Células- Tronco

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE VETERINÁRIA (FAVET) 
DISCIPLINA DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA GERAL VETERINÁRIA 
3º NPC/ 2021 
 
 
 
 
RESUMO DE ARTIGO CIENTÍFICO 
 
 Células-tronco Neurais Adultas da Zona Subventricular: Uma Revisão 
do Ensaio da Neurosfera 
 
“Adult Neural Stem Cells From the 
Subventricular Zone: A Review of the 
Neurosphere Assay” 
SARA GIL-PEROT_IN,1,2* MARIA DURAN-MORENO,1 
ARANTXA CEBRIAN-SILLA,1 MONICA RAMIREZ, 
AULA GARCIA-BELDA,1 
AND JOSE MANUEL GARCA-VERDUGO1* 
1Laboratory of Comparative Neurobiology, Instituto Cavanilles de 
Biodiversidad y Biolog_ıa Evolutiva, University of Valencia, C/Catedratico 
Jose Beltran no 2, Paterna, Valencia, CIBERNED, Spain 
2Fundaci_on para la Investigaci_on La Fe, Grupo de Hematolog_ıa y 
Hemoterapia/Grupo de Investigaci_on en Esclerosis M_ultiple, 
Bulevar Sur, s/n, 46020, Valencia, Spain 
 
 
 
Docente: Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista 
 
Discentes: Amanda Oliveira Fernandez; Maria Jamille C. de Mesquita; Lara 
Cortez Passos; Lara Barroso Silva Lemos; Lorena de Freitas Câmara; Vanessa 
Cordeiro Lima. 
 
 
 
 
 
JULHO/ 2021 
 
 
 
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RESUMO 
A regeneração neuronal em adultos apresenta importância não somente na renovação 
fisiológica programada, como também em casos de doenças ou danos traumáticos que 
afetam o sistema nervoso. Nessa revisão foi analisada a habilidade neurogênica de 
proliferação, autorrenovação e morte celular de agregados chamados de neuroesferas 
em mamíferos e sua capacidade de gerar células neurais in vitro, como neurônios, 
astrócitos e oligodendrócitos. O protocolo utilizado foi a cultura das neuroesferas em 
um meio sem soro em placas não tratadas, permitindo a autorrenovação devido a uma 
mistura de suplementos e hormônios definidos adicionados ao meio basal. Dessa forma, 
buscou-se de modo distinto caracterizar as neuroesferas e defini-las como ferramentas 
potenciais para o uso em terapias de reposição e em pesquisas clínicas; determinar as 
limitações da técnica; e elucidar as condições ideais do cultivo para fins neurológicos. 
Constatou-se a importância de se observar os bioindicadores de sucesso da técnica, 
como alterações morfológicas das organelas presentes, que em caso de má formação 
tem potencial de gerar distúrbios em seu estado fisiológico. Os resultados dessa revisão 
podem ajudar a prevenir erros em trabalhos de neurogênese posteriores. 
 
Palavras-chave: neurogênese; neuroesferas; regeneração neuronal e sistema nervoso. 
 
OBJETIVOS 
Descrever o ensaio da neurosfera e suas limitações, os métodos para otimizar as 
condições da cultura, a identidade e a morfologia das neuroesferas derivadas das 
CTNA. 
 
1. INTRODUÇÃO 
As células-tronco têm a capacidade de proliferar, se autorrenovar e o potencial 
de se diferenciar em vários tipos de células maduras (KLASSEN et al., 2004; revisado 
por MING e SONG, 2005; SUH et al., 2009). A neurogênese adulta é a geração de 
novos neurônios no cérebro adulto ao longo da vida e ocorre principalmente em duas 
regiões do cérebro: a zona subventricular (SVZ) (ALVAREZ-BUYLLA e GARCIA-
VERDUGO, 2002), nas paredes laterais dos ventrículos laterais e a camada subgranular 
do giro denteado do hipocampo (KEMPERMANN, 2002). 
Um acontecimento importante para entender a regulação nos mecanismos de 
proliferação, diferenciação e morte celular de células-tronco neurais adultas (CTNA) 
foi a demonstração de que progenitores imaturos com potencial multifenotípico 
poderiam ser isolados do sistema nervoso central (SNC) de camundongos adultos, e 
propagado em cultura. Observou-se que estas células cresceram em vitro como 
agregados não aderentes denominados neuroesferas (REYNOLDS e WEISS, 1992) e 
eram capazes de gerar neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Desde então, novas 
fontes de células formadoras de neurosfera foram investigadas e diferentes métodos de 
cultura foram desenvolvidos para mantê-las, expandi-las e diferenciá-las (LILLIEN e 
CEPKO, 1992; COLES et al., 2004; KLASSEN et al., 2004). 
Contudo, uma série de questionamentos foram levantados em relação ao 
procedimento in vitro e a natureza exata das células cultivadas. A este respeito, esta 
revisão se concentrará em descrever os pontos positivos e os pontos negativos do ensaio 
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da neuroesfera, a melhora das condições de cultivo, a identidade das células formadoras 
das neuroesferas e a analogia com células tumorais expandidas, fornecendo uma 
perspectiva geral a considerar em caso de futuro aplicação de células-tronco neurais / 
células precursoras em medicina regenerativa. 
 
