Apoptose e Necrose Celular

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Morte Celular Programada
Durante o desenvolvimento, padrões cuidadosamente orquestrados de morte celular ajudam a determinar o tamanho e a forma dos membros e de outros tecidos. As células também morrem quando se tornam danificadas ou infectadas, que é uma forma de assegurar que elas sejam removidas antes que ameacem a saúde do organismo. Nesses e em muitos outros casos, a morte celular não é um processo aleatório, mas ocorre por uma sequência de eventos moleculares programados, nos quais a célula se autodestrói sistematicamente e é fagocitada por outras células, não deixando traços. Na maioria dos casos, essa morte celular programada ocorre por um processo chamado apoptose;
As células que morrem por apoptose sofrem modificações morfológicas características. Elas se encolhem e condensam, o citoesqueleto colapsa, o envelope nuclear se desfaz, e a cromatina nuclear se condensa e se quebra em fragmentos. A superfície da célula frequentemente abaula para o exterior e, se a célula for grande, rompe-se em fragmentos fechados por uma membrana, chamados corpos apoptóticos. A superfície da célula ou dos corpos apoptóticos torna-se quimicamente alterada, sendo rapidamente engolfada por uma célula vizinha ou um macrófago, antes que ela possa liberar seus conteúdos. Dessa maneira, a célula morre de forma ordenada e é rapidamente eliminada, sem causar uma resposta inflamatória prejudicial;
Ao contrário da apoptose, as células animais que morrem em resposta a um dano agudo, como um trauma ou uma falta de suprimento sanguíneo, geralmente morrem por um processo chamado de necrose celular. As células necrosadas se expandem e explodem, liberando seus conteúdos sobre as células adjacentes e provocando uma resposta inflamatória. Em muitos casos, a necrose provavelmente é causada pela depleção energética, que leva a defeitos metabólicos e perda de gradientes iônicos que normalmente ocorrem através da membrana celular;
A morte celular ajuda a esculpir mãos e pés durante o desenvolvimento embrionário: eles começam como estruturas em forma de pá, e os dedos individuais se separam apenas quando as células entre eles morrem. Em outros casos, as células morrem quando a estrutura formada por elas não é mais necessária. A apoptose também funciona como um processo de controle de qualidade no desenvolvimento, eliminando células que são anormais, posicionadas de forma incorreta, não funcionais ou potencialmente perigosas ao animal. Exemplos surpreendentes ocorrem no sistema imune adaptativo de vertebrados, onde a apoptose elimina o desenvolvimento de linfócitos T e B que falham tanto em produzir receptores antígeno-específicos potencialmente utilizáveis quanto em produzir receptores autorreativos que originam células potencialmente perigosas; ela também elimina muitos dos linfócitos ativados por uma infecção, depois que tenham ajudado a destruir os micróbios responsáveis. Em tecidos adultos que não estão crescendo nem condensando, a morte celular e a divisão celular devem ser firmemente reguladas para assegurar que estejam em exato equilíbrio;
As células animais podem reconhecer dano em suas várias organelas e, se o dano for grande o suficiente, elas podem matar a si mesmas entrando em apoptose. Um exemplo importante é o dano no DNA, que pode produzir mutações que promovem câncer se não forem reparadas. As células possuem várias vias de detecção de danos no DNA e entram em apoptose caso não possam repará-los;
A apoptose elimina células que são lesadas de modo irreparável, sem produzir reação do hospedeiro, limitando, assim, lesão tecidual paralela. A morte por apoptose é responsável por perda de células em várias situações patológicas:
· Lesão de DNA: A radiação, as drogas citotóxicas anticâncer e a hipoxia, podem lesar o DNA diretamente ou através da produção de radicais livres. Se os mecanismos de reparo não podem competir com a lesão, a célula dispara mecanismos intrínsecos que induzem a apoptose. Nessas situações, a eliminação da célula pode ser a melhor alternativa do que arriscar em mutações no DNA lesado, as quais podem progredir para uma transformação maligna. Esses estímulos nocivos causam apoptose se o insulto for leve, mas doses maiores do mesmo estímulo resultam em morte celular por necrose;
· Acúmulo de proteínas anormalmente dobradas: As proteínas impropriamente dobradas podem surgir de mutações nos genes que codificam estas proteínas ou devido a fatores extrínsecos, como a lesão causada por radicais livres. O acúmulo excessivo dessas proteínas no RE leva a uma condição conhecida como estresse do RE, que culmina em morte apoptótica das células. A apoptose causada pelo acúmulo de proteínas anormalmente dobradas foi considerada como base de várias doenças degenerativas do sistema nervoso central e de outros órgãos;
· Morte celular em certas infecções: particularmente as infecções virais, nas quais a perda de células infectadas é devida em grande parte à apoptose que pode ser induzida pelo vírus (como nas infecções por adenovírus e vírus da imunodeficiência humana) ou pela resposta imune do hospedeiro (como na hepatite viral). Uma resposta importante do hospedeiro aos vírus consiste em linfócitos T citotóxicos específicos para as proteínas virais, que induzem apoptose das células infectadas na tentativa de eliminar os reservatórios de infecção. Durante esse processo pode ocorrer lesão tecidual significativa. O mesmo mecanismo mediado por célula T é responsável pela morte celular em tumores e na rejeição celular aos transplantes;
· Atrofia patológica no parênquima de órgãos após obstrução de ducto, como ocorre no pâncreas, na parótida e no rim;
