PROBLEMA 1

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PROBLEMA 1
1. Elucidar a composição e as características do DNA, abordando seu processo de replicação. (trazer sobre o cromossomo)
Capítulo 4 DNA, cromossomos e genomas 173
Uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) consiste em duas longas cadeias polipeptídicas compostas por quatro tipos de subunidades nucleotídicas. Cada uma dessas cadeias é conhecida como uma cadeia de DNA, ou fita de DNA. As cadeias são antiparalelas entre si, e ligações de hidrogênio entre a porção base dos nucleotídeos unem as duas cadeias. Os nucleotídeos são compostos de açúcares com cinco carbonos, aos quais um ou mais grupos fosfato estão ligados, e uma base contendo nitrogênio. No caso dos nucleotídeos do DNA, o açúcar é uma desoxirribose ligada a um único grupo fosfato (por isso o nome ácido desoxirribonucleico), e a base pode ser adenina (A), citosina (C), guanina (G) ou timina (T). Os nucleotídeos estão covalentemente ligados em uma cadeia por açúcares e fosfatos, os quais formam a estrutura principal alternada de açúcar-fosfato-açúcar-fosfato, chamada de cadeia principal. Como apenas a base difere em cada uma das quatro subunidades nucleotídicas, cada cadeia polinucleotídica no DNA assemelha-se a um colar de açúcar-fosfato (cadeia principal) do qual os quatro tipos de contas se projetam (as bases A, C, G e T). Esses mesmos símbolos (A, C, G e T) normalmente são usados para representar as quatro bases ou os quatro nucleotídeos inteiros – isto é, as bases ligadas com seus grupos fosfato e açúcar.
A forma na qual os nucleotídeos estão ligados confere uma polaridade química à fita de DNA. Se imaginarmos cada açúcar como um bloco com uma protuberância (o fosfato 5’) em um lado e uma cavidade (a hidroxila 3’) no outro (ver Figura 4-3), cada cadeia completa, formada por protuberâncias e cavidades entrelaçadas, terá todas as suas subunidades alinhadas na mesma orientação. Além disso, as duas extremidades da cadeia serão facilmente distinguíveis por apresentarem, uma delas, uma cavidade (a hidroxila 3’), e a outra, uma protuberância (o fosfato 5’). Essa polaridade na cadeia de DNA é indicada pela denominação das extremidades como extremidade 3’ e extremidade 5’, nomes derivados da orientação do açúcar desoxirribose. Em relação à sua capacidade de carregar a informação, a cadeia de nucleotídeos em uma fita de DNA, sendo direcional e linear, pode ser lida quase como as letras nesta página.
A estrutura tridimensional do DNA – a dupla-hélice de DNA – é decorrente das características químicas e estruturais de suas duas cadeias polinucleotídicas. Uma vez que essas duas cadeias são mantidas unidas por ligações de hidrogênio entre as bases das duas fitas, todas as bases estão voltadas para o interior da dupla-hélice, e a cadeia principal de açúcar-fosfato encontra-se na região externa. Em cada um dos casos, a base mais resistente, com dois anéis (uma purina), forma par com uma base com um anel único (uma pirimidina). A sempre forma par com T, e G, com C. Esse pareamento de bases complementares permite que os pares de bases sejam dispostos em um arranjo energético mais favorável no interior da dupla-hélice. Nesse arranjo, cada par de bases possui uma largura similar, mantendo a estrutura de açúcar-fosfato equidistante ao longo da molécula de DNA. Para otimizar a eficiência do empilhamento dos pares de bases, as duas cadeias principais de açúcar- -fosfato enrolam-se um sobre o outro formando uma dupla-hélice orientada à direita, completando uma volta a cada 10 pares de base. Os membros de cada par de bases somente encaixam-se na dupla-hélice se as duas fitas da hélice estiverem na posição antiparalela – isto é, somente se a polaridade de uma fita estiver em orientação oposta à da outra fita. Uma consequência da estrutura do DNA e do pareamento de bases é que cada fita de uma molécula de DNA contém uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar à sequência de nucleotídeos da outra fita.
Como a informação genética para especificar um organismo poderia ser armazenada em uma forma química? E, segundo, como essa informação poderia ser duplicada e copiada de geração a geração? A resposta à primeira pergunta veio da compreensão de que o DNA é um polímero linear, formado por quatro tipos de monômeros, ordenados em uma sequência definida, como as letras em um documento escrito com o alfabeto. A resposta à segunda questão veio da natureza helicoidal dupla da sua estrutura: como cada fita de DNA contém uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar à sequência de nucleotídeos da fita associada, cada fita pode atuar como um molde para a síntese de uma nova fita complementar. Em outras palavras, se designarmos as duas fitas de DNA com S e S’, a fita S pode servir como um molde para síntese de uma nova fita S’, enquanto a fita S’ pode ser usada como molde para fazer uma nova fita S. Assim, a informação genética no DNA pode ser fielmente copiada por meio de um processo simples no qual a fita S separa-se da fita S e cada fita separada atua como molde para a produção de novas fitas complementares idênticas a sua fita associada. A capacidade de cada fita de DNA de atuar como um molde para a produção de uma fita complementar permite que a célula possa copiar ou replicar seus genes antes de passá-los a suas descendentes.
