Replicação e transcrição do DNA

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1.Estudar a replicação do DNA (etapas, mecanismos, fatores envolvidos) e sua regulação, mecanismos de erros
e sua correção
REPLICAÇÃO DO DNA
- a replicação do DNA deve ocorrer antes da célula se dividir em duas células-filhas, na fase S do ciclo
celular
- necessários vigilância e reparo continuados da sua informação genética → está sujeito a danos
inevitáveis por agentes químicos e radiação do ambiente e por moléculas reativas que são geradas dentro
da célula.
O PAREAMENTO DAS BASES POSSIBILITA A REPLICAÇÃO DO DNA
- Cada fita da dupla-hélice de DNA tem nucleotídeos complementares à sua fita parceira (par S e S’), logo,
cada uma pode servir para síntese de uma nova fita complementar que é idêntica à sua parceira anterior.
Par S e S’.
- Assim, a informação genética no DNA pode ser copiada com precisão.
- A replicação pode envolver a cópia de bilhões de pares de nucleotídeos a cada vez que uma célula se
divide →maquinaria de replicação
- estilo de replicação é semiconservativo: cada dupla-hélice de DNA filha termina com uma das fitas de
DNA originais (velha) e uma fita que é completamente nova;
- obs.: nucleotídeo: uma pentose (ribose ou desoxirribose), um grupo fosfato e uma base nitrogenada
(guanina, timina, citosina, alanina e uracila). Nucleosídeo não tem fosfato.
A SÍNTESE DE DNA INICIA-SE NAS ORIGENS DA REPLICAÇÃO
- Dupla-hélice: as duas fitas de DNA são firmemente unidas por ligações de hidrogênio entre as bases de
ambas.
- Apenas Temperaturas próximas à da água em ebulição para separar, além da própria maquinaria de
replicação.
- As sequências de DNA, nas origens de replicação, são reconhecidas por proteínas iniciadoras, que afastam
as duas fitas de DNA, quebrando as ligações de hidrogênio (individualmente é uma ligação fraca). Separa
um porção de DNA por vez e não precisa de muita energia.
- obs.: par de bases A-T tem menos ligações que G-C, logo, é mais fácil de ser separado, e costumam ser
encontrados nas origens de replicação;
- Bactéria só tem uma origem de replicação. O humano tem em média 200 por cromossomo. Assim, ao
iniciar a replicação do DNA em muitos pontos diferentes de uma só vez, o tempo que uma célula necessita
para copiar seu genoma inteiro é grandemente diminuído.
- Uma vez que uma proteína iniciadora se ligue ao DNA em uma origem de replicação e localmente abra a
dupla-hélice, ela atrai um grupo de proteínas que realizam a replicação do DNA. Essas proteínas formam
uma máquina de replicação, na qual cada proteína desempenha uma função específica.
DUAS FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO SÃO FORMADAS EM CADA ORIGEM DE REPLICAÇÃO
- forquilhas de replicação: duas junções na forma de Y na lateral da parte aberta do DNA. -<>-
- As forquilhas afastam-se de cada origem de replicação em direções opostas e em cada uma, uma máquina
de replicação move-se ao longo do DNA, abrindo as duas fitas da dupla-hélice e usando cada fita como um
molde para produzir uma nova fita-filha. A replicação é, portanto, bidirecional.
- Forquilhas se movem rápido. Processam 100 pares de nucleotídeos por segundo em humanos.
A DNA-POLIMERASE SINTETIZA DNA USANDO UMA FITA PARENTAL COMO MOLDE
- O movimento da forquilha é impulsionado pela máquina de replicação, onde tem a DNA-polimerase.
- Essa enzima catalisa a adição de nucleotídeos à extremidade 3’ de uma fita de DNA em crescimento
- Só vai ser selecionado o nucleotídeo (A, G, T, ou C) que pareie com a fita de molde, resultando por fim em
uma fita de DNA que é complementar em sequência nucleotídica à fita-molde.
- A reação de polimerização envolve a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 3’ de
uma cadeia de DNA crescente e o grupo 5’-fosfato do nucleotídeo a ser incorporado, que entra na reação
como um trifosfato de desoxirribonucleosídeo. (GTP, ATP, UTP…).
- Ele mesmo fornece a energia para polimerização: um fosfato se liga na extremidade 3 do nucleotídeo, e a
hidrólise de uma de suas ligações de fosfato de alta energia abastece a reação que acopla os monômeros
de nucleotídeos à cadeia, liberando pirofosfato. O pirofosfato é, por sua vez, hidrolisado a fosfato
inorgânico (Pi ), o que torna a reação de polimerização efetivamente irreversível
- A DNA-polimerase não se dissocia do DNA para um novo nucleotídeo à fita em crescimento; se move ao
longo dele.