Retração celular: A célula é menor em tamanho; o citoplasma é denso, e as organelas, embora relativamente normais, estão mais compactadas. (Lembre-se de que em outras formas de lesão celular, uma característica inicial é a tumefação celular e não a retração). Acredita-se que as membranas plasmáticas permaneçam intactas durante a apoptose, até os últimos estágios, quando se tornam permeáveis aos solutos normalmente retidos. Essa descrição clássica é precisa no que diz respeito à apoptose em condições fisiológicas, como a embriogênese e a deleção de células imunes. Contudo, formas de morte celular com características de necrose bem como de apoptose não são incomuns após muitos estímulos ofensivos. Sob essas condições, a intensidade, em vez da natureza do estímulo, determina a via de morte celular, sendo a necrose a principal via quando há depleção de ATP e lesão à membrana acentuadas;
O processo de apoptose pode ser dividido em fase de iniciação, durante a qual algumas caspases se tornam cataliticamente ativas, e fase de execução, durante a qual outras caspases iniciam a degradação de componentes celulares críticos;
Ação das Caspases:
A apoptose é disparada por membros de uma família de proteases intracelulares especializadas, que clivam sequências específicas em numerosas proteínas dentro da célula, proporcionando, assim, mudanças dramáticas que levam à morte celular e ao engolfamento. Essas proteases têm uma cisteína no seu sítio ativo e clivam suas proteínas-alvo em ácidos aspárticos específicos; elas são então chamadas de caspases (c para cisteína e asp para ácido aspártico). As caspases são sintetizadas na célula como precursores inativos e são ativadas apenas durante a apoptose. Existem duas principais classes de caspases apoptóticas: caspases inciadoras e caspases executoras. As caspases desencadeadoras incluem caspase-8 e caspase-9. Várias outras caspases, incluindo caspase-3 e caspase-6, agem como executoras. Como muitas proteases, as caspases existem como pró-enzimas inativas ou zimogênios, e devem sofrer clivagem enzimática para tornarem-se ativas. A presença de caspases ativas, clivadas, constitui um marcador para células que estão sofrendo apoptose;
As caspases iniciadoras, como indica seu nome, iniciam o processo apoptótico. Elas normalmente existem como monômeros solúveis e inativos no citosol. Um sinal apoptótico dispara a montagem de grandes plataformas proteicasque congregam múltiplas caspases iniciadoras em grandes complexos. Dentro desses complexos, pares de caspases se associam para formar dímeros, resultando na ativação da protease. Cada caspase no dímero, então, cliva seu parceiro em um sítio específico no domínio de protease, o que estabiliza o complexo ativo e é requerido para o funcionamento apropriado da enzima na célula. A principal função das caspases iniciadoras é ativar as caspases executoras;
As caspases executoras normalmente existem como dímeros inativos. Quando são clivadas por uma caspase iniciadora no sítio no domínio da protease, o sítio ativo é rearranjado de uma conformação inativa para uma ativa. Um complexo de caspase inciadora pode ativar muitas capases executoras, resultando em uma amplificação da cascata proteolítica. Uma vez ativada, caspases executoras catalisam os diversos eventos de clivagem de proteínas que matam a célula;
Várias abordagens experimentais têm levado à identificação de mais de 1.000 proteínas que são clivadas por caspases durante a apoptose. Estas incluem as lâminas nucleares, cuja clivagem provoca a degradação irreversível da lâmina nuclear. Outro alvo é uma proteína que normalmente detém uma endonuclease que degrada DNA em uma forma inativa; sua clivagem libera a endonuclease para fragmentar o DNA no núcleo da célula. Outras proteínas-alvo incluem componentes do citoesqueleto e proteínas de adesão célula-célula que ligam as células às suas vizinhas; a clivagem dessas proteínas ajuda a célula apoptótica a arredondar-se e desligar-se das suas vizinhas, tornando mais fácil para uma célula vizinha engolfá-la, ou, no caso de uma célula epitelial, para a célula vizinha retirar a célula apoptótica da camada celular. A cascata da caspase não é apenas destrutiva e autoamplificável, mas também é irreversível; assim, uma vez que a célula começa a via para a destruição, ela não pode voltar atrás;
A ligação de proteínas de sinalização extracelular a receptores de morte na superfície celular dispara a via extrínseca da apoptose. Os receptores de morte são proteínas transmembrana contendo um domínio extracelular de ligação ao ligante, um domínio transmembrana único e um domínio de morte intracelular, o qual é requerido pelos receptores para ativar o programa apoptótico. Os receptores são homotrímeros (iguais) e pertencem à família de receptores do fator de necrose tumoral (TNF, tumor necrosis factor), o qual inclui um receptor para o próprio TNF e o receptor de morte Fas. Os ligantes que ativam os receptores de morte também são homotrímeros; eles são estruturalmente relacionados e pertencem à família TNF de proteínas sinalizadoras;
Um exemplo bem entendido de como os receptores de morte disparam a via extrínseca da apoptose é a ativação de Fas na superfície da célula-alvo pelo ligante Fas na superfície de um linfócito (citotóxico) matador. Quando ativado pela ligação do ligante Fas, domínios de morte na cauda citosólica dos receptores de morte Fas, ligam-se a proteínas adaptadoras intracelulares, que, por sua vez, ligam caspases iniciadoras (caspase-8 principalmente), formando um complexo de sinalização indutor de morte (DISC). Uma vez dimerizada e ativada em DISC, as caspases iniciadoras clivam seus parceiros e então ativam caspases executoras a jusante (downstream) para induzir apoptose. Em algumas células a via extrínseca recruta a via apoptótica intrínseca para amplificar a cascata da caspase e matar a célula;