Os organismos diferem uns dos outros porque suas respectivas moléculas de DNA possuem diferentes sequências de nucleotídeos e, consequentemente, carregam diferentes mensagens biológicas. No entanto, como esse alfabeto é usado para produzir as mensagens e o que elas significam? Como discutido anteriormente, antes que a estrutura da molécula de DNA fosse determinada, sabia-se que os genes continham as instruções para produzir as proteínas. Se os genes são formados por DNA, este deve, de alguma forma, codificar proteínas (Figura 4-7). Como apresentado no Capítulo 3, as propriedades de uma proteína – que são responsáveis pela sua função biológica – são determinadas pela sua estrutura tridimensional. Essa estrutura, por sua vez, é determinada pela sequência linear de aminoácidos que a compõe. A sequência linear de nucleotídeos em um gene deve, portanto, corresponder à sequência linear de aminoácidos em uma proteína. A correspondência exata entre as quatro letras do alfabeto de nucleotídeos do DNA e as 20 letras do alfabeto dos aminoácidos das proteínas – o código genético – não é óbvia a partir da estrutura do DNA e somente foi compreendida uma década após a descoberta da dupla-hélice.
O conteúdo total da informação de um organismo é o seu genoma, que codifica todas as moléculas de RNA e proteínas que o organismo poderá sintetizar durante toda vida. (O termo genoma também é usado para descrever o DNA que contém essa informação.) A quantidade de informação contida nos genomas é impressionante. A sequência nucleotídica de um gene humano muito pequeno, escrito na forma do alfabeto de quatro nucleotídeos, ocupa um quarto de página de texto, enquanto a sequência completa de nucleotídeos do genoma humano preencheria mais de mil livros do tamanho deste. Além de outras informações essenciais, nosso genoma inclui aproximadamente 21 mil genes que codificam proteínas, os quais (por meio de splicing alternativo) originam um número muito maior de proteínas diferentes.
A função mais importante do DNA é carregar os genes, a informação que especifica todas as moléculas de RNA e proteínas que formam um organismo – incluindo a informação sobre quando, em quais tipos celulares e quais as quantidades de cada molécula de RNA e de proteínas devem ser produzidas. O DNA nuclear dos eucariotos é dividido em cromossomos e, nesta seção, veremos como os genes estão organizados em cada cromossomo. Além disso, descreveremos as sequências especializadas de DNA que permitem que os cromossomos sejam precisamente duplicados como uma entidade separada e passados de uma geração para outra. A complexa tarefa de compactar o DNA é realizada por proteínas especializadas que se ligam ao DNA e fazem seu enovelamento, gerando uma série de espiraise alças ordenadas com níveis crescentes de organização e evitam que o DNA se torne um emaranhado desordenado. Apesar de estar fortemente compactado, é surpreendente como o DNA permanece acessível às diversas proteínas dentro da célula, que o replicam, reparam e utilizam seus genes para produzir as moléculas de RNA e as proteínas.
Cada cromossomo em uma célula eucariótica consiste em uma única e enorme molécula de DNA linear juntamente com proteínas que enovelam e empacotam a fina fita de DNA em uma estrutura mais compacta. Além das proteínas envolvidas na compactação, os cromossomos estão associados a várias outras proteínas (e a diversas moléculas de RNA). Estas são necessárias para os processos de expressão gênica, replicação e reparo do DNA. O complexo que engloba o DNA e as proteínas fortemente associadas é chamado de cromatina (do grego, chroma, “cor”, devido às suas propriedades de coloração). As bactérias não possuem um compartimento nuclear especial e normalmente transportam seus genes em uma única molécula de DNA, muitas vezes circular. Esse DNA também está associado a proteínas que o empacotam e o condensam, mas elas são diferentes das proteínas que desempenham essas funções em eucariotos. Embora o DNA bacteriano e suas proteínas acessórias sejam normalmente chamadas de “cromossomo” bacteriano, ele não possui a mesma estrutura dos cromossomos eucarióticos e sabe-se menos sobre a compactação do DNA bacteriano. Portanto, nossa discussão sobre a estrutura dos cromossomos será quase inteiramente sobre os cromossomos de eucariotos.
Cada núcleo celular humano contém duas cópias de cada cromossomo, uma herdada da mãe e outra herdada do pai. Os cromossomos maternos e paternos de um par são chamados de cromossomos homólogos. O único par de cromossomos não homólogos é o dos cromossomos sexuais do macho, onde um cromossomo Y é herdado do pai e um cromossomo X é herdado da mãe. Assim, cada célula humana contém um total de 46 cromossomos – 22 pares comuns, tanto para indivíduos masculinos quanto femininos – mais os dois cromossomos sexuais (X e Y nos indivíduos do sexo masculino e dois X nos indivíduos do sexo feminino). Esses cromossomos humanos podem ser facilmente distinguidos pela “coloração” de cada um com uma cor diferente.
Para formar um cromossomo funcional, uma molécula de DNA deve fazer mais do que simplesmente transportar os genes. Ela deve ser capaz de replicar, e as cópias replicadas devem ser separadas e fielmente divididas entre as duas células-filhas a cada divisão celular. Esse processo ocorre por meio de uma série de estágios ordenados conhecidos coletivamente como ciclo celular, que fornece uma separação temporal entre a duplicação dos cromossomos e sua separação entre as duas células-filhas.
Resumidamente, durante a longa interfase, os genes são expressos e os cromossomos são replicados, e as duas réplicas são mantidas unidas formando um par de cromátides-irmãs. Durante esse período, os cromossomos estão estendidos e muito de sua cromatina está disposta no núcleo na forma de longas linhas enroladas, de modo que os cromossomos individuais não podem ser distinguidos facilmente. Apenas durante um período muito breve da mitose, os cromossomos são condensados, permitindo que as duas cromátides-irmãs sejam separadas e distribuídas aos núcleos-filhos. Os cromossomos altamente condensados nas células em divisão são denominados cromossomos mitóticos. Essa é a forma na qual os cromossomos são mais facilmente visualizados.