RESULTADOS 
 
2.ENSAIO DA NEUROSFERA COMO FERRAMENTA REPRESENTATIVA 
DA NEUROGÊNESE EM ADULTOS 
Antes de discutir sobre o ensaio da neurosfera, os autores do artigo explicam o 
que a neurogênese adulta ocorre normalmente na zona subventricular (SVZ) e que esta 
região compreende uma fina camada de células em divisão que se estende ao longo das 
paredes laterais do ventrículo lateral (TEMPLE e ALVAREZ-BUYLLA, 1999). 
Explica ainda que esta região se relaciona com a neurogênese ocorrida no bulbo 
olfatório (OB) do cérebro adulto, onde este último está localizado na região anterior do 
lobo olfatório, juntamente como o tubérculo e o pedúnculo. 
Com base nas características ultraestruturais e na duração do ciclo celular, é 
relatada a existência de quatro tipos celulares diferentes identificados na SVZ: os 
astrócitos (células do tipo B), células progenitoras amplificadoras transitórias (células 
do tipo C), neuroblastos migratórios (células do tipo A) e células ependimárias (LOIS 
e ALVAREZ -BUYLLA, 1994; DOETSCH et al., 1997; PERETTO et al., 1999). Essas 
células correspondem a estágios distintos de diferenciação, onde os astrócitos são os 
precursores primários (células-tronco neurais genuínas) que geram células do tipo C e 
estas subsequentemente dão origem a neuroblastos migrantes (Figura 1) que finalmente 
alcançam o OB e se diferenciam em interneurônios granulares e periglomerulares 
capazes de se integrar dentro dos circuitos neuronais estabelecidos (MORSHEAD e 
VAN DERKOOY, 1992; LOIS e ALVAREZ-BUYLLA, 1994; DOETSCH e 
ALVAREZ-BUYLLA, 1996; BIEBL et al., 2000). 
 
 
Figura 1. Composição e organização celular na SVZ de camundongo. A) Representação 
ilustrativa dos diferentes tipos de células SVZ (Tipo E, B, C e A) e sua organização. B) Seção 
ultrafina de SVZ (60–70 nm) mostrando os diferentes tipos de células com suas características 
morfológicas, onde: Bv = vaso sanguíneo, VL = ventrículo lateral, B = célula do tipo B, E = célula 
ependimária, A= célula do tipo A e C= célula do tipo C. 
 4 
 
 
O artigo também menciona que a neurogênese adulta no OB em mamíferos foi 
demonstrada pela primeira vez no cérebro de roedores, sendo descrita em outras 
espécies, como coelhos (BONFANTI e PONTI, 2008), cães (MALIK et al., 2012), 
vacas (RODRÍGUEZ PEREZ et al., 2003) e macacos (PENCEA et al., 2001; GIL-
PEROTIN et al., 2009). E em humanos, ainda que a neurogênese seja verificada no giro 
denteado, não se sabe até que ponto os CTNA residentes dão origem a neuroblastos que 
migram para o bulbo olfatório (SANAI et al., 2004; CURTIS et al., 2007). Além disso, 
alguns estudos afirmam que há uma renovação contínua de células não neuronais ao 
longo da vida, mas a reposição de novos neurônios após o período perinatal em 
humanos é muito reduzida e, se houver. De outro modo, os autores relatam que ainda é 
desconhecido o destino das células em proliferação da SVZ em humanos. 
 