Muitas células produzem proteínas inibidoras que agem para controlar a via extrínseca. Algumas células, por exemplo, produzem a proteína FLIP que se assemelha à caspase iniciadora mas não possui atividade de protease, porque falta a cisteína-chave no seu sítio ativo. FLIP dimeriza-se com caspase-8 no complexo DISC; embora a caspase-8 pareça ser ativa nesses heterodímeros, ela não é clivada no sítio requerido para sua ativação estável e o sinal apoptótico é bloqueado. Tais mecanismos inibidores ajudam a prevenir a ativação inapropriada da via extrínseca da apoptose;
As células podem ativar também seus programas de apoptose de dentro da célula, frequentemente em resposta ao estresse, tal como o dano do DNA ou em resposta a sinais de desenvolvimento. Em células de vertebrados, essas respostas são governadas por vias apoptóticas intrínsecas ou mitocondriais, que dependem da liberação de proteínas mitocondriais no citosol, que normalmente residem no espaço intermembrana dessas organelas. Algumas das proteínas liberadas ativam a cascata proteolítica de caspases no citoplasma, levando à apoptose. Uma proteína-chave na via intrínseca é o citocromo c, um componente solúvel em água da cadeia transportadora de elétrons da mitocôndria. Quando liberada no citosol, ela assume uma nova função: liga-se a uma proteína adaptadora chamada Apaf1 (fator 1 de ativação da protease apoptótica), promovendo a oligomerização de Apaf1 em um heptâmero tipo roda, chamado apoptossomo. Então as proteínas Apaf1 no apoptossomo recrutam as proteínas caspase-9 iniciadoras, que, acredita-se serem ativadas pela proximidade no apoptossomo, tal como a caspase-8 é ativada em DISC. As moléculas caspases-9 ativadas ativam então caspases executoras para induzir apoptose;
A via intrínseca da apoptose é firmemente regulada para assegurar que células cometam suicídio apenas quando for apropriado. A principal classe de reguladores intracelulares da via intrínseca é a família de proteínas Bcl2, as quais, como a família das caspases, são conservadas de vermes a humanos ao longo da evolução. As proteínas da família Bcl2 de mamíferos regulam a via intrínseca da apoptose, principalmente controlando a liberação, no citosol, de citocromo c e de outras proteínas mitocondriais intermembrana. Algumas proteínas da família Bcl2 são pró-apoptóticas e promovem a apoptose através do aumento da libertação, ao passo que outras são antiapoptóticas e inibem a apoptose através do bloqueio da libertação. As proteínas pró-apoptóticas e antiapoptóticas podem se ligar umas às outras em várias combinações para formar heterodímeros, nos quais as duas proteínas inibem as funções umas das outras. O balanço entre as atividades dessas duas classes funcionais de proteínas da família Bcl2 determina se células de mamíferos vivem ou morrem pela via intrínseca da apoptose;
As proteínas antiapoptóticas da família Bcl2, incluindo a própria Bcl2 (membro fundador da família Bcl2) e BclXL, compartilham quatro domínios (BH1-4) homólogos (BH) característicos de Bcl2. As proteínas pró-apoptóticas da família Bcl2 consistem em duas subfamílias – as proteínas efetoras da família Bcl2 e as proteínas BH3-apenas. As proteínas efetoras principais são Bax e Bak, que são estruturalmente similares a Bcl2 sem o domínio BH4. As proteínas BH3–apenas compartilham homologia de sequência com Bcl2 somente no domínio BH3;
Quando um estímulo apoptótico dispara a via intrínseca, proteínas efetoras da família Bcl2 pró-apoptóticas tornam-se ativadas e se agregam para formar oligômeros na membrana externa da mitocôndria, induzindo a liberação do citocromo c e outras proteínas intermembranas por um mecanismo desconhecido. Em células de mamíferos, Bax e Bak são as principais proteínas efetoras da família Bcl2, e ao menos uma delas é necessária para a via intrínseca de apoptose funcionar. Enquanto Bak está ligada à membrana externa mitocondrial, mesmo na ausência de um sinal apoptótico, Bax está principalmente localizada no citosol e se transloca para a mitocôndria apenas depois que um sinal apoptótico a ativa. Como discutido a seguir, a ativação de Bax e Bak geralmente depende de proteínas pró-apoptóticas BH3-apenas ativadas;
As proteínas da família Bcl2 antiapoptóticas, como Bcl2 e BclXL, também estão localizadas na superfície citosólica da membrana mitocondrial externa, onde ajudam a impedir a liberação inapropriada de proteínas intermembrana. As proteínas da família Bcl2 antiapoptóticas inibem a apoptose principalmente pela ligação e inibição de proteínas da família Bcl2 pró-apoptóticas – tanto na membrana mitocondrialcomo no citosol. Na membrana mitocondrial externa, por exemplo, elas ligam-se a Bak e impedem a sua oligomerização, consequentemente inibindo a liberação de citocromo c e outras proteínas intermembranas. Existem ao menos cinco proteínas da família Bcl2 antiapoptóticas em mamíferos, e cada célula de mamífero requer ao menos uma para sobreviver. Entretanto, um número dessas proteínas deve ser inibido para que a via intrínseca induza apoptose; as proteínas BH3-apenas fazem a mediação da inibição;
As proteínas BH3-apenas são a maior subclasse de proteínas da família Bcl2. A célula tanto as produz como as ativa em resposta a um estímulo apoptótico, e elas são conhecidas por promoverem a apoptose principalmente pela inibição de proteínas antiapoptóticas. Seus domínios BH3 ligam-se a uma fenda hidrofóbica longa nas proteínas da família Bcl2 antiapoptóticas, neutralizando sua atividade. Essa ligação e a inibição permitem o agregamento de Bax e Bak na superfície da mitocôndria, a qual dispara a liberação de proteínas mitocondriais intermembranas que induzem a apoptose. Algumas proteínas BH3-apenas podem ligar-se diretamente a Bax e Bak para ajudar a estimular sua agregação;
As proteínas BH3-apenas proporcionam a ligação crucial entre estímulos apoptóticos e a via intrínseca da apoptose, com diferentes estímulos ativando diferentes proteínas BH3-apenas. Alguns sinais de sobrevivência extracelulares, por exemplo, impedem a apoptose pela inibição da síntese ou atividade de certas proteínas BH3-apenas. Similarmente, em resposta ao dano do DNA que não pode ser reparado, as proteínas p53 supressoras de tumor se acumulam e ativam a transcrição de genes que codificam proteínas BH3-apenas Puma e Noxa. Essas proteínas BH3-apenas disparam a via intrínseca, eliminando, desse modo, uma célula potencialmente perigosa, que, caso contrário, poderia se tornar cancerosa;