A FORQUILHA DE REPLICAÇÃO É ASSIMÉTRICA
- Como duas fitas na dupla-hélice molde são antiparalelas (se direciona pela polaridade da cadeia principal
açucar-fosfato), em cada forquilha, uma nova fita é formada na direção 5’-3’ (polimerização nesse sentido)
enquanto o molde está em direção 3’-5’. Portanto, a forquilha de replicação
é assimétrica.
- Parece que as duas novas fitas de DNA são sintetizadas na mesma direção
(para qual a forquilha de replicação está se movendo). Porém uma fita é
sintetizada na direção 5’-3’ e a outra na direção 3’-5’.
- NÃO TEM UMA DNA POLIMERASE PARA CADA DIREÇÃO. → todas as
DNA-polimerases adicionam novas subunidades somente à extremidade
3’ de uma fita de DNA
- Isso resume o que ocorre em uma forquilha. Já na outra, …..
- A fita de DNA que parece crescer na direção 3’-5’ incorreta é produzida descontinuamente, em pequenas
porções, com a DNA-polimerase movendo-se para trás com respeito à direção do movimento da forquilha
de replicação, de tal modo que cada novo fragmento de DNA possa ser polimerizado na direção 5’-3’
- As porções de DNA resultantes - fragmentos de Okazaki são posteriormente unidas (pela DNA ligase)para
formar uma nova fita contínua. A fita de DNA que é produzida descontinuamente desse modo é
denominada fita retardada (lagging), porque o pesponto resulta em um pequeno atraso na sua síntese; a
outra fita, que é sintetizada continuamente, é denominada fita líder (leading)
- Logo, as forquilhas tem fitas líder e retardadas, graças ao fato de que a DNA polimerase funciona somente
na direção 5’-3’.
A DNA POLIMERASE É AUTOCORRETIVA
- A taxa de erro da DNA-polimerase é mínima: um a cada 10’7 pares de nucleotídeos que ela copia.
- Ainda que A-T e C-G sejam os pares de bases mais estáveis, outros pares, menos estáveis como
G-T e C-A, também podem ser formados. >> se fossem mais frequentes, resultaria em acúmulo de
mutações.
- A DNA-polimerase tem duas qualidades que aumentam a precisão:
- Primeiro, a enzima monitora o pareamento de bases entre o nucleotídeo a ser incorporado e a
fita molde. Somente quando a correspondência for correta a DNA-polimerase irá catalisar a
reação de adição do nucleotídeo.
- Segundo, quando a DNA-polimerase comete um raro engano e adiciona um nucleotídeo errado,
ela pode corrigir o erro por autocorreção (proofreading), durante a síntese de DNA. Remove o
nucleotídeo mal pareado e tenta novamente.
- Essa autocorreção é realizada por uma nuclease que cliva a cadeia principal fosfodiéster
- Uma DNA-polimerase hipotética que sintetize na direção 3’-5’ (e iria desse modo prescindir do
mecanismo de pesponto) não seria capaz de realizar a autocorreção: se removesse um nucleotídeo
pareado incorretamente, a polimerase criaria um impasse químico – uma cadeia que não poderia mais ser
alongada
PEQUENOS TRECHOS DE RNA ATUAM COMO INICIADORES PARA A SÍNTESE DE DNA
- A DNA-polimerase é incapaz de iniciar uma nova cadeia (fita filha) de DNA desde o princípio. Para que o
processo seja iniciado, é necessário uma enzima, a primase, para iniciar uma nova fita polinucleotídica
simplesmente unindo dois nucleotídeos (parental e filha), sem a exigência de uma extremidade com bases
pareadas
- Ela sintetiza um pequeno fragmento de RNA usando a fita de DNA como um molde. Esse mini RNA (cerca
de 10 nucleotídeos), pareado com a fita molde, fornece uma extremidade 5’ e uma 3’ pareada como um
sítio de início para a DNA-polimerase. O RNA atua como iniciador ou primer, e a enzima é a primase
- Diferenças RNA e DNA: ribose em vez de desoxirribose, base uracila (U)em vez de timina(T).
- Na fita retardada, na qual a síntese do DNA é descontínua,são necessárias várias primases para iniciar os
fragmentos. Feitos os primers e o alongamento deles, depois a DNA polimerase I chega para retirar os
primers e vai sintetizar um fragmento de DNA para preencher o espaço antes dos primers. Então a DNA
ligase faz a ligação entre os fragmentos de Okasaki e os novos formados
AS PROTEÍNAS NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO COOPERAM PARA FORMAR UMA MÁQUINA DE REPLICAÇÃO
- Cooperação de um grande número de proteínas que atuam em conjunto para abrir a dupla-hélice e
sintetizar DNA novo
- a dupla-hélice deve ser aberta à frente da forquilha de replicação para expor os nucleotídeos. Ação
conjunta da DNA helicases e proteínas ligadoras de DNA de fita simples
- A helicase acomoda-se bem na frente da máquina de replicação, onde usa a energia da hidrólise
de ATP para se autopropelir, separando as duas fitas da dupla-hélice à medida que se desloca ao
longo do DNA
- Proteínas ligadoras de DNA de fita simples se unem ao DNA de fita simples exposto pela helicase,
impedindo transitoriamente que as fitas parentais e se unam e tornem a formar os pares de bases
e mantendo-as em uma forma alongada, de tal modo que possam servir como moldes eficientes.