Cada cromossomo atua como uma unidade estrutural distinta: para que uma cópia possa ser transmitida a cada célula-filha durante a divisão, cada cromossomo deve ser capaz de se replicar, e a nova cópia replicada deve, subsequentemente, ser separada e dividida corretamente entre as duas células-filhas. Essas funções básicas são controladas por três tipos de sequências nucleotídicas especializadas no DNA, às quais se ligam proteínas específicas que direcionam a maquinaria que replica e segrega os cromossomos
Um tipo de sequência nucleotídica atua como origem de replicação do DNA, o local em que a duplicação do DNA é iniciada. Os cromossomos eucarióticos contêm muitas origens de replicação para assegurar que todo o cromossomo seja replicado rapidamente. Após a replicação do DNA, as duas cromátides-irmãs que formam cada cromossomo permanecem unidas uma à outra e, com a progressão do ciclo celular, são mais condensadas para produzir cromossomos mitóticos. A presença de uma segunda sequência especializada de DNA, chamada de centrômero, permite que uma cópia de cada cromossomo duplicado e condensado seja levada para cada célula-filha no momento da divisão celular. Um complexo proteico chamado de cinetocoro é formado no centrômero e liga o fuso mitótico aos cromossomos duplicados, permitindo que eles sejam separados. Uma terceira sequência especializada de DNA forma os telômeros, as extremidades dos cromossomos. Os telômeros contêm sequências nucleotídicas repetidas que permitem que as extremidades dos cromossomos sejam replicadas de maneira eficiente. Os telômeros também desempenham uma outra função: as sequências de DNA repetidas, juntamente com as regiões adjacentes a elas, formam estruturas que evitam que as extremidades cromossômicas sejam confundidas com uma molécula de DNA quebrada que necessita de reparo pela célula.
As proteínas que se ligam ao DNA e formam os cromossomos eucarióticos são divididas em duas classes: as histonas e as proteínas cromossômicas não histonas, cada uma contribuindo com cerca da mesma massa no cromossomo que o DNA. O complexo dessas duas classes de proteínas com o DNA nuclear eucariótico é conhecido como cromatina
As histonas são responsáveis pelo primeiro e mais básico nível de organização cromossômica, o nucleossomo, um complexo de DNA-proteína descoberto em 1974. Quando o núcleo interfásico é delicadamente rompido, e seu conteúdo examinado sob microscópio eletrônico, a maior parte da cromatina parece estar na forma de uma fibra com 30 nm de diâmetro. Se essa cromatina for submetida a um tratamento que a desenrole parcialmente, observa-se, ao microscópio eletrônico, uma série de “contas em um colar”. O colar é o DNA, e cada conta é uma “partícula do cerne do nucleossomo”, que consiste em DNA enrolado em um núcleo de histonas. A organização estrutural dos nucleossomos foi determinada após seu isolamento da cromatina compactada pela digestão com enzimas específicas (chamadas de nucleases) que degrada o DNA clivando-o entre os cernes dos nucleossomos. Após digestão por um curto período, o DNA exposto entre as partículas dos nucleossomos, chamado de DNA de ligação, é degradado. Cada partícula do cerne nucleossômico individual consiste em um complexo de oito proteínas histonas – duas moléculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 – e a fita dupla de DNA, com 147 nucleotídeos de comprimento. O octâmero de histonas forma um cerne proteico ao redor do qual a fita dupla de DNA é enrolada.
2. Explanar o processo de replicação e reparo do DNA
CAPÍTULO 5- Replicação, reparo e recombinação do DNA
Apenas a replicação do DNA na direção 5´-3´permite correção eficiente de erros 
A necessidade da alta precisão provavelmente explica por que a replicação do DNA ocorre apenas na direção 5´-3´. Caso existisse uma DNA-polimerase capaz de adicionar desoxirribonucleosídeos trifosfatos na direção 3´-5´, a própria extremidade 5´ da cadeia, em vez do mononucleotídeo a ser incorporado, teria que fornecer o trifosfato ativado necessário à ligação covalente. Nesse caso, os erros na polimerização não poderiam ser simplesmente hidrolisados, pois a extremidade 5´ da cadeia assim formada imediatamente terminaria a síntese de DNA. Portanto, a correção de uma base mal pareada é possível apenas se esta for adicionada à extremidade 3´ da cadeia de DNA. Embora o mecanismo de replicação da fita retardada pareça complexo, ele preserva a direção de polimerização 5´-3´ necessária à atividade de correção exonucleolítica. Apesar dos mecanismos para preservar o DNA contra erros dereplicação, as DNA- -polimerases eventualmente cometem erros. Entretanto, como veremos mais adiante, as células têm uma outra oportunidade de corrigir esses erros por um processo chamado de reparo de pareamento incorreto.
O uso de um DNA-molde é o processo pelo qual a sequência de nucleotídeos de uma fita é copiada em uma sequência complementar de DNA. Esse processo exige a separação da hélice de DNA em duas fitas-molde e implica no reconhecimento, de cada nucleotídeo nas fitas-molde de DNA, por um nucleotídeo complementar livre (não polimerizado). Essa separação expõe os grupos doador e aceptor das ligações de hidrogênio em cada base do DNA, permitindo o pareamento com o nucleotídeo livre a ser incorporado e alinhando-o para a polimerização catalisada pela enzima na nova cadeia de DNA. A primeira enzima que polimeriza nucleotídeos, a DNA-polimerase, foi descoberta em 1957. Os nucleotídeos livres que servem como substratos para essa enzima são desoxirribonucleosídeos trifosfato, e sua polimerização requer um molde de DNA de fita simples.