2.1 Descrição do ensaio da neurosfera 
Por meio da utilização de células-tronco neurais adultas da SVZ, cultivadas in 
vitro, é feito o ensaio da neurosfera, que consiste no crescimento destas em meio sem 
soro com fatores de crescimento mitogênicos (EGF e FGF-2) em um substrato não 
adesivo (Figura 2). Assim, sob condições ideais, uma única célula-tronco receptiva ou 
tambémchamada de célula progenitora é capaz de gerar uma neuroesfera após várias 
divisões celulares. Essas neuroesferas formam agrupamentos de centenas a milhares 
de células, constituindo estruturas esféricas tridimensionais de flutuação livre, cujo 
número de unidades constituintes se relaciona com o tamanho das neuroesferas e o 
tempo de cultura. 
A partir do ensaio de neurosferas são avaliados aspectos como: propriedade de 
proliferação (verificado pelo poder de amplificação in vitro, ou seja, pelo aumento no 
número de células entre passagens sucessivas); o poder de autorrenovação, que é a 
capacidade de uma única célula formar neuroesferas subclonadas, sendo um importante 
indicador de “stemness”, isto é, refere-se à capacidade de diferenciação e proliferação 
de uma célula-tronco, e também é considerado um indicador de “neurogenicidade” de 
uma região, que é uma representação do número de células-tronco em um determinado 
nicho. 
Por fim, ao remover os fatores de crescimento do meio na presença de soro, 
ocorre adesão ao substrato e diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendroglia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 2. Ensaio de neurosfera. Representação esquemática da cultura da neurosfera in vitro. As CTNA 
são isoladas da ZSV do camundongo, que é dissecado, depois mecanicamente e enzimaticamente 
dissociado a uma suspensão de célula única e, finalmente, semeado na presença de mitógenos, como 
fator de crescimento epidérmico = EGF, e fator de crescimento de fibroblastos 2 = FGF ‐ 2). 
 
Segundo os autores do artigo, a partir do ensaio da neurosfera é possível obter 
e expandir derivados de CTNA para testar suas propriedades em diferentes condições 
ou mesmo fornecer uma fonte de células com poder de substituição e/ou neuroproteção 
após lesão. Por outro lado, estudos relatam que quando as neuroesferas são reculturadas 
por mais de 10 passagens, suas propriedades biológicas podem mudar adquirindo, em 
alguns casos, fenótipos semelhantes a tumor ou pelo menos apresentando instabilidade 
cromossômica progressiva (VUKICEVIK et al., 2010). Nesse caso, são recomendados 
apenas o uso de neuroesferas cultivadas por curtos períodos de tempo para fins de 
pesquisas ou aplicações clínicas. 
Eles destacam ainda que a validade do ensaio in vitro da neurosfera vem sendo 
questionada em termos de medida de clonalidade, multipotencialidade e 
neurogenicidade. Por exemplo, o conceito de clonalidade no ensaio das neurosferas é 
equivalente ao número de neuroesferas. Tal premissa é considerada falsa, pois tanto as 
células-tronco quanto seus progenitores amplificadores de trânsito podem formar 
neuroesferas, isso porque células-tronco quiescentes podem não ser detectadas no 
ensaio. 
Outro ponto de divergência está na concepção de que uma neurosfera representa 
a proliferação clonal de uma única célula, posto que em alguns estudos já realizados foi 
verificado que CTNA e neuroesferas apresentam mobilidade e tendem a se agregar 
mesmo em baixas densidades celulares, produzindo assim um erro inerente em termos 
de clonalidade, tamanho e número de neuroesferas (LADIWALA et al., 2012). Ainda 
assim, mesmo uma neurosfera subclonada, apresenta uma composição celular 
heterogênea, sendo constituída de células-tronco, progenitoras e células diferenciadas 
em diferentes fases do ciclo celular (Figura 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Limitações do ensaio da neurosfera. O ensaio de neurosfera in vitro tem sido usado como 
modelo para estudar o comportamento de células-tronco sob várias condições. No entanto, o ensaio in 
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vitro não representa uma população homogênea de células-tronco de clonagem, mas uma mistura 
heterogênea de tipos de células em diferentes estados de maturidade, que representam parcialmente a 
“stemness”. 
 
2.2 Potenciais aplicações clínicas para neuroesferas 
A grande novidade envolvida na utilização de células derivadas do ensaio na 
neuroesfera está no fato de que estas, após uma diferenciação celular direcionada para 
uma linhagem neuronal, sejam potencialmente utilizadas para fins terapêuticos em 
diversas doenças neurológicas que ainda não possuem um tratamento médico 
adequado. E quando modificadas geneticamente, essas células podem ser usadas para 
produzir proteínas que auxiliem na recuperação neuronal ou para bloquear proteínas 
específicas envolvidas no dano neuronal. O presente artigo também menciona que 
quando modificadas in vitro, os progenitores expandidos podem se comportar como um 
veículo de inoculação de drogas ou RNA interferente (RNAi) e prevenir a progressão 
de doenças neurodegenerativas, como o Alzheimer ou Parkinson. 
Ainda que o ensaio da neurosfera não permita estudar a população de células-
tronco de boa-fé, dada a natureza heterogênea das populações de células das 
neuroesferas, esse procedimento tem sido muito útil para analisar o efeito geral das 
moléculas terapêuticas no processo neurogênico ou para entender a função de deleção 
ou superexpressão de genes envolvidos na regulação da proliferação e autorrenovação 
dessas populações mistas de células-tronco/progenitoras. 
No que diz respeito às suas aplicações na medicina regenerativa, os autores do 
artigo ressaltam que apesar dessas células obtidas por meio de expansões in vitro sejam 
capazes de integrar e substituir tecidos lesados, há de se considerar que apresentam 
natureza e identidade inconsequentes para o organismo. Além disso, outros problemas 
precisam ser superados para tornar a medicina regenerativa uma realidade terapêutica, 
a citar: o risco de rejeição imunológica após o transplante de enxertos expandidos 
alogênicos provenientes de outros pacientes e a necessidade de mais estudos de longo 
prazo em modelos animais para predizer o potencial oncogênico de células-tronco 
estimuladas artificialmente. 
 
3. CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DA NEUROESFERA E 
MARCADORES MOLECULARES 
De acordo com os autores do artigo é fundamental analisar os marcadores 
moleculares disponíveis, a expressão gênica e/ou funções biológicas que caracterizam 
distintamente cada população de célula para que seja possível avaliar os diferentes 
fenótipos compreendidos em uma neurosfera. 
No entanto, ressalta-se que nenhum marcador molecular específico de CTNA 
foi encontrado até o momento, exceto o GFAP que identifica CTNA in vivo, mas ainda 
assim essas células não expressam os marcadores moleculares de diferenciação de 
neurônios, astrócitos e/ou oligodendrócitos. 
 7 
 
Segundo os autores do artigo, a partir dos marcadores moleculares é possível 
distinguir apenas três tipos de células em neuroesferas derivadas da SVZ de 
camundongos adultos que também estão presentes no nicho neurogênico in vivo: (1) 
astrócitos ou células do tipo B (expressando GFAP, GLAST, CD133 entre outros); (2) 
células tipo C que são Dlx-positivas, células Sox2- positivas e Olig2-positivas; (3) e 
células do tipo A bem caracterizadas pela expressão de beta-III-tubulina (Tuj1). 
Figura 4. Marcadores moleculares em neuroesferas ZSV. A) imunocoloração anti‐Tuj1 e anti‐Ki67. B) 
imunocoloração anti-nestina e anti-Ki67. C) imunocoloração anti-GFAP. 
 
Conforme a Figura 4, não foi observado um padrão fixo de distribuição na 
expressão dos marcadores testados. A coloração de Tuj1 é proeminente na periferia de 
uma pequena porcentagem de neuroesferas, provavelmente derivadas de progenitores 
mais comprometidos que já começaram a se diferenciar. Ainda na interpretação dos 
autores do artigo, o tipo de célula mais frequente não expressa GFAP ou Tuj1, 
provavelmente correspondendo à célula C de divisão rápida, e o marcador Ki-67, um 
marcador de entrada no ciclo celular, é amplamente expresso na neurosfera como um 
indicador de proliferação ativa (Figura 4B). 
 
3.1 Abordagens baseadas em expressões gênicas 
Ao questionar se é possível correlacionar a expressão gênica naneurosfera 
àquela em CTNA, os autores relatam que muitos estudos de expressão gênica estão 
sendo desenvolvidos com o objetivo de caracterizar o compartimento das CTNA, onde 
o ensaio das neurosferas pode contribuir com uma grande quantidade de células, porém, 
a dificuldade é a identificação dessas células, tendo em vista a heterogeneidade das 
populações celulares estudadas, principalmente verificada pelas diferenciações dentro 
do mesmo tipo de célula em função da variabilidade de cultivo ou pela ocorrência de 
distintos estágios de diferenciação. 
O artigo menciona um estudo realizado por Parker et al. (2005) onde foram 
comparadas células clones, de células-tronco neurais operacionalmente definidas, com 
aquelas obtidas a partir de ensaios da neuroesfera e foi demonstrado que os genes de 
“stemness”, expressos por ambas as populações, diferiram para um padrão mais 
diferenciado nas células obtidas a partir do ensaio. 
 