Como mencionado anteriormente, em algumas células, a via apoptótica extrínseca recruta a via intrínseca para amplificar a cascata de caspase para matar a célula. A proteína BH3-apenas Bid é a conexão entre as duas vias. Bid está normalmente inativa. Contudo, quando receptores de morte ativam a via extrínseca em algumas células, a caspase iniciadora, caspase-8, cliva Bid, produzindo uma forma ativa de Bid que se transloca para a membrana externa mitocondrial e inibe proteínas antiapoptóticas da família Bcl2, amplificando assim o sinal de morte;
Pelo fato de a ativação da cascata de caspases causar morte certa, as células empregam múltiplos mecanismos robustos para assegurar que essas proteases sejam ativadas apenas quando necessário. Uma linha de defesa é fornecida por uma família de proteínas chamadas inibidores de apoptose (IAPs). Todas IAPs têm um ou mais domínios BIR (repetições IAP de baculovírus, de bacu-lovirus IAP repeat), que permitem a elas ligarem-se e inibirem caspases ativadas. Algumas IAPs também fazem a poliubiquitinação das caspases, marcando as caspases para destruição pelos proteassomos. Dessa maneira, as IAPs estabelecem um limiar inibidor que caspases devem cruzar para disparar a apoptose;
O papel das proteínas IAP e anti-IAP na apoptose é menos claro. As anti-IAPs são liberadas do espaço intermembrana mitocondrial quando a via intrínseca da apoptose é ativada, bloqueando IAPs no citosol e, dessa maneira, promovendo a apoptose. Contudo, camundongos parecem se desenvolver normalmente caso percam a principal IAP de mamíferos (chamado XIAP) ou as duas anti-IAPs de mamíferos conhecidas (chamadas de Smac/Diablo e Omi);
Muitas células animais requerem sinalização contínua de outras células para evitar a apoptose. Essa surpreendente combinação aparentemente ajuda a assegurar que células sobrevivam apenas quando e onde são necessárias. As células nervosas, por exemplo, são produzidas em excesso no desenvolvimento do sistema nervoso e então competem por quantidades limitadas de fatores de sobrevivência que são secretados pelas células-alvo às quais elas normalmente se conectam. As células nervosas que recebem sinais de sobrevivência suficientes vivem, enquanto as outras morrem. Dessa maneira, o número de neurônios sobreviventes é automaticamente ajustado, sendo apropriado para o número de células-alvo conectadas. Uma competição similar por quantidades limitadas de fatores de sobrevivência produzidos por células vizinhas é conhecida por controlar o número celular em outros tecidos durante o desenvolvimento e a idade adulta. Os fatores de sobrevivência geralmente se ligam a receptores da superfície celular, que ativam vias de sinalização intracelulares que suprimem o programa apoptótico, frequentemente por meio da regulação de proteínas da família Bcl2. Alguns fatores de sobrevivência, por exemplo, estimulam a síntese de proteínas antiapoptóticas da família Bcl2, tal como a própria Bcl2 ou BclXL. Outros agem por inibição da função de proteínas pró-apoptóticas BH3-apenas, como Bad. Alguns neurônios em desenvolvimento usam uma abordagem alternativa engenhosa: receptores de fatores de sobrevivência estimulam apoptose – por um mecanismo desconhecido – quando não estão ocupados e, então, param de promover a morte quando fatores de sobrevivência estão ligados. O resultado em todos esses casos é o mesmo: a sobrevivência celular depende da ligação do fator de sobrevivência;
A morte da célula por apoptose é um processo extraordinariamente organizado: a célula apoptótica e seus fragmentos não se rompem e liberam seus conteúdos, mas em vez disso, permanecem intactas para serem eficientemente comidas – ou fagocitadas – por células vizinhas, não deixando traços e, portanto, sem disparar nenhuma resposta inflamatória. Esse processo de engolfamento depende de modificações químicas na superfície das células apoptóticas, que disparam sinais de recrutamento de células fagocíticas. Uma modificação especialmente importante ocorre na distribuição de fosfolipídeos fosfatidilserina carregados negativamente na superfície celular. Esse fosfolipídeo normalmente está localizado exclusivamente na da folha interna bicamada lipídica da membrana plasmática, mas ele vira para a folha externa em células apoptóticas. O mecanismo subjacente é pobremente entendido, mas a exposição externa da fosfatidilserina provavelmente depende da clivagem pela caspase de algumas proteínas envolvidas na distribuição de fosfolipídeos na membrana. Uma variedade de proteínas “de ponte” solúveis interage com fosfatidilserinas expostas em células apoptóticas. Essas proteínas de ponte também interagem com receptores específicos na superfície de células da vizinhança ou macrófagos, disparando modificações do citoesqueleto e outras mais que iniciam o processo de engolfamento. Os macrófagos não fagocitam células saudáveis no animal – apesar do fato de células saudáveis normalmente exporem algumas fosfatidilserinas na sua superfície. As células saudáveis expressam proteínas-sinal na sua superfície, as quais interagem com receptores inibitórios nos macrófagos que bloqueiam a fagocitose. Assim, além de expressar sinais na superfície celular, tal como as fosfatidilserinas que estimulam a fagocitose, células apoptóticas devem perder ou inativar o sinal de “não me coma” que bloqueia a fagocitose;
