-infecção, seis compostos (ácido 3-hidroxifenilacético, piridina, ácido gentísico, epinefrina, ácido atrolático e o ácido 4-hidroxifenilpirúvico) apresentaram aumento em seus níveis (log2 (FC)> 2 e valor de p <0,05). A análise das vias (Tabela 3) revelou que o metabolismo da tirosina é significativamente afetado (valor p = 2,99E-05).
Papel da duração da febre na regulação de metabólitos e suas vias durante mono e coinfecção. Um sintoma clínico importante em CHIK e DEN é a febre. Foi realizada uma classificação para entender as alterações nos metabólitos em um cenário de duração de febre no momento do relatório do paciente para coleta de amostra nos casos de monoinfecções e coinfecções. Para tanto, todas as categorias (amostras CHIK, DEN e C / D) foram combinados e, em seguida, divididas em dois grupos com base na duração da febre no momento da coleta da amostra dos pacientes. O primeiro grupo consistia de amostras que foram coletadas quando a apresentação da febre estava dentro dos primeiros cinco dias de acordo com a folha de história clínica e as amostras que foram coletadas quando o paciente chegou para a clínica com febre por mais de cinco dias (6-12 dias) compreendeu o segundo grupo. Análises ANOVA foram realizadas para cada grupo separadamente. Vinte e sete características significativas com valor de p <0,05 foram identificadas nos casos do primeiro grupo (1-5 dias) e no caso do segundo grupo, apenas quatorze características foram consideradas significativas (valor de p <0,05) (Tabela 4).
Tabela 4. A tabela representa as vias significativas identificadas durante o estudo do papel da duração da febre na infecção.
A análise PLS-DA de ambos os grupos revelou um padrão de variância semelhante (Fig. 3a, c). As quinze importantes características, cada uma identificada por análises PLS-DA com base em pontuações VIP para ambos os grupos, foram analisadas posteriormente para a identificação de suas respectivas vias (Fig. 3b, d). A análise da via do grupo com febre duração 1-5 dias revelou quatro vias significativas: biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano (valor p = 0,00746), biossíntese de ubiquinona e terpenóide-quinona (valor p = 0,01307), metabolismo do nitrogênio (valor p = 0,01524) e metabolismo da fenilalanina (valor p= 0,02003) (Tabela 4). A análise da via do grupo com duração de febre de 6 a 12 dias revelou que a via do metabolismo da tirosina foi regulada com menos significância (p-valor = 0,0613).
Figura 3. A figura representa o gráfico de pontuação e metabólitos importantes. (a) Gráfico de pontuação PLS-DA de febre duração 1-5. (b) Metabolitos importantes selecionados com base na pontuação VIP. (c) Gráfico de pontuação PLS-DA de febre duração 6–12. (d) Metabolitos importantes selecionados com base na pontuação VIP.
Vias afetadas pela intensidade do envolvimento das articulações no CHIK. Uma das características delineadoras entre chikungunya e dengue é o envolvimento das articulações.Pacientes com Chikungunya são afetados por crises agudas artralgia. Nesse contexto, estudamos monoinfecções e coinfecções por chikungunya com dengue no contexto de envolvimento ósseo / articular. As amostras de dengue não puderam ser analisadas desta forma, pois as amostras eram todas de indivíduos sem restrição de movimento articular e/ou artralgia ( como era de se esperar) e não puderam ser categorizados aos pares para a análise.
As amostras de CHIK foram divididas em dois grupos de acordo com o movimento restrito e não restrito. A análise de Fold chance (FC) dos dados identificou treze características importantes, enquanto a análise do teste t previu 3 importantes recursos com valor de p <0,05. Na análise PLS-DA, todos os cinco componentes também mostraram o padrão de separação, ou seja, o componente 1 mostrou 21,4% de variância, componente 2 com 7,1%, componente 3 (9,9%), componente 4 (12,2%) e o componente 5 apresentou 11,6% de variância (Fig. 4a). Duas vias, biossíntese de Pantotenato e CoA e o metabolismo da β-alanina foram reguladas diferencialmente de forma significativa com valor p de 0,033289 e 0,034508 respectivamente.
Figura 4. A figura representa os gráficos de pontuação da análise PLS-DA. (a) Gráfico de pontuação PLS-DA da pontuação VAS 1-5. (b) Gráfico de pontuação PLS-DA de pontuação VAS 6–10 (c) Gráfico de pontuação PLS-DA de movimento (restrito e não restrito) em Infecção por CHIK.
Papel da pontuação VAS nos metabólitos e suas vias durante a infecção e coinfecção por CHIK.