- DNA-topoisomerase/DNA girase: durante o processo de desenrolamento de DNA de um lado da
forquilha, o DNA no outro lado da forquilha fica mais firmemente enrolado, criando uma tensão
no DNA que pode impedir o movimento da maquinaria de replicação. Então a
DNA-topoisomerase alivia a tensão quebrando cadeias simples no DNA e depois refazendo.
- A proteína grampo deslizante, mantém a DNA-polimerase firmemente presa ao molde enquanto
ela sintetiza novas fitas de DNA. Se não, as DNA-polimerases sintetizariam apenas uma
quantidade pequena de nucleotídeos e sairia.
- O grampo deslizante forma um anel ao redor da dupla-hélice de DNA recém-formada e, ao
prender firmemente a polimerase, possibilita que a enzima se mova ao longo da fita molde sem se
desprender da mesma, à medida que sintetiza uma nova fita de DNA
- Para prender o grampo ao redor do DNA requer a atividade de outra proteína de replicação, o carregador
do grampo (clamp loader). Carregamento 1 vez na fita líder e na fita retardada o grampo é removido e
então reacoplado a cada vez que um novo fragmento de Okazaki é produzido
- As proteínas envolvidas são mantidas em um complexo multienzimático. São parte proteicas
impulsionadas por hidrólise de nucleosídeos trifosfatados
outras enzimas
- Primase
- DNA polimerase III: a própria enzima replicativa
- DNA polimerase I: remove os primers e preenche seus espaços
- RNase
- DNA ligase: liga os fragmentos de Okasaki
A TELÔMEROS: FINAL DA REPLICAÇÃO
- Quando a forquilha de replicação se aproxima da extremidade de um cromossomo: ainda que a fita líder
possa ser replicada ao longo de toda a sua extensão até a extremidade do cromossomo, a fita retardada
não pode.
- Quando o último iniciador de RNA/primer na fita retardada é removido, não há como substituí-lo
- Sem uma estratégia para lidar com esse problema, a fita retardada se tornaria mais curta em cada ciclo de
replicação do DNA; perder informação genética valiosa
- Os eucariotos solucionaram esse problema possuindo sequências nucleotídicas longas e repetidas nas
extremidades dos seus cromossomos, que são incorporadas em estruturas denominadas telômeros.
- Essas sequências atraem a telomerase.
- Usando um molde de RNA que é parte da própria enzima, a telomerase estende as extremidades da fita
retardada que está sendo replicada, adicionando múltiplas cópias da mesma sequência de DNA curta à
fita molde, ou seja, estendendo o molde para que a replicação da fita retardada seja completada
normalmente.
- Além dessa função, os telômeros formam estruturas que marcam as verdadeiras extremidades de um
cromossomo. → Isso possibilita que a célula possa distinguir, sem equívocos, entre as extremidades
naturais dos cromossomos e as quebras em fitas duplas de DNA que às vezes ocorrem acidentalmente no
meio dos cromossomos.
REPARO DO DNA
- Mutações: mudanças no DNA. Podem perturbar o desenvolvimento e a fisiologia do organismo.
- Para sobreviver e se reproduzir, os indivíduos devem ser geneticamente estáveis → precisão da replicação
e máquinas proteicas que examinam o genoma
- reparo do DNA: A maior parte dos danos ao DNA é somente temporária
DANOS AO DNA OCORREM CONTINUAMENTE NAS CÉLULAS
- DNA sujeito a colisões térmicas com outras moléculas, o que resulta em mudanças químicas importantes
neles. Além de reação ocasional com subprodutos quimicamente reativos do organismo
- Reações comuns: (1)depurinação: ocorre remoção de uma base púrica de um nucleotídeo, dando origem
a lesões que se assemelham a dentes perdidos. (2) desaminação: perda espontânea de um grupo amino
de uma citosina (C) no DNA para produzir a base uracila.
- radiação ultravioleta da luz solar: danosa. Promove a ligação covalente entre duas bases pirimídicas
adjacentes, formando, por exemplo, o dímero de timina. É a falha em reparar os dímeros de timina que se
traduz em problemas para os indivíduos portadores da doença xeroderma pigmentar.