Análises realizadas no início da década de 1960 usando cromossomos em replicação revelaram uma região de replicação localizada que se deslocava progressivamente pela dupla-hélice de DNA parental. Em razão de sua estrutura em forma de “Y”, essa região de replicação ativa é chamada de forquilha de replicação (Figura 5-6). Na forquilha de replicação, um complexo multienzimático que contém a DNA-polimerase sintetiza o DNA das duas fitas novas. Inicialmente, o mecanismo mais simples para a replicação do DNA parecia ser o crescimento contínuo das duas fitas, nucleotídeo a nucleotídeo, na forquilha de replicação, à medida que esta se desloca de uma extremidade à outra de uma molécula de DNA. No entanto, devido à orientação antiparalela das duas fitas de DNA na dupla-hélice, esse mecanismo necessitaria que uma das fitas fosse polimerizada na direção 5´-3´ e a outra na direção 3´-5´. Uma forquilha desse tipo requer duas enzimas DNA-polimerase diferentes. Entretanto, apesar de ser um modelo atraente, as DNA-polimerases nas forquilhas de replicação somente podem sintetizar na direção 5´-3´. Como ocorre o crescimento de uma fita de DNA na direção 3-5? A resposta foi primeiramente sugerida por resultados de experimentos realizados no final da década de 1960. Os pesquisadores adicionaram 3 H-timidina, altamente radioativa, a bactérias em divisão por alguns segundos, de maneira que apenas o DNA replicado mais recentemente – aquele logo atrás da forquilha de replicação – fosse marcado radioativamente. Esse experimento revelou a existência de segmentos transitórios com 1.000 a 2.000 nucleotídeos de comprimento, geralmente conhecidos como fragmentos de Okazaki, presentes na forquilha de replicação crescente. (Segmentos intermediários similares foram encontrados mais tarde na replicação de eucariotos, porém com apenas 100 a 200 nucleotídeos de comprimento.) Foi demonstrado que os fragmentos de Okazaki são polimerizados apenas na cadeia de direção 5´-3´ e são unidos após sua síntese, formando longas cadeias de DNA. Assim, a forquilha de replicação possui uma estrutura assimétrica. A fita-filha de DNA sintetizada continuamente é denominada fita-líder, ou fita contínua. Sua síntese precede levemente a síntese da fita-filha sintetizada de modo descontínuo, conhecida como fita retardada, ou fita descontínua. Na fita retardada, a direção da polimerização dos nucleotídeos é oposta à direção do crescimento da cadeia de DNA. A síntese dessa fita pelo mecanismo descontínuo e “ao contrário” significa que apenas o tipo de DNA-polimerase 5´ para 3´ é utilizado na replicação de DNA.
Se a DNA-polimerase não fizesse nada quando um pareamento errado ocorresse entre o DNA-molde e o desoxirribonucleotídeo recém-polimerizado, o nucleotídeo errado seria incorporado à cadeia nascente de DNA, produzindo mutações frequentes. A alta fidelidade da replicação do DNA depende, dessa forma, não apenas do pareamento entre as bases complementares, mas também de vários mecanismos de “correção” que atuam de forma sequencial para corrigir qualquer pareamento incorreto que possa ter ocorrido.
Na fita-líder, apenas um iniciador é necessário para o início da replicação: uma vez que a forquilha de replicação esteja estabelecida, a DNA-polimerase é continuamente apresentada à extremidade da cadeia com o pareamento ao qual irá adicionar novos nucleotídeos. No lado descontínuo da forquilha, por outro lado, cada vez que a DNA- -polimerase completa um pequeno fragmento de Okazaki (o que leva alguns segundos), ela deve novamente iniciar a síntese de um fragmento completamente novo em um sítio mais adiante na fita-molde (ver Figura 5-7). Um mecanismo especial produz uma fita iniciadora complementar necessária à DNA-polimerase. Esse mecanismo depende de uma enzima chamada de DNA-primase, que utiliza ribonucleosídeos trifosfato para sintetizar pequenos iniciadores de RNA na fita retardada (Figura 5-10). Nos eucariotos, esses iniciadores possuem cerca de 10 nucleotídeos e são produzidos em intervalos de 100 a 200 nucleotídeos na fita retardada.
Uma fita de RNA pode formar pares de bases com uma fita de DNA, produzindo uma dupla-hélice híbrida DNA-RNA, se as duas sequências forem complementares entre si. Assim, a síntese dos iniciadores de RNA é regida pelo mesmo princípio de moldes usado para sintetizar DNA. Como o iniciador de RNA contém um nucleotídeo corretamente pareado com um grupo 3´-OH em uma extremidade, ele pode ser estendido pela DNA-polimerase a partir dessa extremidade, iniciando um fragmento de Okazaki. A síntese de cada fragmento de Okazaki termina quando a DNA-polimerase encontra o iniciador de RNA ligado à extremidade 5´do fragmento anterior. Para produzir uma cadeia contínua de DNA a partir de vários fragmentos na fita retardada, um sistema especial de reparo atua rapidamente para retirar o iniciador de RNA e substituí-lo por DNA. A seguir, uma enzima chamada de DNA-ligase liga a extremidade 3´ do novo fragmento de DNA à extremidade 5´ do fragmento anterior, completando o processo. 