Chikungunya existe em dois estágios, a fase aguda febril e a fase artrítica crônica. A fase artrítica é avaliada pelo inchaço prolongado e crônico nos ossos que é avaliada pelo escore visual analógico (VAS). Uma VAS mais alta refletia maior cronicidade e uma apresentação de caso mais grave da doença. Analisamos as amostras de coinfecção por CHIK e estas foram divididas em dois grupos, o primeiro grupo com pontuação VAS 1-5 e o segundo grupo com Pontuação VAS de 6–10. As análises PLS-DA de ambos os conjuntos foram realizadas separadamente (Fig. 4b, c). Como apenas dois conjuntos de dados (CHIK e C / D) foram usados ​​para as análises, o teste Volcano foi realizado para identificar metabólitos significativos. Sete características significativas (p-valor <0,05) foram identificadas no caso do primeiro grupo (VAS = 1-5) e no caso do segundo grupo (VAS = 6–10), apenas quatorze características foram consideradas significativas (valor de p <0,05). Esses metabólitos significativos foram posteriormente analisados ​​para identificação de vias. A análise das vias alteradas do grupo com pontuação VAS 1-5 mostrou duas vias significativamente reguladas: A via da pentose fosfato e o metabolismo da galactose, cada um com valor de p 0,008741 e 0,01413, respectivamente. Da mesma forma, no caso de VAS 6-10, cinco vias foram considerados significativos: da fenilalanina (valor p = 9,32E-05), metabolismo da tirosina (valor p = 0,00857), biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano (valor p = 0,01015), ubiquinona e outra biossíntese de terpenóide-quinona (valor p = 0,017682) e metabolismo do nitrogênio com valor p de 0,020591 (Tabela 5).
Tabela 5. A tabela representa as vias significativas identificadas durante o estudo do papel da pontuação VAS em infecção.
Regulação das vias e metabólitos importantes durante a mono e coinfecção por CHIK com
DEN. A análise das vias que foram significativamente perturbadas em nosso estudo nos levou a desenvolver um modelo para fornecer uma ligação entre as várias vias e é representado na Fig. 5. Foi visto que o metabolismo da Glicina, serina e treonina e o metabolismo da galactose são as vias mais perturbadas em todas as três doenças (valor de p <0,01). Nas análises que envolvem condições específicas como febre, idade e envolvimento dos movimentos articulares, o metabolismo da tirosina e o metabolismo da fenilalanina foram os mais afetados.
Além disso, observamos que vários metabólitos foram regulados diferencialmente nas condições de doença no presente estudo. Para compreender a importância desta regulação entre os metabólitos, selecionamos aqueles metabólitos que foram altamente regulados em nossas análises e os representamos graficamente com base em sua presença em várias condições para hipotetizar se eles poderiam ser usados ​​como biomoléculas específicas para essa condição (Fig. 6a-i). Os resultados estão sendo discutidos em detalhes na seção seguinte.
Figura 5. A figura representa os metabólitos importantes identificados neste estudo. A caixa vermelha representao metabólito detectado no estudo metabolômico global, a caixa azul representa os metabólitos detectados no estudo do papel da idade durante a infecção, as caixas laranja e roxas representam metabólitos de VAS e o papel do estudo da febre e os metabólitos detectados durante o estudo do papel dos movimentos articulares são representados pela caixa verde. As descrições das setas são fornecidas como legenda na figura.
Figura 6. A figura representa gráficos de Box e Whisker de metabólitos representativos detectados durante
análise diferente. O eixo Y mostra concentrações normalizadas de metabólitos.
Discussão
Os vírus Chikungunya e Dengue pertencem a famílias diferentes, mas compartilham hospedeiros e vetores mamíferos comuns. Vários estudos relatam a co-ocorrência e coinfecção desses vírus em humanos14,32. O diagnóstico dessas duas infecções é difícil devido à sobreposição do quadro clínico entre ambas, o que leva a diagnósticos incorretos. A situação é ainda mais complicado durante a coinfecção dessas duas viroses, levando a um manejo clínico inadequado dos pacientes. Os estudos anteriores foram divididos com relação ao resultado clínico em casos de mono e co-infecções. Embora alguns estudos não tenham relatado diferenças nos sintomas ou resultados clínicos entre as duas condições9,33, outros mostraram diferenças distintas nos sintomas clínicos entre mono e coinfecções8,15.Um de nosso estudo recente revelou diferenças clínicas distintas entre monoinfecções por chikungunya e coinfecções com dengue e mostra que a artralgia grave e o envolvimento das pequenas articulações são mais pronunciados em coinfecções em comparação com monoinfecções por CHIK e dificilmente presente em monoinfecções por dengue15. Em nível molecular, as diferenças nos sintomas nas monoinfecções por CHIK e nas coinfecções com dengue indicam mudanças na regulação das vias metabólicas e seus produtos. No caso da dengue, vários estudos foram realizados utilizando metabolômica sérica para identificar pequenas moléculas diferenciadoras em diferentes tipos de dengue34,35. O presente estudo foi realizado para avaliar a regulação diferencial do metabólito em pacientes afetados por CHIK como monoinfecções e com DEN como coinfecções. Nosso estudo confirma que o metaboloma do soro é distintamente perturbado na monoinfecção por chikungunya, bem como na coinfecção por chikungunya com dengue.