As células que estão morrendo por apoptose secretam fatores solúveis que recrutam os fagócitos. Alguns corpos apoptóticos expressam trombospondina, uma glicoproteína adesiva que é reconhecida pelos fagócitos, e os próprios macrófagos podem produzir proteínas que se ligam às células apoptóticas (mas não às células vivas) e direcionam, assim, as células mortas para o engolfamento. Os corpos apoptóticos podem também ser revestidos por anticorpos naturais e proteínas do sistema complemento, notavelmente C1q, os quais são reconhecidos pelos fagócitos. Portanto, numerosos receptores nos fagócitos e ligantes induzidos nas células apoptóticas estão envolvidos na ligação e engolfamento dessas células. Esse processo de fagocitose das células apoptóticas é tão eficiente que as células mortas desaparecem, dentro de minutos, semdeixar traços, e a inflamação é ausente mesmo em face de extensa apoptose;
A Fase de Execução da Apoptose: As duas vias de iniciação convergem para uma cascata de ativação de caspases que modulam a fase final da apoptose. Como já vimos, a via mitocondrial leva à ativação de caspase-9 desencadeante e a via de receptor de morte, às caspases 8 e 10 desencadeantes. Depois que uma caspase desencadeante é clivada para gerar sua forma ativa, o programa enzimático de morte é posto em movimento por ativação rápida e sequencial das caspases executoras. As caspases executoras, como as caspases-3 e -6, atuam em muitos componentes celulares. Por exemplo, uma vez ativadas, essas caspases clivam um inibidor de uma DNase citoplasmática, tornando-a enzimaticamente ativa; esta enzima induz a clivagem típica do DNA em fragmentos do tamanho de nucleossomas, descrito anteriormente. As caspases também degradam os componentes estruturais da matriz nuclear, promovendo, assim, a fragmentação do núcleo. Algumas das etapas da apoptose não estão bem definidas. Por exemplo, não sabemos como a estrutura da membrana plasmática é alterada nas células apoptóticas ou como as bolhas de membrana e corpos apoptóticos são formados;
Existem muitas doenças humanas nas quais o número excessivo de células que entram em apoptose contribui para o dano no tecido. Dentre os exemplos mais dramáticos estão os ataques do coração e derrames. Nessas condições agudas, muitas células morrem por necrose como resultado de isquemia (suprimento inadequado de sangue), mas algumas das células menos afetadas morrem por apoptose. Espera-se que, no futuro, drogas que bloqueiam a apoptose – como inibidores específicos de caspases – mostrem sua utilidade poupando tais células. Existem outras circunstâncias onde poucas células morrem por apoptose. As mutações em camundongos e humanos, por exemplo, que inativam genes que codificam o receptor de morte Fas ou o ligante Fas, impedem a morte normal de alguns linfócitos, causando o acúmulo excessivo dessas células no baço e nas glândulas linfáticas. Em muitos casos, isso leva à doença autoimune, na qual os linfócitos reagem contra tecidos do próprio indivíduo;
A apoptose diminuída também faz uma importante contribuição a muitos tumores, visto que as células de câncer frequentemente regulam o programa apoptótico anormalmente. O gene Bcl2, por exemplo, foi primeiramente identificado em uma forma comum de linfócitos de câncer em humanos, onde uma translocação cromossômica causa uma produção excessiva da proteína Bcl2; de fato, Bcl2 recebeu seu nome desse linfoma de célula B. O alto nível da proteína Bcl2 em linfócitos que carregam a translocação promove o desenvolvimento de câncer pela inibição da apoptose, prolongando a sobrevivência de linfócitos e aumentando o seu número; isso também diminui a sensibilidade dessas células a fármacos anticâncer, que comumente funcionam levando as células de câncer a entrarem em apoptose. Similarmente, o gene que codifica a proteína supressora de tumor p53 é mutado em cerca de 50% dos cânceres humanos, sendo que isso não promove mais a apoptose ou a parada do ciclo celular em resposta ao dano no DNA. A falta da função de p53 permite que a célula cancerosa sobreviva e prolifere mesmo quando seu DNA está danificado; dessa maneira, as células acumulam mais mutações, algumas das quais produzem câncer mais maligno. Como muitos fármacos anticâncer induzem a apoptose (e a parada do ciclo celular) por um mecanismo dependente de p53, a perda da função de p53 também produz células de câncer menos sensíveis a esses fármacos;
Se a diminuição da apoptose contribui para muitos cânceres, então se poderia tratar esses cânceres com drogas que estimulam a apoptose. Essa linha de pensamento recentemente levou ao desenvolvimento de pequenos produtos químicos que interferem na função de proteínas antiapoptóticas da família Bcl2, tais como Bcl2 e BclXL. Esses agentes químicos ligam-se com alta afinidade à fenda hidrofóbica de proteínas antiapoptóticas da família Bcl2, bloqueando sua função, usando essencialmente a mesma via que proteínas BH3-apenas. A via intrínseca da apoptose é, então, estimulada, o que em certos tumores aumenta a quantidade de células mortas;
A exposição das células à radiação ou a agentes quimioterápicos induz apoptose por um mecanismo que é iniciado por lesão de DNA (estresse genotóxico) e que envolve o gene supressor tumoral p53. A proteína p53 acumula-se quando o DNA é lesado e interrompe o ciclo celular (na fase G1) para conceder tempo para o reparo. Contudo, se a lesão for muito intensa para ser reparada com sucesso, o p53 desencadeia a apoptose. Quando o p53 está mutado ou ausente (como em certos cânceres), ele é incapaz de induzir apoptose, favorecendo a sobrevivência das células com o DNA lesado. Em tais células, a lesão de DNA pode resultar em mutações ou translocações que levam à transformação neoplásica. Portanto, o p53 atua como chave fundamental da “vida ou morte” no caso do estresse genotóxico. O mecanismo pelo qual o p53 desencadeia a maquinaria efetora da morte distal – as caspases – é complexo, mas parece envolver sua função na ativação da transcrição. Dentre as proteínas cuja produção é estimulada pelo p53 estão vários membros da família Bcl, notavelmente Bax, Bak e algumas proteínas apenas BH3, mencionados anteriormente;