Para que a síntese de DNA ocorra, a dupla-hélice de DNA deve ser aberta (“desnaturada”) à frente da forquilha de replicação, de modo que o desoxirribonucleosídeo trifosfato possa formar par com a fita-molde. Entretanto, a dupla-hélice de DNA é bastante estável sob condições normais; as bases pareadas são unidas tão fortemente que são necessárias temperaturas altas, quase a temperatura de ebulição da água, para separá-las em tubos de ensaio. Por essa razão, duas proteínas de replicação adicionais – as DNA-helicases e as proteínas ligadoras de DNA de fita simples – são necessárias para promover a abetura da dupla-hélice e fornecer os moldes de DNA de fita simples para que a polimerase possa atuar. As DNA-helicases utilizam esse princípio para impulsionarem-se rapidamente sobre a fita simples de DNA. Quando encontram uma região de dupla-hélice, continuam o deslocamento sobre essa fita, interferindo e separando a hélice em até mil pares de nucleotídeos por segundo. 
As duas fitas possuem polaridades opostas, e, em princípio, as helicases poderiam desenrolar a dupla-hélice de DNA movendo-se na direção 5´-3´sobre uma fita, e na direção 3-5 sobre a outra. Ambos os tipos de helicases existem. No sistema de replicação mais bem compreendido, em bactérias, a helicase que desloca-se de 5´-3´ na fita-molde retardada parece ter uma função predominante, por razões que logo ficarão claras. As proteínas ligadoras de fita simples de DNA (SSB, single strand DNA-binding), também denominadas proteínas desestabilizadoras de hélices, ligam-se fortemente e de maneira cooperativa para expor fitas simples de DNA sem encobrir suas bases, que permanecem disponíveis como moldes. Essas proteínas são incapazes de abrir diretamente uma longa hélice de DNA, mas auxiliam as helicases, estabilizando a conformação distorcida e de fita simples. Também, por meio de ligação cooperativa, elas cobrem e estendem as regiões de DNA de fita simples, que ocorrem a todo momentono molde da fita retardada, e evitam a formação de pequenos grampos que formam-se rapidamente no DNA de fita simples. Se não forem removidos, esses grampos de hélices podem impedir a síntese de DNA catalisada pela DNA-polimerase.
O deslocamento da forquilha de replicação ao longo da fita dupla de DNA cria o chamado “problema do enrolamento”. As duas fitas parentais, que estão enroladas uma sobre a outra, devem ser desenroladas e separadas para ocorrer a replicação. Para cada 10 pares de nucleotídeos replicados na forquilha, uma volta completa na dupla-hélice parental deve ser desenrolada. Em princípio, esse desenrolamento pode ser obtido pela rotação acelerada de todo cromossomo à frente da forquilha em movimento; contudo, isso é muito desfavorável energeticamente (em especial em cromossomos longos) e, pelo contrário, o DNA à frente da forquilha de replicação torna-se supertorcido (Figura 5–20).
 Essa supertorção, por sua vez, é continuamente aliviada por proteínas conhecidas como DNA-topoisomerases. Uma DNA-topoisomerase pode ser entendida como uma nuclease reversível que se liga covalentemente a um fosfato da cadeia principal do DNA, clivando uma ligação fosfodiéster na fita de DNA. Essa reação é reversível, e a ligação fosfodiéster é regenerada quando a proteína é liberada. Um tipo de topoisomerase, chamado de topoisomerase I, produz uma clivagem temporária na fita simples; essa quebra na cadeia permite que as duas porções da hélice de DNA, formadas dos dois lados da quebra, girem livremente uma em relação à outra, usando a ligação fosfodiéster na fita oposta à quebra como ponto de suporte para a rotação. 
 
Qualquer tensão na hélice de DNA irá ditar a rotação na direção que alivia essa tensão. Como resultado, a replicação pode ocorrer com a rotação de pequenos segmentos da hélice – a porção logo à frente da forquilha. Como a ligação covalente que une a proteína DNA-topoisomerase ao fosfato do DNA mantém a energia da clivagem da ligação fosfodiéster, a religação é rápida e não requer fornecimento adicional de energia. A esse respeito, o mecanismo de religação difere daquele catalisado pela enzima DNA- -ligase, discutido anteriormente.
Um segundo tipo de DNA-topoisomerase, a topoisomerase II, forma uma ligação covalente com ambas as fitas da hélice de DNA ao mesmo tempo, formando uma quebra de fita dupla temporária na hélice. Uma vez que a molécula de topoisomerase II liga-se a um desses sítios de cruzamento, a proteína utiliza a hidrólise do ATP para executar, de maneira eficiente, um conjunto de reações: (1) clivagem reversível de uma dupla-hélice, criando uma “abertura” no DNA; (2) passagem da segunda dupla-hélice, que está próxima, pela abertura; e (3) religação da quebra e dissociação do DNA. Nos pontos de entrecruzamento produzidos pela superespiral, a passagem da dupla-hélice pela abertura ocorre na direção que reduz a espiral. Desta forma, as topoisomerases do tipo II podem aliviar a tensão do superenrolamento formada à frente da forquilha. Seu mecanismo de reação também permite que as topoisomerases do tipo II separem dois círculos entrelaçados de DNA de maneira eficiente.
 
Vimos que a síntese da fita retardada na forquilha de replicação ocorre de modo descontínuo, por um mecanismo de “voltar para trás”, produzindo pequenos fragmentos de DNA. Esse mecanismo encontra um problema especial quando a forquilha de replicação alcança a extremidade de um cromossomo linear. O iniciador de RNA final, sintetizado no molde da fita retardada não pode ser substituído por DNA porque não há uma extremidade 3´-OH disponível para a polimerase de reparo. Na ausência de um mecanismo para contornar esse problema, o DNA das extremidades de todos os cromossomos seria perdido cada vez que uma célula se dividisse. As bactérias resolveram esse problema do “final da replicação” possuindo cromossomos formados por moléculas circulares de DNA. 