- Se deixadas sem reparo, muitas delas levariam à substituição de um par de nucleotídeos por outro como
resultado do pareamento de bases incorreto durante a replicação ou à deleção de um ou mais pares de
nucleotídeos na fita de DNA filha após a replicação do DNA. Alguns tipos de danos ao DNA (dímeros de
timina, p. ex.) podem parar a maquinaria de replicação do DNA no sítio do dano.
- Além do dano químico, tem o causado pelo processo de replicação, quando adiciona um nucleotídeo
errado e não consegue corrigir por autorreparação.
AS CÉLULAS POSSUEM UMA VARIEDADE DE MECANISMOS PARA REPARAR O DNA
- se a sequência de uma fita é danificada acidentalmente, a informação não é perdida de modo
irrecuperável, porque uma cópia de segurança da fita alterada permanece na sequência complementar
de nucleotídeos da outra fita. → A maioria dos danos ao DNA cria estruturas que não existem na fita
correta. É fácil diferenciar
- três passos para reparar danos ao DNA:
- O DNA danificado é reconhecido e removido por um de vários mecanismos. Esses envolvem
nucleases, que clivam as ligações covalentes que unem os nucleotídeos danificados ao restante da
fita de DNA, deixando um pequeno espaço em uma fita da dupla-hélice de DNA na região
danificada
- Uma DNA-polimerase de reparo/DNA polimerase I liga-se à extremidade hidroxila 3’ da fita de
DNA clivada. Ela então preenche o espaço, produzindo uma cópia complementar da informação
armazenada na fita não danificada.
- Após o preenchimento do espaço pela DNA-polimerase de reparo, uma quebra permanece na
cadeia principal de açúcar-fosfato da fita reparada. Essa quebra na hélice é selada pela DNA-ligase,
a mesma enzima que une os fragmentos de Okazaki durante a replicação da fita retardada
- Os passos 2 e 3 são praticamente idênticos para a maioria dos danos de DNA, entretanto, o passo 1
depende de uma série de enzimas diferentes, cada uma especializada em remover diferentes tipos de
danos ao DNA
UM SISTEMA DE REPARO DO MAU PAREAMENTO DE BASES DE DNA REMOVE ERROS DE REPLICAÇÃO QUE
ESCAPAM DA AUTOCORREÇÃO
- Alguns erros ocorrem. 1 a cada 10’7, e o reparo de mau pareamento conserta 99% deles.
- Se um mau pareamento não for corrigido, resultará em mutação permanente no próximo ciclo de
replicação.
- Um complexo de proteínas de reparo do mau pareamento reconhece tal pareamento errado do DNA,
remove o segmento da fita de DNA que contém o erro, e então ressintetiza o DNA faltante.
- O reparo sempre remove um segmento da fita de DNA recém-sintetizada, e não da parental.
- Uma predisposição hereditária a certos tipos de câncer (especialmente alguns tipos de câncer de cólon) é
causada por mutações em genes que codificam proteínas de reparo do mau pareamento.
QUEBRAS DO DNA DE FITA DUPLA REQUEREM UMA ESTRATÉGIA DIFERENTE DE REPARO
- Mas o que ocorre quando ambas as fitas da dupla-hélice sãodanificadas ao mesmo tempo?
- Radiação, problemas na forquilha de replicação e vários ataques químicos podem fraturar a cadeia
principal do DNA, criando quebras de fita dupla. → podem fragmentar o cromossomo, fazendo perder
genes
- Dano difícil de ser reparado
- Duas estratégias básicas:
- união de extremidades não homólogas: unir rapidamente as extremidades quebradas, antes que
os fragmentos de DNA se separem e se percam → grupo de enzimas limpam as extremidades
quebradas e as unem novamente por ligação de DNA. Nesse processo,frequentemente se perde
nucleotídeos. Mas na maioria dos casos não cria danos adicionais.
- recombinação homóloga: estratégia alternativa, livre de erros
A RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA PODE REPARAR SEM FALHAS AS QUEBRAS DE FITA DUPLA
- O problema de reparar uma quebra de fita dupla está em encontrar um molde intacto para guiar o reparo
- se uma quebra de fita dupla ocorrer em uma dupla-hélice logo após um segmento de DNA ter sido
replicado, a dupla-hélice não danificada pode prontamente servir de molde para guiar o reparo do DNA
quebrado: a informação na fita não danificada da dupla-hélice intacta é usada para reparar a fita quebrada
complementar na outra.
- Para iniciar o reparo, uma nuclease remove as extremidades 5’ das duas fitas quebradas no sítio de
quebra. Então, com o auxílio de enzimas especializadas, uma das extremidades 3’ quebradas “invade” o
dúplex de DNA homólogo não quebrado e faz uma busca sequência para parear.
- Pareado, a fita invasora é alongada por uma DNA-polimerase de reparo, usando a fita complementar
como um molde
- Após a polimerase de reparo ultrapassar o ponto onde a quebra ocorreu, a fita recém-reparada é unida
novamente à sua parceira original, formando pareamentos de bases
- O reparo é então completado pela síntese de DNA adicional nas extremidades 3’ de ambas as fitas da
dupla-hélice quebrada.