Proteínas anormalmente dobradas: As chaperonas no retículo endoplasmático controlam o dobramento de proteínas recém-sintetizadas, e os polipeptídeos mal dobrados são ubiquitinados e direcionados para a proteólise, nos proteossomas. Se, contudo, proteínas não dobradas ou anormalmente dobradas se acumulam no retículo endoplasmático, devido a mutações herdadas ou ao estresse, elas desencadeiam um número de respostas celulares, coletivamente chamadas de “resposta de proteína não dobrada”. Essa resposta ativa vias de sinalização que aumentam a produção de chaperonas, aumenta a degradação proteossômica das proteínas anormais e diminui a translação da proteína, reduzindo, assim, a carga de proteínas anormalmente dobradas na célula. Entretanto, se essa resposta citoprotetora for incapaz de lidar com o acúmulo de proteínas anormalmente dobradas, a célula ativa as caspases e induz a apoptose. Esse processo é conhecido como estresse de retículo endoplasmático. O acúmulo intracelular de proteínas anormalmente dobradas, causado por mutações genéticas, envelhecimento, ou fatores ambientais desconhecidos, é atualmente reconhecido como uma característica de várias doenças neurodegenerativas, incluindo as de Alzheimer, Huntington e Parkinson e, provavelmente, diabetes tipo 2. A privação de glicose e oxigênio, e estresse, como calor, também resultam em proteína mal dobrada, que culmina em lesão e morte celular;
Apoptose Induzida pela Família de Receptores TNF. O FasL nas células T se liga ao Fas dos mesmos linfócitos ou linfócitos vizinhos. Essa interação atua na eliminação de linfócitos que reconhecem antígenos próprios, e mutações que afetam o Fas ou FasL resultam em doenças autoimunes. A citocina TNF é um importante mediador da reação inflamatória, mas ela é capaz, também, de induzir apoptose. (O nome “fator de necrose tumoral” surgiu não porque a citocina elimina as células tumorais diretamente, mas porque ela induz a trombose dos vasos sanguíneos do tumor, o que resulta em morte do tumor por isquemia.) De fato, as principais funções fisiológicas do TNF são mediadas não por induzir apoptose, mas por ativar o importante fator de transcrição NF-κB (fator nuclear-κB), que promove a sobrevida celular estimulando a síntese de membros antiapoptóticos da família Bcl-2 e ativa uma série de respostas inflamatórias;
Apoptose Mediada por Linfócitos T Citotóxicos. Os linfócitos T citotóxicos (LTCs), reconhecem antígenos estranhos, apresentados na superfície de células hospedeiras infectadas. Sob ativação, os LTCs secretam perfurina, uma molécula formadora de poro transmembrana, a qual promove a entrada de grânulos do LTC contendo serina-proteases chamadas granzimas. Asgranzimas têm a capacidade de clivar proteínas em resíduos de aspartato, ativando, assim, uma série de caspases celulares. Desse modo, o LTC destrói células-alvo diretamente, induzindo a fase efetora da apoptose. Os LTCs expressam também FasL na sua superfície e podem destruir células-alvo através da ligação de receptores de Fas;
Lesões Celulares e Necrose:
A lesão celular ocorre quando as células são estressadas tão excessivamente que não são mais capazes de se adaptar ou quando são expostas a agentes lesivos à sua natureza ou são prejudicadas por anomalias intrínsecas. Nos estágios iniciais ou nas formas leves de lesão, as alterações morfológicas e funcionais são reversíveis, se o estímulo nocivo for removido. Os principais marcos da lesão reversível são a redução da fosforilação oxidativa, com consequentes depleção do armazenamento de energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP) e tumefação celular causada por alterações da concentração de íons e influxo de água. Além disso, várias organelas intracelulares, como mitocôndrias e o citoesqueleto, podem mostrar alterações;
Com a persistência do dano, a lesão torna-se irreversível e com o tempo a célula não pode se recuperar e morre. Existem dois principais tipos de morte celular, a necrose e a apoptose, diferentes em sua morfologia, mecanismos e papéis na fisiologia e na doença. Quando o dano às membranas é acentuado, as enzimas lisossômicas extravasam para o citoplasma e digerem a célula, e o conteúdo celular escapa, resultando em necrose. Em situações em que o DNA ou as proteínas celulares são lesados de modo irreparável, a célula se suicida por apoptose, uma forma de morte celular caracterizada pela dissolução nuclear, fragmentação da célula sem perda da integridade da membrana, e rápida remoção dos restos celulares. Enquanto a necrose é sempre um processo patológico, a apoptose auxilia muitas funções normais e não é, necessariamente, associada à lesão celular;
A lesão reversível é caracterizada por tumefação generalizada da célula e suas organelas; formação de bolhas na membrana plasmática; destacamento dos ribossomos do RE e aglomeração da cromatina nuclear. Essas alterações morfológicas estão associadas com o decréscimo de geração de ATP, perda da integridade da membrana celular, defeitos na síntese de proteínas, danos ao citoesqueleto e danos ao DNA. Dentro dos limites, a célula pode reparar esses distúrbios e, se o estímulo nocivo atenuar, ela retornará à normalidade. No entanto, com lesão excessiva ou persistente, a célula passa do nebuloso “ponto sem retorno” para lesão irreversível e morte celular. As duas características da lesão celular reversível podem ser reconhecidas com a microscopia óptica: tumefação celular e a degeneração gordurosa. A tumefação celular surge quando as células se tornam incapazes de manter a homeostasia iônica e líquida e é resultante da falha da bomba de íons dependente de energia na membrana plasmática. A degeneração gordurosa ocorre na lesão hipóxica e em várias formas de lesão metabólica ou tóxica. Ela é manifestada pelo surgimento de vacúolos lipídicos grandes no citoplasma. É observada principalmente em células envolvidas e dependentes do metabolismo de gordura, como os hepatócitos e as células miocárdicas;