3.2 Função biológica 
Ao discutir sobre a definição das CTNA em termos funcionais, uma vez que há 
heterogeneidade nas populações dessas células, o artigo descreve um estudo realizado 
 8 
 
por Maurer et al.(2008), onde estes constataram que há uma variação no padrão de 
expressão gênica, mas afirmaram que é possível listar pré-requisitos comuns em termos 
de “expressão de proteínas”, como por exemplo, a capacidade de resposta a fatores de 
crescimento (expressão de receptores), como EGF, FGF-2, EPO, G-CSF , VEGF, LIF, 
TGF-b, NGF, bem como neurotransmissores, tais como glutamato, GABA ou óxido 
nítrico; (2) O uso de cascatas de sinalização de desenvolvimento, incluindo Shh, Pax, 
Hox, Wnt, Notch / Delta, TGF-b, NF kappa B ou JAK / STAT; (3) A interação com a 
matriz extracelular por meio de proteínas de interação célula-célula, como integrinas e 
caderinas; (4) A expressão de genes reguladores da transcrição e tradução responsáveis 
pela mudança do fenótipo celular de sua forma indiferenciada para os novos requisitos 
funcionais de uma célula-tronco diferenciada; (5) Os mecanismos de controle do 
número de células e proteção contra o estresse celular. 
Uma vez que todos os pré-requisitos estão presentes, a célula possui as 
ferramentas biológicas necessárias para proliferar, se autorrenovar e se diferenciar, 
independentemente dos marcadores expressos. 
 
4. MORFOLOGIA DAS NEUROESFERAS DERIVADAS DA ZSV 
 Ainda que não tenha sido elucidada a identidade das CTNA e as próprias 
células que compõem a neurosfera, os autores do artigo ressaltam a importância de 
conhecer em detalhes a morfologia das CTNAs expandidas e progenitoras, pois isso 
permitirá avaliar a natureza da célula potencialmente transplantada para selecionar as 
populações mais puras e saudáveis, para expandi-las e, assim obter sucesso na 
substituição celular. 
O artigo traz os dados experimentais de um estudo realizado com seis 
camundongos machos CD1 de 2 meses de idade que foram sacrificados por 
deslocamento do pescoço e as células da SVZ foram dissecadas. Após duas a quatro 
passagens celulares, as neuroesferas foram fixadas com paraformaldeído a 4% ou 
glutaraldeído a 3,5% para realizar a imunohistoquímica e microscopia eletrônica, 
respectivamente. 
 
4.1 Organizações histológicas 
Nesse estudo foi utilizado microscopia de contraste de fase, onde foram 
identificadas neuroesferas saudáveis e brilhantes em todo o seu volume. E quando 
foram analisadas neuroesferas com um tamanho maior que 200mm de diâmetro foi 
observada uma região central escura ou núcleo (Figura 5A-C), que segundo os autores 
do artigo, corresponde a uma área com alta taxa de morte celular. Em ampliações 
maiores (1003) em seções semifinais foi possível observar células mortas no núcleo de 
neuroesferas menores (100-200 mm de diâmetro), que não mostram um núcleo escuro 
evidente à microscopia de contraste de fase. 
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Diante de ampliações de 403 a 1003 vezes no microscópio de luz, nas seções semifinais, 
não foi possível identificar mais de um tipo de célula dentro da neurosfera. Verificou-
se apenas que os núcleos eram arredondados com invaginações ocasionais e cromatina 
dispersa, apresentando 1 ou 2 nucléolos típicos. Além disso, verificou-se que as células 
não estavam completamente ligadas umas às outras, havendo lacunas intercelulares sem 
expansões celulares. Também foram verificados sinais evidentes de morte celular e 
ruptura no núcleo das neuroesferas relacionadas aos núcleos apoptóticos. Os núcleos 
mitóticos foram frequentemente distribuídos na periferia da neurosfera (Figura 5D-H). 
Figura. 5. Microscopia de luz. A – C: Imagem de contraste de fase. Três neuroesferas de tamanho 
decrescente são representadas. Apenas a neurosfera em A (> 200mm) apresenta um núcleo escuro. D – 
H: Reconstrução de uma neurosfera em seções semifinais. G: No centro de 100-mneurosfera de diâmetro 
um grupo de células mortas (núcleos apoptóticos) são observados (círculo). Barra de escala: A – C5250 
mm; D – H520 mm. 
Ao analisar cortes semifinos processados para microscopia eletrônica (EM) e 
cortes ultrafinos contrastados com citrato de chumbo foram observadas neuroesferas 
compostas por células que não exibiam as características ultraestruturais típicas de 
neurônios, células gliais ou ependimárias (Figura 6A, B). Além disso, conforme as 
imagens histológicas abaixo, o citoplasma tinha contorno irregular com expansões 
curtas, esporadicamente longas, circundantes e células próximas através de junções 
aderentes (Figura 6D, E). Gotículas lipídicas foram observadas dentro do citosol, sendo 
frequentemente encontradas nas figuras mitóticas (Figura 6F, G), e segundo os autores 
do artigo, esse fato não é usual in vivo, indicando que as condições de cultura podem 
variar a atividade metabólica das células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 6. Características ultraestruturais de neuroesferas derivadas de SVZ de camundongo. UMA: 
Micrografia de seção ultrafina mostrando células distintas da neuroesfera com aparência de elétron-denso 
(asterisco preto) ou elétron-lucente (asterisco claro). B: Detalhe de ambos os tipos de células: citoplasma 
elétron-denso (asterisco preto) e elétron-lucente (asterisco claro). C: Complexo de Golgi com poucas 
cisternas (seta) associado a elevado número de vesículas clatrincadas (pontas de seta). D: Expansão 
celular ao redor de uma célula próxima (setas). E: Detalhe das junções aderentes características entre as 
células da neuroesfera (setas). F: Mitose com sua densa cromatina mostrando gotículas de lipídios 
citoplasmáticos (pontas de seta). G: Detalhe dos agregados de gotículas lipídicas dentro do citoplasma, 
frequentemente observados. H: Detalhe de grandes nucléolos reticulados (setas), observados na maioria 
dos núcleos. EU: Seção perpendicular das lamelas anuladas mostrando complexos de poros (pontas de 
seta). J: Detalhe da seção tangencial das lamelas anuladas mostrando a visão da superfície dos complexos 
de poros (pontas de seta). K: Vista panorâmica das células do núcleo da neurosfera. EU: Detalhe de K 
(região quadrada) em grande ampliação mostrando detritos celulares. M: Detalhe de K (região quadrada) 
em alta ampliação mostrando uma célula dentro do núcleo exibindo corpos densos heterogêneos 
citoplasmáticos. Barra de escala: A, D, L e M52 mm; B e H51 mm; C, G, J e I5500 nm; E 5250 nm; F55 
mm; K510 mm. Ld5Gotículas de lipídios. 
 