- é necessário unicamente um cromossomo homólogo intacto para ser usado como parceiro – uma
situação que ocorre transitoriamente a cada vez que um cromossomo é duplicado
- A recombinação homóloga tem papel crucial na meiose
FALHAS NO REPARO DE DANOS AO DNA PODEM TER CONSEQUÊNCIAS GRAVES PARA UMA CÉLULA OU
ORGANISMO
UM REGISTRO DA FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO E DO REPARO DO DNA É PRESERVADO NAS SEQUÊNCIAS DOS
GENOMAS
2.Compreender a transcrição (etapas, mecanismos, fatores envolvidos) e seu controle
DO DNA AO RNA
- A informação hereditária nas células está codificada na ordem linear/sequência das quatro subunidades
de nucleotídeos diferentes que compõem o DNA.
- A transcrição é o processo pelo qual as células copiam o DNA em RNA, a partir dos seus genes. Em
seguida, as células utilizam a informação presente no RNA para a produção de proteína (tradução)
- Várias cópias idênticas de RNA podem ser feitas a partir de um mesmo gene, e cada molécula de RNA
pode direcionar a síntese de várias cópias idênticas de uma molécula proteica → permite que as células
sintetizem rapidamente grande quantidade de proteínas quando necessário.
1. PRODUÇÃO DE RNA
SEGMENTOS DA SEQUÊNCIA DE DNA SÃO TRANSCRITOS EM RNA
- O primeiro passo que uma célula dá para expressar um dos seus milhares de genes é a cópia da sequência
nucleotídica desse gene sob a forma de RNA - transcrição
- Assim como o DNA, o RNA é um polímero linear composto por quatro diferentes subunidades
nucleotídicas unidas entre si por ligações fosfodiéster. Diferenças: (1) a pentose do RNA é ribose em vez de
desoxirribose (que tem uma hidroxila a menos). Logo, seus nucleotídeos são ribonucleotídeos; (2) também
tem as bases adenina (A), guanina (G) e citosina), mas contém uracila (U) em vez de timina (T) encontrada
no DNA.
- Composição química semelhante mas estrutural diferente: DNA em hélice de fita dupla e RNA em fita
simples → importantes consequências funcionais
- Visto que a cadeia de RNA é de fita simples, ela pode dobrar-se sobre ela própria, adquirindo
diferentes conformações, exatamente como ocorre com o dobramento de uma cadeia
polipeptídica na estruturação fina de uma proteína. O DNA de fita dupla não pode dobrar-se desse
modo.
- A capacidade de dobrar-se em estruturas tridimensionais complexas permite que o RNA
desempenhe várias funções na célula (além de intermediário entre DNA e proteína)
A TRANSCRIÇÃO PRODUZ UM RNA QUE É COMPLEMENTAR A UMA DAS FITAS DO DNA
- Todo o RNA de uma célula é produzido a partir da transcrição
- A transcrição tem início com a abertura e a desespiralização de uma pequena porção da dupla-hélice de
DNA para que as bases de ambas as fitas do DNA sejam expostas
- A seguir, uma das duas fitas de DNA atuará como molde para a síntese de RNA, a outra, DNA codificador
- Os ribonucleotídeos são adicionados, um a um, à cadeia de RNA em crescimento, por pareamento. RNA
polimerase faz a ligação covalente entre os nucleotídeos. Ela não precisa de primer. Evolução, pois a
transcrição do RNA não precisa ser tão exata quanto DNA
- O transcrito de DNA é então complementar à fita de DNA molde.
- Diferenças de transcrição para replicação:
- A transcrição não é uma cópia do DNA inteiro, apenas de partes de uma fita de DNA, em RNA de
fita simples
- Diferentemente de uma fita de DNA recém-formada, a fita de RNA não permanece ligada à fita de
DNA molde. Em vez disso, em um lugar imediatamente além da região onde os ribonucleotídeos
estão sendo inseridos, a cadeia de RNA é deslocada e a hélice de DNA é reestruturada
- RNA são muito mais curtos do que DNA, por só ser formado somente a partir de certo ponto do
DNA.
- DNA 250 milhões de pares de nucleotídeos e RNA alguns milhares
- RNA-polimerases catalisam a formação de ligações fosfodiéster que unem os nucleotídeos e formam a
cadeia principal
- Ela se move sobre o DNA, desenrolando a hélice à sua frente e expondo a nova região da fita molde para
que ocorra o pareamento de bases. Assim, a cadeia de RNA é construída da extremidade 5’ para 3’.