O aspecto morfológico da necrose resulta da desnaturação de proteínas intracelulares e da digestão enzimática das células lesadas letalmente. As células necróticas são incapazes de manter a integridade da membrana e seus conteúdos sempre extravasam, um processo que pode iniciar inflamação no tecido circundante. As enzimas que digerem a célula necrótica são derivadas dos lisossomos das próprias células que estão morrendo ou dos lisossomos dos leucócitos que são recrutados como parte da reação inflamatória. A digestão dos conteúdos celulares e a resposta do hospedeiro podem levar horas para se desenvolver e, portanto, não haveria alterações detectáveis nas células se, por exemplo, um infarto miocárdico causasse morte súbita. A única evidência circunstancial poderia ser a oclusão de uma artéria coronária. A primeira evidencia histológica de necrose miocárdica aparece 4 a 12 horas depois. No entanto, devido à perda da integridade da membrana plasmática, as enzimas e proteínas específicas do coração são rapidamente liberadas do músculo necrótico, podendo ser detectadas no sangue a partir de 2 horas após a necrose das células miocárdicas;
Quando um grande número de células morre, o tecido ou o órgão é considerado necrótico; assim, um infarto do miocárdio é a necrose de uma porção do coração causada pela morte de muitas células miocárdicas. No paciente vivo, a maioria das células necróticas e seus conteúdos desaparecem por fagocitose e digestão enzimática pelos leucócitos. Se as células necróticas e restos celulares não forem prontamente destruídos e reabsorvidos, tenderão a atrair sais de cálcio e outros minerais e a tornarem-se calcificadas. Esse fenômeno é chamado de calcificação distrófica. A necrose dos tecidos possui vários padrões morfológicos distintos, cujo reconhecimento é importante porque eles fornecem pistas sobre a causa básica:
· Necrose de coagulação: é a forma de necrose tecidual na qual a arquitetura básica dos tecidos mortos é preservada, por pelo menos alguns dias. Os tecidos afetados exibem uma textura firme. Supostamente, a lesão desnatura não apenas as proteínas estruturais, mas também as enzimas, bloqueando assim a proteólise das células mortas; como resultado, células anucleadas e eosinofílicas persistem por dias ou semanas. Finalmente, as células necróticas são removidas por fagocitose dos restos celulares, através da infiltração de leucócitos e pela digestão das células mortas através da ação das enzimas lisossômicas dos leucócitos. A isquemia causada por obstrução em um vaso que supre um tecido pode levar à necrose de coagulação, exceto no cérebro. Uma área localizada de necrose de coagulação é chamada de infarto;
· Necrose liquefativa: é caracterizada pela digestão das células mortas, resultando na transformação do tecido em uma massa viscosa líquida. É observada em infecções bacterianas focais ou, ocasionalmente, nas infecções fúngicas, porque os micróbios estimulam o acúmulo de leucócitos e a liberação de enzimas dessas células. O material necrótico é frequentemente amarelo cremoso devido à presença de leucócitos mortos e é chamado de pus. Por razões desconhecidas, a morte por hipoxia de células dentro do sistema nervoso central com frequência se manifesta como necrose liquefativa;
· Necrose gangrenosa: não é um padrão específico de morte celular, mas o termo é usado comumente na prática clínica. Em geral é aplicado a um membro, comumente a perna, que tenha perdido seu suprimento sanguíneo e que sofreu necrose (tipicamente necrose de coagulação), envolvendo várias camadas de tecido. Quando uma infecção bacteriana se superpõe, ocorre mais necrose liquefativa por causa da ação das enzimas degradativas nas bactérias e nos leucócitos atraídos (originando a chamada gangrena úmida);
· Necrose caseosa: é encontrada mais frequentemente em focos de infecção tuberculosa. O termo “caseoso” (semelhante a queijo) é derivado da aparência friável esbranquiçada, da área de necrose. Ao exame microscópico, a área necrótica exibe uma coleção de células rompidas ou fragmentadas e restos granulares amorfos encerrados dentro de uma borda inflamatória nítida; essa aparência é característica de um foco de inflamação conhecido como granuloma;
· Necrose gordurosa: se refere a áreas focais de destruição gordurosa, tipicamente resultantes da liberação de lipases pancreáticas ativadas na substância do pâncreas e na cavidade peritoneal. Isto ocorre na emergência abdominal calamitosa, conhecida como pancreatite aguda. Nesse distúrbio, as enzimas pancreáticas escapam das células acinares e liquefazem as membranas dos adipócitos do peritônio. As enzimas liberadas dividem os ésteres de triglicerídeos contidos dentro dessas células. Os ácidos graxos liberados combinam-se com o cálcio, produzindo áreasbrancas gredosas macroscopicamente visíveis (saponificação da gordura), que permitem ao cirurgião e ao patologista identificarem as lesões. Ao exame histológico, os focos de necrose exibem contornos sombreados de adipócitos necróticos, com depósitos de cálcio basofílicos, circundados por uma reação inflamatória;
· Necrose fibrinoide: é uma forma especial de necrose geralmente observada nas reações imunes que envolvem os vasos sanguíneos (vasculites). Esse padrão de necrose ocorre tipicamente quando complexos de antígenos e anticorpos são depositados nas paredes das artérias. Os depósitos desses “imunocomplexos”, em combinação com a fibrina que tenha extravasado dos vasos, resulta em uma aparência amorfa e róseo-brilhante;
A hipoxia, que se refere à redução do oxigênio disponível, pode ocorrer em uma variedade de contextos clínicos. Ao contrário, na isquemia o suprimento de oxigênio e nutrientes é diminuído, mais frequentemente como consequência de obstrução mecânica no sistema arterial. Ela também pode ser causada por redução da drenagem venosa. Ao contrário da hipoxia, durante a qual a produção de energia através da glicólise anaeróbica continua, a isquemia também compromete a distribuição de substratos para a glicólise. Assim, nos tecidos isquêmicos, não apenas o metabolismo aeróbico é comprometido, mas a geração de energia anaeróbica também cessa depois que os substratos glicolíticos são exauridos ou quando a glicólise é inibida pelo acúmulo de metabólitos que normalmente poderiam ser removidos pelo fluxo sanguíneo. Por esta razão, a isquemia tende a causar lesão celular e tecidual mais rápida e intensa que a hipoxia na ausência de isquemia;