Em geral, os núcleos eram irregulares e apresentavam recortes profundos, 
cromatina dispersa com alguns grumos de cromatina densa e nucléolos reticulados 
grandes (Figura 6H). Outro aspecto observado é que não houve a presença simultânea 
de microtúbulos e filamentos intermediários na mesma célula. Foram observadas 
vesículas revestidas de clatrina e corpos multivesiculados e pequenas protusões 
membranosas, indicando uma comunicação intensa entre células vizinhas. Além disso, 
foi verificada a presença de células esporádicas exibindo umúnico cílio e não foram 
identificadas células multiciliadas. Nessas células, o único cílio foi profundamente 
internalizado dentro do citoplasma. 
Os autores do artigo reiteram que mesmo em condições ideais, as neuroesferas 
apresentam sinais de dano celular e em último caso, morte celular e que isso tende a se 
intensificar quando não são atingidas as condições ideais de cultivo. Ele faz referência 
a um trabalho desenvolvido por Bez et al. (2003), onde foi constatado que apenas em 
condições desfavoráveis, verifica-se a morte das células mais externas da neurosfera 
antes das células do núcleo, indicando condições externas não ótimas. 
No artigo, os autores fazem inclusive, uma comparação entre tumoroesferas 
derivadas de células em glioblastomas multiforme (GBM) com neuroesferas derivadas 
da SVZ, isso em virtude da preocupação envolvida na manipulação de CTNA in vitro, 
tendo em vista a possibilidade de transformação oncogênica, gerando tumores neurais 
no receptor. Para isso, os autores do artigo fazem referência a um estudo realizado por 
Ramirez-Ruano, et al. (não publicado), onde foram feitas análises ultraestruturais de 
espécimes de glioblastoma de dois pacientes adultos, cujas neuroesferas derivadas de 
GBM foram morfologicamente distinguíveis das neuroesferas derivadas de SVZ 
adultas, permitindo a sua identificação. 
As tumoroesferas de GBM foram densamente compactadas e profusamente 
misturadas através de longas expansões citoplasmáticas (Figura 7A). Segundo as 
análises feitas, nenhuma das células nas esferas do tumor tinha características clássicas 
e distintas dos tipos gliais, neuronais ou ependimários maduros. Os núcleos eram muito 
irregulares com invaginações, continham cromatina dispersa e nucléolos grandes (1 ou 
2) eram recorrentes (Figura 7D). Uma densa rede de filamentos intermediários e 
microtúbulos coexistia, diferentemente das neuroesferas não tumorais. E apesar das 
evidências de morte celular, as esferas de GBM não tinham núcleo, em comparação 
com as neuroesferas não tumorais. Assim, pode-se concluir que houve diferenças 
 11 
 