- Os trifosfatos de ribonucleosídeos recém-chegados (ATP, CTP, UTP e GTP) fornecem a energia necessária
para a continuidade da reação
- Liberação quase imediata do RNA → permite várias transcrições no único gene em intervalo curto de
tempo. Antes de um ser formado o outro já começa. Duração média de 50s pra transcrição de um gene, e
dúzias de RNA polimerases podem agir no mesmo momento.
AS CÉLULAS PRODUZEM VÁRIOS TIPOS DE RNA
- A maioria dos genes são úteis para a produção de proteínas. As moléculas de RNA codificadas por esses
genes são chamadas de RNAs mensageiros (mRNAs) - 3 a 5% do peso seco de uma célula→ cada um a
partir de um único gene, que codifica uma única proteína.
- O produto final de outros genes, no entanto, é o próprio RNA. (não mensageiro)
- os RNAs ribossômicos (rRNAs) formam o núcleo estrutural e catalítico dos ribossomos, que
traduzem os mRNAs em proteína, e
- os RNAs transportadores (tRNAs) atuam como adaptadores que selecionam aminoácidos
específicos e os posicionam adequadamente sobre um ribossomo para serem incorporados em
uma proteína.
- Outros pequenos RNAs, denominados microRNAs (miRNAs), atuam como importantes
reguladores da expressão gênica em eucariotos
- O termo expressão gênica se refere ao processo pelo qual a informação codificada na sequência de DNA é
traduzida em um produto que desencadeia um efeito determinado em uma célula ou organismo
SINAIS NO DNA INDICAM OS PONTOS DE INÍCIO E DE TÉRMINO DE TRANSCRIÇÃO PARA A RNA-POLIMERASE
- O processo de transcrição tem início com a ligação do fator geral de transcrição TFIID a uma pequena
sequência de DNA de dupla-hélice composta por nucleotídeos T e A. Por esse motivo, essa sequência é
conhecida como TATA, ou TATA box, e a subunidade de TDFIID que reconhece é denominada proteína de
ligação a TATA. A sequência TATA box, geralmente, está localizada 25 nucleotídeos antes do sítio de início
da transcrição. Outros fatores são então reunidos, junto à RNA-polimerase II, para formar um complexo de
iniciação de transcrição completo.
- Para iniciar atranscrição, a RNA polimerase deve reconhecer o sítio de início de transcrição de um gene e
ligar-se firmemente ao DNA sobre esse ponto.
- Quando uma RNA-polimerase colide aleatoriamente com uma molécula de DNA, a enzima adere
fracamente à dupla-hélice e, em seguida, desliza rapidamente sobre ela até aderir fortemente ao DNA
somente após ter encontrado uma região do gene chamada de promotor, que contém uma sequência
específica de nucleotídeos posicionada imediatamente a montante do ponto de início para a síntese do
RNA
- A RNA-polimerase separa a dupla-hélice imediatamente em frente ao promotor, expondo um segmento
curto.
- Uma das duas fitas de DNA expostas funciona como molde para o pareamento de bases complementares
com os trifosfatos de ribonucleotídeos que aí chegam, e dois desses ribonucleotídeos são unidos pela
polimerase para dar início à síntese da cadeia de RNA
- Assim, o alongamento continua até que a enzima encontre um segundo sinal sobre o DNA, o
terminador/sítio de parada, onde a polimerase se detém e libera tanto o DNA molde quanto o transcrito
de RNA recém-sintetizado. A sequência terminadora do gene é transcrita na extremidade 3’ do RNA
recém-sintetizado.
- lembrando que a fita de DNA utilizada como molde é a fita de sentido 3’ 5’
A INICIAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS É UM PROCESSO COMPLEXO
- três tipos de RNA-polimerase: RNA-polimerase I, RNA-polimerase II e RNA-polimerase III. Essas
polimerases são responsáveis pela transcrição de diferentes tipos de genes.