Os eucariotos resolvem esse problema de um modo diferente: por meio de sequências nucleotídicas especiais nas extremidades dos cromossomos, incorporadas em estruturas denominadas telômeros . Os telômeros contêm várias repetições consecutivas de sequências curtas semelhantes em organismos tão diversos, como protozoários, fungos, plantas e mamíferos. Em humanos, a sequência da unidade de repetição é GGGTTA, sendo repetida aproximadamente mil vezes em cada telômero. As sequências de DNA telomérico são reconhecidas por proteínas ligadoras de DNA que reconhecem uma sequência específica de DNA e atraem uma enzima, chamada de telomerase, que repõe essas sequências cada vez que a célula se divide. A telomerase reconhece a extremidade de uma sequência telomérica de DNA existente e a estende na direção 5´-3´, utilizando um molde de RNA que compõe a própria enzima para sintetizar novas cópias da repetição (Figura 5-33). A parte enzimática da telomerase se assemelha às transcriptases reversas, proteínas que sintetizam DNA usando um molde de RNA, embora, nesse caso, o RNA da telomerase contribua também com grupos funcionais que tornam a catálise mais eficiente. Após a extensão da fita de DNA parental pela telomerase, a replicação da fita retardada na extremidade cromossômica pode ser completada pelas enzimas DNA-polimerases convencionais usando essas extensões como molde para a síntese da fita complementar.
REPARO DO DNA
Defeitos em um gene humano cujo produto normalmente atua no reparo de pares de bases mal pareados, resultantes de erros na replicação do DNA, podem causar uma predisposição hereditária a cânceres de cólon e alguns outros órgãos, devido a uma taxa aumentada de mutações. Em outra doença humana, o xeroderma pigmentoso (XP), os indivíduos afetados apresentam uma sensibilidade extrema à radiação ultravioleta, pois são incapazes de reparar determinados fotoprodutos no DNA. Esse defeito no reparo resulta em um aumento na taxa de mutação, o que provoca graves lesões na pele e uma suscetibilidade aumentada ao câncer de pele. Finalmente, mutações nos genes Brca1 e Brca2 comprometem um tipo de reparo de DNA conhecido como recombinação homóloga e são a causa do câncer hereditário de mama e ovário.
A informação genética só pode ser armazenada de modo estável nas sequências de DNA devido a um grande grupo de enzimas de reparo do DNA que continuamente verificam o DNA e substituem qualquer nucleotídeo danificado. A maioria dos tipos de reparo do DNA depende da presença de uma cópia separada da informação genética em cada uma das duas fitas da dupla-hélice de DNA. Portanto, uma lesão acidental em uma fita pode ser removida por uma enzima de reparo, e a fita correta é ressintetizada, tendo como referência a informação contida na fita não danificada.
As células possuem múltiplas vias para o reparo do DNA, usando diferentes enzimas que atuam em diferentes tipos de lesões. A Figura 5-41 apresenta duas das vias mais comuns. Em ambas, a lesão é removida, a sequência de DNA original é restaurada por uma DNA-polimerase que utiliza a fita não danificada como molde, e a quebra resultante na dupla-hélice é ligada pela DNA-ligase (ver Figura 5-12). As duas vias diferem na maneira pela qual a lesão é removida do DNA. A primeira via, denominada reparo por excisão de bases, envolve uma bateria de enzimas denominadas DNA-glicosilases, cada uma capaz de reconhecer um tipo específico de base alterada no DNA e de catalisar sua remoção hidrolítica.
A “lacuna” criada pela ação da DNA-glicosilase é reconhecida por uma enzima chamada endonuclease AP (AP para apúrica ou apirimídica, e endo para indicar que a nuclease cliva dentro da cadeia polinucleotídica), que cliva a cadeia principal fosfodiéster, depois do qual a lacuna resultante é corrigida (ver Figura 5-41A). A depurinação, o tipo de lesão mais frequente sofrido pelo DNA, também gera uma desoxirribose sem uma base. As depurinações são diretamente corrigidas começando pela AP nuclease, seguida pela metade inferior da via mostrada na Figura 5-41A.
 A segunda principal via de reparo é chamada de reparo por excisão de nucleotídeos. Esse mecanismo podecorrigir uma lesão causada por praticamente qualquer alteração volumosa na estrutura da dupla-hélice de DNA. Essas “lesões volumosas” incluem aquelas produzidas pela ligação covalente de bases do DNA aos hidrocarbonetos (como o carcinógeno benzopireno, encontrado na fumaça do tabaco, alcatrão e exaustão do diesel) e os vários dímeros de pirimidina (T-T, T-C e C-C) causados pela luz do sol. Nessa via, um enorme complexo multienzimático verifica o DNA à procura de distorções na dupla-hélice, em vez de uma alteração específica de bases. Uma vez encontrada uma lesão, a cadeia fosfodiéster da fita anormal é clivada nos dois lados da distorção, e a DNA-helicase remove o oligonucleotídeo de fita simples contendo a lesão. O intervalo produzido na hélice de DNA é, então, corrigido pela DNA-polimerase e pela DNA-ligase.