Com relação às vias perturbadas, identificamos que o metabolismo da glicina, serina e treonina e
O metabolismo da galactose são as vias mais perturbada em todas as três doenças (Fig. 6). Um estudo analisando o efeito da infecção por DEN em linhagens de células endoteliais corrobora com nossos achados36, enquanto outro estudo enfatiza a importância da glicólise para a replicação eficiente do vírus no hospedeiro37. Perturbação de metabólitos importantes como D-serina, sorbitol, manose impactam diretamente outras vias conectadas como o PPP necessário para o metabolismo. Quando estudamos as vias em condições específicas como febre, idade e envolvimento do movimento articular, mostramos que o metabolismo da tirosina e o metabolismo da fenilalanina são os mais afetados. Desregulação do metabolismo da tirosina foi relatado com a idade e condições artríticas38,39. Envolvimento dessas vias em diferentes infecções como o HIV já foi relatado anteriormente40,41. Curiosamente, o metabolismo da pirimidina também é afetado durante a coinfecção que pode afetar a síntese de ácido nucléicoe afetar o ciclo celular. O ciclo geral do TCA também é afetados por mono e coinfecções que podem levar à privação de energia dos pacientes.
Um dos objetivos de tais estudos é a identificação de moléculas que poderiam ser exploradas para o desenvolvimento de biomarcadores. Neste estudo, tentamos identificar metabólitos que foram significativamente regulados entre as três condições de doença. Por exemplo, o ácido 2-cetobuírico estava totalmente ausente no caso de CHIK e C / D e foi encontrado em down regulation no caso de DEN em comparação com o conjunto saudável (Fig. 6a). Sabe-se que está envolvido na degradação da treonina e também ser convertido em succinil CoA e entrar no ciclo do ácido cítrico, este composto demonstrou estar envolvido na defesa da planta42. No entanto, o sorbitol foi encontrado totalmente ausente em Grupo DEN e considerado supra regulado no caso de monoinfecções por CHIK e regulado para baixo no caso de C / D (Fig. 6b). Foi relatado que o sorbitol participa da apoptose por meio da ativação da caspase e do citocromo c release43 e seu papel de maneira tão distinta nas infecções presentes justificam estudos aprofundados. Da mesma forma, no caso da sarcosina, os níveis foram significativamente variados quando comparados ao conjunto saudável, com DEN mostrando significante regulação negativa em comparação com as outras duas condições de doença (Fig. 6c). Sarcosina foi relatada em outras condições de doença, variando de HIV a câncer40,44. Com relação à idade, tiramina e adenilsuccínico, os ácidos foram significativamente regulados (Fig. 6d, e). A tiramina é conhecida por estar associada ao aumento da idade e atos pela liberação de norepinefrina endógena que eleva o metabolismo e é indiretamente proporcional em sua síntese com idade45,46. Em caso de febre, compostos como L-fenilalanina e ácido 4-hidroxibenzoico foram encontrados altamente em down regulation no caso de pacientes C / D (Fig. 6f, g) enfatizando claramente o efeito que a coinfecção tem com os dois vírus no metabolismo de aminoácidos. Foi relatado anteriormente que a L-fenilalanina é regulada em caso de pacientes com dengue clássico47. Mais especificamente, a razão fenilalanina / tirosina é considerada de relevância clínica em algumas doenças41,48,49.
Com relação ao envolvimento ósseo-articular nas três patologias, sabe-se que na dengue existe envolvimento mínimo das articulações, enquanto o envolvimento das pequenas articulações é observado em monoinfecções por chikungunya equando coinfetado com dengue15. A restrição das articulações é uma indicação quanto à gravidade da chikungunya, pontuação da escala visual analógica (VAS) é outra medida para examinar a deficiência nas articulações e a pontuação VAS dá uma indicação da cronicidade de chikungunya. Como a artrite induzida por vírus é um importante característica de chikungunya, é importante compreender a perturbação nas vias metabólicas envolvidas neste doença. O metabolismo da purina é conhecido por ser perturbado na artrite inflamatória50,51 e entre os metabólitos nesta via, hipoxantina, xantina e ácidos úrico são importantes. Sabe-se que estão baixos em condições fisiológicas, porém os níveis de hipoxantina aumentam com o dano ao tecido. No presente estudo, hipoxantina foi considerado regulado positivamente em nosso estudo em pacientes com chikungunya que apresentaram alta restrição em suas articulações (Fig. 6h). Da mesma forma, estudar o perfil metabólico de pacientes com alto escore VAS revelou a elevada regulação de Ácido 4-hidroxifenilpirúvico que é um intermediário no metabolismo da tirosina (Fig. 6i) e foi implicado na artrite reumatóide, devido à sua interação com o fator inibidor da migração de macrófagos (MIF), uma secreção proteína que ativa macrófagos52.
Conclusão
Nosso estudo lançou luz ao metaboloma global de soros de pacientes infectados com chikungunya sejam eles monoinfectados ou coinfectados com dengue. A análise do metaboloma do soro revelou que metabólitos distintos foram desregulados em condições de doença distintas. Estratificação adicional das coortes com base na idade, início da febre e envolvimento articular revelou que vias específicas estavam envolvidas nessas funções metabólicas e foram identificados metabólitos específicos da doença. Outras validações desses metabólitos em uma população maior de pacientes podem abrir forma de identificação de biomoléculas distintas que poderiam ser exploradas para o diagnóstico diferencial, gerando melhor manejo do paciente.
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