- As RNA-polimerases I e III transcrevem os genes que codificam os RNAs transportadores, os RNAs
ribossômicos e vários outros RNAs que desempenham papéis estruturais e catalíticos nas células
- A RNA- polimerase II transcreve a ampla maioria dos genes de eucariotos, incluindo todos aqueles
que codificam proteínas e miRNAs
- As RNA-polimerases de eucariotos necessitam da assistência de um grande número de proteínas
acessórias para iniciar a transcrição. Entre essas proteínas acessórias, são essenciais os fatores gerais de
transcrição que devem associar-se a cada promotor, em conjunto com a polimerase
- os genes se encontram amplamente dispersos, existindo regiões de DNA não transcrito com
comprimento de até 100.000 pares de nucleotídeos entre um gene e o seguinte
- a iniciação da transcrição em eucariotos deve levar em consideração o empacotamento do DNA em
nucleossomos e em formas de cromatina estruturalmente mais compactas
A RNA- POLIMERASE DE EUCARIOTOS REQUER FATORES GERAIS DE TRANSCRIÇÃO
- e, ao contrário da RNA-polimerase bacteriana, uma RNA-polimerase II eucariótica purificada não podia,
sozinha, iniciar a transcrição
- Essas proteínas acessórias organizam-se sobre o promotor, onde posicionam a RNA-polimerase, e
separam a dupla-hélice do DNA para expor a fita molde
- O processo de montagem começa geralmente com a ligação do fator geral de transcrição TFIID a TATA box
(região do promotor com principalmente nucleotídeos T e A) do DNA, 25 nucleotídeos antes dosítio de
iníco
- o TFIID provoca uma grande distorção local na dupla-hélice de DNA, a qual atua como uma marca
sinalizadora para a subsequente montagem e agregação de outras proteínas sobre o promotor
- Uma vez que o TFIID tenha se ligado ao TATA box, os demais fatores se organizam, juntamente com a
RNA-polimerase II, para formar um complexo de iniciação de transcrição completo
- Depois de a RNA-polimerase II ter sido posicionada no promotor, ela deve ser liberada do complexo de
fatores gerais de transcrição para começar a sua tarefa de síntese de uma molécula de RNA → pra liberar,
adiciona grupos fosfato a sua cauda
- Uma vez que a transcrição tenha começado, muitos dos fatores gerais de transcrição irão se dissociar do
DNA, tornando-se, em seguida, disponíveis para iniciar outro ciclo de transcrição com uma nova molécula
de RNA-polimerase. Quando a RNA-polimerase II termina a transcrição de um gene, ela é também
liberada do DNA; os fosfatos na sua cauda são removidos por proteínas- -fosfatase, e a polimerase está
disponível para buscar um novo promotor
PROCESSAMENTO DOS mRNA
- A transcrição é apenas o primeiro passo de diferentes etapas necessárias para a produção de um mRNA.
Outras etapas essenciais incluem a modificação covalente de ambas extremidades do RNA e a remoção de
sequências de íntrons do meio do transcrito de RNA pelo processo de splicing do RNA.
- Essas etapas acontecem enquanto o RNA está sendo sintetizado, e os dois primeiros somente para formar
mRNA.
- Ambas as extremidades do mRNA eucariótico são modificadas pelo capeamento na extremidade 5’ e pela
poliadenilação na extremidade 3’. Essas extremidades especiais permitem que a célula verifique se
ambas as extremidades de uma molécula de mRNA estão presentes e, consequentemente, se a
mensagem está intacta, antes de exportar a sequência de RNA do núcleo para ser traduzida em proteína.
1. Capeamento do RNA: a primeira modificação dos pré-mRNAs eucarióticos
- Assim que a RNA-polimerase II tenha produzido aproximadamente 25 nucleotídeos de RNA, a
extremidade 5’ da nova molécula de RNA é modificada pela adição de um “quepe” que consiste em um
nucleotídeo guanina modificado.
- A reação de capeamento é realizada por três enzimas agindo sucessivamente.
- Uma fosfatase remove um fosfato da extremidade 5’ do RNA nascente.
- Uma guanil-transferase, adiciona um GMP em uma ligação reversa (5’ para 5’ em vez de 5’ para
3’).
- Uma terceira, metil-transferase, adiciona um grupo metil à guanosina.
- O quepe metil 5’ identifica a extremidade 5’ de mRNAs eucarióticos, e esta marca ajuda a célula a
distinguir os mRNAs dos outros tipos de moléculas de RNA presentes na célula.
- Por exemplo, as RNA-polimerases I e III produzem RNAs não-capeados durante a transcrição, em parte
porque essas polimerases carecem de um CTD.
- No núcleo, o quepe se liga a um complexo proteico denominado complexo de ligações ao quepe, o qual
ajuda o RNA a ser adequadamente processado e exportado.
- O quepe metil 5’ também desempenha um importante papel na tradução dos mRNAs no citosol.
SPLICING DO RNA
- Os genes eucarióticos são encontrados sob a forma de pequenos pedaços de sequências expressas ou
éxons intercaladas por sequências muito longas, as sequências intervenientes não codificantes ou
íntrons.
- Tanto as sequências de íntrons quanto de éxons são transcritas em RNA. As sequências dos íntrons são
removidas do RNA recentemente sintetizado (pré-RNA) por meio de um processo denominado splicing
de RNA. Grande parte do splicing de RNA que ocorre nas células atua na produção de mRNA. Somente
após ter ocorrido o splicing e o processamento das extremidades 5’ e 3’ esse RNA será denominado mRNA
- Cada evento de splicing remove um íntron, por meio de duas reações sequenciais de transferências de
fosforil, conhecidas como transesterificações, as quais unem dois éxons, enquanto removem o íntron sob
a forma de um “laço”.