Se o DNA celular estiver extremamente danificado, os mecanismos de reparo discutidos anteriormente em geral não serão suficientes para corrigi-lo. Nesses casos, uma estratégia diferente, que implica risco à célula, é utilizada. As DNA-polimerases replicativas altamente precisas param quando encontram um DNA danificado, e, em emergências, as células empregam polimerases de reserva, versáteis, porém menos precisas, conhecidas como polimerases translesão, para replicar durante a lesão do DNA. As células humanas possuem sete polimerases translesão, algumas das quais capazes de reconhecer um tipo específico de lesão no DNA e adicionar corretamente o nucleotídeo necessário para restaurar a sequência inicial. Outras fazem “boas adivinhações”, especialmente quando a base do molde foi muito danificada. Essas enzimas não são tão precisas como as polimerases replicativas normais quando copiam uma sequência normal de DNA. Por exemplo, as polimerases translesão não possuem atividade de correção de leitura e são muito menos criteriosas do que as polimerases replicativas na escolha do nucleotídeo a ser inicialmente incorporado. Possivelmente por essa razão, essas polimerases translesão são capazes de adicionar apenas um ou uns poucos nucleotídeos antes que a polimerase replicativa de alta precisão continue a síntese de DNA. Apesar de sua utilidade em permitir a replicação de DNA muito danificado, essas polimerases translesão impõem riscos à celula, como mencionado anteriormente. Elas são provavelmente responsáveis pela maioria das mutações de substituição de bases e deleção de um único nucleotídeo que se acumulam nos genomas.
Devido à importância de manter o DNA intacto, não danificado de geração a geração, as células eucarióticas possuem um mecanismo adicional que maximiza a eficiência das enzimas de reparo do DNA: ele promove a suspensão da progressão do ciclo celular até que o reparo seja completado. Nas células de mamíferos, a presença de DNA danificado pode bloquear a progressão da fase G1 para a fase S, retardar a fase S, uma vez que já tenha sido iniciada, e bloquear a transição da fase G2 para a fase M. Esses atrasos auxiliam o reparo do DNA, fornecendo o tempo necessário para que a correção seja completada.
3. Descrever o ciclo celular e seus mecanismos de controle
Capítulo 17 Ciclo celular 963
Durante o crescimento rápido, as bactérias replicam o seu DNA quase de forma contínua. Em contraste, a replicação do DNA na maioria das células eucarióticas ocorre apenas durante uma parte do ciclo de divisão celular, chamada de fase de síntese de DNA, ou fase S (Figura 5-29). 
Nas células de mamíferos, a fase S normalmente dura cerca de 8 horas; em eucariotos mais simples, como as leveduras, a fase S pode durar cerca de 40 minutos apenas. Ao término dessa fase, cada cromossomo foi replicado e produziu duas cópias completas, que permanecem unidas pelo centrômero até a fase M (M de mitose), na sequência do ciclo.
A função básica do ciclo celular é duplicar a imensa quantidade de DNA nos cromossomos e, então, segregar as cópias em duas células-filhas geneticamente idênticas. Esses processos definem as duas principais fases do ciclo celular. A duplicação dos cromossomos ocorre durante a fase S (S de síntese de DNA), que requer de 10 a 12 horas e ocupa cerca de metade do tempo do ciclo celular de uma célula típica de mamífero. Após a fase S, a segregação dos cromossomos e a divisão celular ocorrem na fase M (M de mitose), que requer muito menos tempo (menos de 1 hora em uma célula de mamífero). A fase M compreende dois eventos principais: a divisão nuclear, ou mitose, durante a qual os cromossomos copiados são distribuídos em um par de núcleos-filhos; e a divisão citoplasmática, ou citocinese, quando a própria célula se divide em duas. Ao fim da fase S, as moléculas de DNA em cada par de cromossomos duplicados se entrelaçam e são mantidas fortemente unidas por ligações proteicas especializadas. No começo da mitose, em um estágio chamado de prófase, as duas moléculas de DNA são gradativamente desembaraçadas e condensadas em pares de bastonetes rígidos e compactos chamados de cromátides-irmãs, as quais permanecem ligadas por meio da coesão de cromátides-irmãs. Quando posteriormente o envelope nuclear se desfaz na mitose, os pares de cromátides-irmãs ficam ligados ao fuso mitótico, um gigantesco arranjo bipolar de microtúbulos. As cromátides-irmãs são fixadas a polos opostos do fuso, e, por fim, alinham-se na placa equatorial do fuso em um estágio chamado de metáfase. A destruição da coesão de cromátides-irmãs, no início da anáfase, separa as cromátides-irmãs, que são puxadas para polos opostos do fuso. Em seguida, o fuso se desfaz e os cromossomos segregados são empacotados em núcleos separados na telófase. Então, a citocinese cliva a célula em duas, de forma que cada célula-filha herde um dos dois núcleos. 
A maioria das células requer muito mais tempo para crescer e duplicar sua massa de proteínas e organelas do que o necessário para duplicar seus cromossomos e se dividir. A fim de reservar, em parte, tempo para o crescimento, a maioria dos ciclos celulares possui fases de intervalo – a fase G1 entre a fase M e a fase S, e a fase G2 entre a fase S e a mitose. Assim, o ciclo celular eucariótico é tradicionalmente dividido em quatro fases sequenciais: G1, S, G2 e M. As fases G1, S e G2 são, em conjunto, chamadas de interfase. Em uma célula humana típica se proliferando em cultura, a interfase pode ocupar 23 horas de um ciclo celular de 24 horas, com 1 hora de fase M. O crescimento celular ocorre ao longo do ciclo celular, exceto durante a mitose. As duas fases de intervalo são mais do que um simples retardo de tempo que garante o crescimento celular. Elas também dão tempo para que a célula monitore o ambiente interno e externo a fim de se assegurar de que as condições são adequadas e os preparativos estejam completos, antes que a célula se comprometa com as principais transformações da fase S e da mitose. Nesse sentido, a fase G1 é especialmente importante. Sua duração pode variar imensamente, dependendo das condições externas e de sinais extracelulares de outras células. Se as condições extracelulares forem desfavoráveis, por exemplo, as células retardam a progressão a G1 e podem entrar em um estado de repouso especializado conhecido como G0 (G zero), no qual podem permanecer por dias, semanas ou mesmo anos antes que a proliferação seja retomada. Na verdade, muitas células ficam permanentemente em G0 até que elas ou o organismo morram. Se as condições extracelulares são favoráveis e os sinais para crescer e se dividir estão presentes, as células no início de G1 ou G0 avançam até um ponto de comprometimento próximo ao fim de G1. Uma vez passado esse ponto, as células se comprometem com a replicação do DNA, mesmo que os sinais extracelulares que estimulam o crescimento e a divisão celular sejam removidos.