suficientes entre as esferas de GBM e as derivadas das neuroesferas da SVZ que 
poderiam nos permitir distinguir in vitro transformações de CTNA expandidas, 
constituindo assim, dados importantes para uma manipulação mais segura quanto a 
identificação e seleção de neuroesferas saudáveis expandidas in vitro com capacidade 
para substituição tecidual. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura. 7. Características ultraestruturais de tumoresferas de GBM. UMA: Esfera tumoral em seção semi-
fina mostrando sua estrutura compactada e a ausência de núcleo. B: Há heterogeneidade no conteúdo 
citoplasmático, às vezes aparecendo mais células elétron-densas (linha preta descontínua) e mais elétron-
lucente (linha branca descontínua). C: Detalhe da célula elétron-densa mostra a abundância de 
mitocôndrias e pequenos RER (ponta de seta). D: As células citoplasmáticas elétron-densas apresentam 
núcleos muito irregulares com recortes (setas brancas) e nucléolos grandes (setas pretas). Às vezes, essas 
células mostram uma longa expansão citoplasmática sions (setas de cabeça). E: Detalhe do aparelho de 
Golgi (pontas de seta) de células citoplasmáticas elétron-densas. F: Detalhe de duas expansões. Uma 
expansão contém filamentos intermediários (pontas de seta pretas) e a outra exibe filamentos 
intermediários (pontas de seta pretas) e microtúbulos (pontas de seta brancas).G: Detalhe da célula mais 
clara mostrando corpos densos com conteúdo membranoso (setas), um provável sinal de autofagia. Barra 
de escala: A, B e D510 mm; C e E51 mm; F e G5500 nm. 
 
DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
O ensaio da neuroesfera é muito importante para ser utilizado na obtenção de 
grandes quantidades de células a serem utilizadas em pesquisas básicas ou terapias de 
reposição, tornando-se, portanto, uma técnica inestimável. Contudo, deve-se atentar às 
limitações desse procedimento, evitando assim más interpretações e melhorando as 
técnicas na busca por resultados ideais. Essa técnica tem sido muito utilizada nas 
últimas décadas, entretanto, foram descritos nichos neurogênicos emergentes que são 
novas fontes potenciais de neuroesferas para fins de pesquisa. 
 12 
 
O hipotálamo está envolvido na regulação de sistema neuroendócrino, mesmo 
que seu papel na neurogênese seja ainda controverso, evidências recentes revelaram a 
produção de novos neurônios na fase adulta (revisado em Migaud et al., 2010). Os 
tanicitos foram considerados os responsáveis pela neurogênese no hipotálamo, pois 
após uma lesão os mesmos proliferam novos neurônios que se integram a área 
danificada. 
No giro dentado do hipocampo também residem células-tronco, porém, há 
controvérsias se a célula-tronco multipotente tem capacidade de se renovar e se 
diferenciar em progenitores gliais e neuronais (Suhonen et al., 1996; Palmer et al., 
1997; Seri et al., 2006) ou conseguem apenas dar origem a colônias pequenas, 
unipotentes e não auto renováveis (Clarke et al., 2010). Outra fonte interessante de 
células-tronco para a medicina regenerativa é o bulbo olfatório pois tem a capacidade 
de auto renovação e diferenciação em relação ao fenótipo neuronal e fornecem uma 
ferramenta para terapias de transplante em doenças neurodegenerativas, evitando assim 
as questões éticas abordadas no uso de embriões humanos. A possibilidade de obtenção 
de células-tronco do próprio paciente dribla também as questões de disponibilidade e 
rejeição imunológica, criando assim um futuro para aplicações clínicas. Outra fonte 
potencial de células-tronco é a retina (Das et al., 2005) e o córtex cerebral (Homman-
Ludiye et al., 2012). Independentemente da fonte dessas células é importante que elas 
sejam cultivadas e mantidas em meios ideais afim de melhorar os resultados 
neurológicos. Existem muitos aspectos a serem considerados quanto a essas condições 
ideais de cultivo, como pressão de oxigênio, componentes da mídia, temperatura, 
métodos de desagregação, número de passagens e assim por diante. Por isso, a adesão 
de protocolos padronizados é necessária e também para termos de comparação de 
diferentes grupos, tendo em vista a melhoria dos resultados algumas inovações quanto 
a esses protocolos que buscam condições mais fisiológicas para esse crescimento não 
devem ser desconsideradas. Novos protocolos devem ser mais investigados pois para 
ser capaz de melhorar as condições de cultura devemos sempre reconhecer o que 
queremos otimizar, por isso é fundamental fazer a verificação do estado das células que 
compõem as esferas. 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
Alvarez-Buylla A, Garcia-Verdugo JM. 2002. Neurogenesis in adult subventricular zone. J 
Neurosci 22:629–634. 
 
Bez A, Corsini E, Curti D, Biggiogera M, Colombo A, Nicosia RF, Pagano SF, Parati EA. 
2003. Neurosphere and neurosphereforming cells: morphological and ultrastructural 
characterization. Brain Res 993:18–29. 
 