- Uma vez que o número de ligações de fosfato de alta energia permanece o mesmo, tais reações podem
ocorrer, em princípio, sem hidrólise de trifosfatos de nucleosídeo. Entretanto, a maquinaria que catalisa o
splicing do pré-RNA é complexa, consistindo em cinco moléculas adicionais de RNA e até 200 proteínas, e
hidrolisa muitas moléculas de ATP por evento de splicing.
- Essa complexidade é presumivelmente necessária para assegurar que o splicing seja exato, sendo ao
mesmo tempo suficientemente flexível para lidar com a enorme diversidade de íntrons encontrada em
uma célula eucariótica típica.
- No contexto de uma escala de tempo evolutiva, a presença de numerosos íntrons no DNA permite que a
recombinação genética facilmente combine éxons de diferentes genes, possibilitando que genes para
novas proteínas evoluam mais facilmente por intermédio da combinação de partes de genes
preexistentes.
- Outra vantagem que é atualmente observada é o splicing de diferentes maneiras ou splicing alternativo.
Estima-se que 75% dos genes emhumanos sofram splicing alternativo, permitindo que um mesmo gene
produza um grupo correspondente de diferentes proteínas. Dessa forma, esse processo concede aos
eucariotos incrementar o já enorme potencial codificante de seus genomas.
- O splicing do RNA é realizado pelo spliceossomo. Cinco moléculas de RNA (U1, U2, U4 e U5 e U6)
relativamente pequenas, com menos de 200 nucleotídeos cada, constituem o maquinário molecular
envolvido na principal forma de splicing do pré-mRNA. Conhecidas como snRNAs ou pequenos RNAs
nucleares, cada uma é complexada com pelo menos sete subunidades proteicas para formar um snRNP
(pequena ribonucleoproteína nuclear). As snRNPs formam o cerne do spliceossomo, o grande complexo
de moléculas de RNA e de proteínas que realiza o splicing do pré-mRNA na célula
POLIADENILAÇÃO NA EXTREMIDADE 3’
- À medida que a RNA-polimerase II se aproxima do final de um gene, um mecanismo similar ao
capeamento da extremidade 5’ assegura que a extremidade 3’ do pré-mRNA seja corretamente
processada.
- Duas proteínas de subunidades múltiplas, denominadas fator de estimulação à clivagem (CstF) e fator de
especificidade de clivagem e poliadenilação (CPSF) são de especial importância. Ambas movimentam-se
com a cauda da RNA-polimerase e são transferidas à extremidade 3’ da sequência em processamento
sobre uma molécula de RNA, logo que ela emerge da RNA-polimerase.
- Uma vez que CstF e CPSF se ligam a sequências nucleotídicas específicas sobre a molécula de RNA que
está em formação, proteínas adicionais associam-se a elas para criar a extremidade 3’ do mRNA.
Inicialmente, o RNA é clivado. Logo após, uma enzima denominada poli-A-polimerase (PAP) adiciona, um
a um, aproximadamente 200 nucleotídeos A (adenina) à extremidade 3’ produzida pela clivagem. O
nucleotídeo precursor dessas adições é o ATP, e o mesmo tipo de ligações 5’ a 3’ utilizado na síntese
convencional de RNA é formado nessa situação.
- Após a clivagem da extremidade 3’ de uma molécula de pré-mRNA eucariótica, a RNA-polimerase II
continua a transcrever, em alguns casos transcrevendo até várias centenas de nucleotídeos. Mas a
polimerase logo libera a sua pressão sobre a fita-molde, e a transcrição termina.
EXPORTAÇÃO DO mRNA PARA FORA DO NÚCLEO
- Os mRNAs adequadamente processados são guiados através dos canais aquosos dos complexos do poro
nuclear (NPCs) da membrana nuclear, os quais conectam diretamente o nucleoplasma e o citosol.
Pequenas moléculas, com menos de 50.000 dáltons, podem difundir livremente através desses canais. No
entanto, a maioria das macromoléculas celulares, inclusive mRNAs complexados a proteínas, apresenta
tamanho excessivo, o que as impossibilita de atravessar os canais sem o uso de processos especiais. A
célula usa energia para o transporte ativo dessas macromoléculas em ambos os sentidos através dos
complexos do poro nuclear.
- As macromoléculas são transportadas através dos complexos do poro nuclear via receptores de transporte
nuclear, os quais, dependendo da identidade da macromolécula, as escoltam do núcleo para o citoplasma
ou vice-versa. Para que ocorra a exportação do mRNA, um receptor de transporte nuclear específico deve
ser carregado sobre o mRNA, uma etapa que, pelo menos em alguns organismos, ocorre em concerto à
clivagem e poliadenilação 3’. Uma vez que tenha auxiliado a transportar uma molécula de RNA através do
complexo do poro nuclear, o receptor de transporte se dissocia do mRNA, penetra novamente o núcleo e
exporta uma nova molécula de mRNA.
Fontes: alberts -Fundamentos da biologia molecular (4ª ed.) e SanarFlix