Análise Histopatológica: 
Os ensaios bioquímicos para detectar enzimas associadas a tumores, hormônios e outros marcadores tumorais no sangue não podem ser utilizados para o diagnóstico definitivo do câncer; no entanto, eles são usados com sucesso variável como testes de triagem e são úteis para monitorar a resposta à terapia ou detectar a recorrência da doença. O PSA, usado para detectar o adenocarcinoma da próstata, é um dos marcadores tumorais mais utilizados na prática clínica. Pode-se suspeitar de carcinoma prostático quando são encontrados níveis elevados de PSA no sangue. No entanto, a triagem de PSA também apresenta os problemas encontrados no uso de praticamente todo marcador tumoral. Embora os níveis de PSA estejam frequentemente elevados no câncer, os níveis de PSA também podem estar elevados no quadro de hiperplasia prostática benigna. Além disso, não existe um nível de PSA que garanta que um paciente não tenha câncer de próstata. Assim, o teste de PSA sofre de baixa sensibilidade e baixa especificidade, e seu uso como ferramenta de triagem tornou-se bastante controverso. No entanto, o ensaio de PSA é extremamente valioso para detectar doenças residuais ou recorrência após tratamento do câncer de próstata. Outros marcadores tumorais utilizados na prática clínica incluem o antígeno carcinoembrionário (CEA), que é elaborado em carcinomas do cólon, pâncreas, estômago e mama, e alfafetoproteína (AFP), que é produzida por carcinomas hepatocelulares, remanescentes do saco vitelino nas gônadas e ocasionalmente teratocarcinomas e carcinomas de células embrionárias. Como o PSA, o CEA e a AFP podem estar elevados em várias condições não neoplásicas, portanto, também não apresentam especificidade e sensibilidade necessárias para a detecção precoce do câncer, mas podem ser úteis no monitoramento da doença após o estabelecimento do diagnóstico. Com a ressecção bem-sucedida do tumor, esses marcadores desaparecem do soro; o reaparecimento quase sempre significa recorrência;
A expressão das proteínas p53, marcador de apoptose e Ki-67, marcador de proliferação celular, foi estudada em doenças neoplásicas e não-neoplásicas de pele, e os resultados sugerem que a taxa de expressão de p53 e Ki-67 reflete o grau de malignidade, nas neoplasias cutâneas examinadas. Da mesma forma, o estudo de Balassiano foi realizado, com o objetivo de validar a expressão dos marcadores Bcl-2, p53, p53 mutada, caspase-3 e Ki-67, como fatores prognósticos em hiperplasia fibrosa inflamatória, queilites actínicas e carcinomas espinocelulares de lábio inferior. A autora encontrou expressão de p53 e p53 mutada maior, nos CEC (carcinoma espinocelular), elevada expressão de Ki-67, em todas as lesões e expressão de Bcl-2 crescente, em relação à gravidade das lesões. Neste estudo, comparamos a expressão de imunomarcadores envolvidos no processo de carcinogênese: p53 e Bcl-2 (apoptose) e Ki-67 e PCNA (proliferação celular), em indivíduos portadores de CA (ceratose actínica) e CEC. O PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular), um dos marcadores de proliferação celular estudado, foi expresso uniformemente, na camada basal de todas as amostras;
A expressão do Ki-67 (o anticorpo monoclonal DVB-2, marcador de proliferação celular estudado, reconhece, em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos de parafina: o epítopo do antígeno Ki-67, sua expressão ocorre, em quase todas as fases do ciclo celular, exceto na fase G0, na qual as células repousam) e a não-expressão de Bcl2, no grupo CEC, parece indicar que, no CEC, há uma intensificação da atividade proliferativa. No entanto, no que se refere à CA, a maior expressão do p53, em relação a de Ki-67, possibilita indicar a redução da apoptose, nesse tipo de lesão, facilitando a perpetuação de células com dano no DNA não-reparado. A expressão do Ki-67 e a não-expressão de Bcl2, no grupo CEC, indica intensificação da atividade proliferativa. Ao passo que, a maior expressão de p53 e Bcl-2, no grupo CA, sugere alterações apoptóticas, e, consequente, a imortalização celular. O marcador PCNA não se mostrou eficaz, na diferenciação das lesões, porque apresentava coloração uniforme, em todas as amostras;
O p53 está frequentemente alterado nos tumores humanos, incluindo o câncer de pele, em que tais mutações foram mostradas como resultado da exposição solar. Alterações do p53 são encontradas em 50% dos casos de CBC (carcinoma basocelular), porém é difícil discernir se esse defeito do “gene supressor de tumor mais conhecido” (p53) é a causa do desenvolvimento do CBC ou se é meramente um marcador de danos causados pela luz ultravioleta. Porém, pesquisa anterior concluiu que a síntese ou a estabilização do p53 é essencial para induzir a apoptose no carcinoma basocelular;
As mutações da proteína p53 são comuns em algumas neoplasias malignas, sendo a sua detecção imunoistoquímica reflexo da alteração gênica, visto que a p53 normal não é facilmente detectada por ter curta meia-vida e baixos níveis. Entretanto, nem todos os tumores positivos para a p53 exibem mutações gênicas, e a ausência de marcação não significa ausência de envolvimento gênico. A avaliação imunoistoquímica da proteína p53 necessita de interpretação criteriosa, pois resultados falso-positivos e falso-negativos podem acontecer. Tais achados inconsistentes podem ser atribuídos, principalmente, à complexa biologia dessa proteína;
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