Biebl M, Cooper CM, Winkler J, Kuhn HG. 2000. Analysis of neurogenesis and programmed 
cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neurosci Lett 291:17–20. 
 
Bonfanti L, Ponti G. 2008. Adult mammalian neurogenesis and the New Zealand white rabbit. 
Vet J 175:310–331. 
 
Coles-Takabe BLK, Brain I, Purpura KA, Karpowicz P, Zandstra PW, Morshead CM, Van der 
Kooy D. 2008. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem 
Cells 26: 2938–2944. 
 13 
 
 
Curtis MA, Kam M, Nannmark U, Anderson MF, Axell MZ, Wikkelso C, Holta˚s S, Van Roon-
Mom WMC, Bj€ork-Eriksson T, Nordborg C, Frisen J, Dragunow M, Faull RLM, Eriksson PS. 
2007. Human neuroblasts migrate to the olfactory bulb via a lateral ventricular extension. 
Science 315:1243–1249. 
 
Doetsch F, Alvarez-Buylla A. 1996. Network of tangential pathways for neuronal migration in 
adult mammalian brain. Proc NatlAcad Sci USA 93:14895–14900. 
 
Doetsch F, Petreanu L, Caille I, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. 2002. EGF converts 
transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain intomultipotent stem cells. Neuron 
36:1021– 1034. 
 
Gil-Perotin S, Marin-Husstege M, Li J, Soriano-Navarro M, Zindy F, Roussel MF, Garcia-
Verdugo J-M, Casaccia-Bonnefil P. 2006. Loss of p53 induces changes in the behavior of 
subventricular zone cells: implication for the genesis of glial tumors. J Neurosci 26:1107–1116. 
 
Kempermann G. 2002. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal 
neurogenesis. J Neurosci 22:635–638. 
 
Klassen H, Ziaeian B, Kirov II, Young MJ, Schwartz PH. 2004. Isolation of retinal progenitor 
cells from post-mortem human tissue and comparison with autologous brain progenitors. J 
Neurosci Res 77:334–343. 
 
Ladiwala U, Basu H, Mathur D. 2012. Assembling neurospheres: Dynamics of neural 
progenitor/stem cell aggregation probed using an optical trap. PloS One 7:e38613. 
 
Lillien L, Cepko C. 1992. Control of proliferation in the retina: temporal changes in 
responsiveness to FGF and TGF alpha. Development 115:253–266. 
 
Lois C, Alvarez-Buylla A. 1994. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian 
brain. Science 264:1145–1148. 
 
Malik SZ, Lewis M, Isaacs A, Haskins M, Van Winkle T, Vite CH, Watson DJ. 2012. 
Identification of the rostral migratory stream in the canine and feline brain. PloS One 7:e36016. 
 
Morshead CM, Van der Kooy D. 1992. Postmitotic death is the fate of constitutively 
proliferating cells in the subependymal layer of the adult mouse brain. J Neurosci 12:249–256. 
 
Parker MA, Anderson JK, Corliss DA, Abraria VE, Sidman RL, Park KI, Teng YD, Cotanche 
DA, Snyder EY. 2005. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. 
Exp Neurol 194:320–332. 
 
Pencea V, Bingaman KD, Freedman LJ, Luskin MB. Neurogenesis in the subventricular zone 
and rostral migratory stream of the neonatal and adult primate forebrain. Exp Neurol 
2001;172:1–16. 
 
Peretto P, Merighi A, Fasolo A, Bonfanti L. 1999. The subependymal layer in rodents: a site of 
structural plasticity and cell migration in the adult mammalian brain. Brain Res Bull 49:221–
243. 
 
Reynolds BA, Weiss S. 1996. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-
responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev Biol 175:1–13. 
 
Rodrıguez-Perez LM, Perez-Martın M, Jimenez AJ, Fernandez- Llebrez P. 2003. 
Immunocytochemical characterisation of the wall of the bovine lateral ventricle. Cell Tissue 
Res 314:325–335. 
 
Sanai N, Tramontin AD, Quinones-Hinojosa A, Barbaro NM, Gupta ~ N, Kunwar S, Lawton 
 14 
 
MT, McDermott MW, Parsa AT, ManuelGarcıa Verdugo J, Berger MS, Alvarez-Buylla A. 
2004. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain 
migration. Nature 427:740–744. 
 
Temple S, Alvarez-Buylla A. 1999. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. 
Curr Opin Neurobiol 9:135–141. 
 
Vukicevic V, Jauch A, Dinger TC, Gebauer L, Hornich V, Bornstein SR, Ehrhart-Bornstein M, 
Muller AM. 2010. Genetic instability € and diminished differentiation capacity in long-term 
cultured mouse neurosphere cells. Mech Ageing Dev 131:124–132.