Na maioria das células eucarióticas, o sistema de controle do ciclo celular controla a progressão do ciclo celular em três principais pontos de transição reguladora. O primeiro é o Início (ou ponto de restrição) no final de G1, onde a célula se compromete à entrada no ciclo celular e à duplicação dos cromossomos.O segundo é a transição de G2/M, onde o sistema de controle dispara um evento mitótico precoce que leva ao alinhamento de cromossomos no eixo mitótico na metáfase. O terceiro é a transição entre metáfase e anáfase, onde o sistema de controle estimula a separação das cromátides-irmãs, levando à conclusão da mitose e da citocinese. Se detecta problemas dentro ou fora da célula, o sistema de controle impede a progressão através de cada uma dessas transições. Se o sistema de controle identifica problemas na realização da replicação de DNA, por exemplo, isso manterá a célula na transição G2/M até que esses problemas sejam resolvidos. Similarmente, se as condições extracelulares não são apropriadas à proliferação celular, o sistema de controle bloqueia a progressão ao início, impedindo dessa forma a divisão celular até que as condições se tornem favoráveis.
Os componentes centrais do sistema de controle do ciclo celular são membros de uma família de cinases conhecidas como cinases dependentes de ciclinas (Cdks; do inglês, cyclin-dependent kinases). As atividades dessas cinases aumentam e diminuem à medida que a célula avança no ciclo, levando a mudanças cíclicas na fosforilação de proteínas intracelulares que iniciam ou regulam os principais eventos do ciclo celular. Um aumento na atividade de Cdk na transição G2/M, por exemplo, aumenta a fosforilação de proteínas que controlam a condensação de cromossomos, o rompimento do envelope nuclear, agrupamento no eixo e outros eventos que ocorrem nas etapas iniciais da mitose. As mudanças cíclicas na atividade das Cdks são controladas por um complexo arranjo de enzimas e outras proteínas. O mais importante desses reguladores das Cdks são proteínas conhecidas como ciclinas. As Cdks, como implica o nome, são dependentes de ciclinas para sua atividade: a menos que estejam fortemente ligadas a uma ciclina, elas não têm atividade de cinase. As ciclinas foram originalmente denominadas desse modo porque sofrem um ciclo de síntese e degradação a cada ciclo celular. Os níveis de proteínas Cdk, ao contrário, são constantes. As modificações cíclicas nos níveis das proteínas ciclinas resultam no agrupamento e ativação cíclicos dos complexos ciclina-Cdk nos estágios específicos do ciclo celular. Existem quatro classes de ciclinas, cada uma definida pelo estágio do ciclo celular no qual se ligam às Cdks e em que atuam. Todas as células eucarióticas necessitam de três dessas classes:
1. As G1/S-ciclinas ativam Cdks no final de G1 e, com isso, ajudam a desencadear a progressão ao Início, resultando no comprometimento à entrada no ciclo celular. Seus níveis diminuem na fase S.
 2. As S-ciclinas se ligam a Cdks logo após a progressão ao Início e ajudam a estimular a duplicação dos cromossomos. Os níveis das S-ciclinas permanecem elevados até a mitose, e essas ciclinas também contribuem ao controle de alguns eventos mitóticos iniciais. 
3. As M-ciclinas ativam Cdks que estimulam a entrada na mitose na transição G2/M. Os níveis de M-ciclinas diminuem na metade da mitose.
Como diferentes complexos de ciclina-Cdk desencadeiam diferentes eventos do ciclo celular? A resposta, ao menos em parte, parece ser que a proteína ciclina não somente ativa sua Cdk parceira, mas também a direciona para proteínas-alvo específicas. Como resultado, cada complexo de ciclina-Cdk fosforila um conjunto diferente de proteínas-substrato. O mesmo complexo de ciclina-Cdk também pode induzir diferentes efeitos em diferentes tempos do ciclo, provavelmente porque a acessibilidade de alguns substratos das Cdks muda durante o ciclo celular. Certas proteínas que atuam na mitose, por exemplo, podem ser disponibilizadas à fosforilação somente em G2.
Estudos estruturais em três dimensões de proteínas Cdk e ciclinas têm revelado que, na ausência de ciclinas, o sítio ativo na proteína Cdk é parcialmente obstruído por uma alça proteica, como uma pedra bloqueia a entrada de uma caverna. A ciclina ligada faz a alça se mover do sítio ativo, resultando em uma ativação parcial da enzima Cdk. A ativação total do complexo de ciclina-Cdk ocorre, então, quando uma outra cinase, a cinase ativadora de Cdk (CAK; do inglês, Cdk-activating kinase), fosforila um aminoácido próximo à entrada do sítio ativo da Cdk. Isso causa uma pequena mudança conformacional que aumenta ainda mais a atividade da Cdk, permitindo que a cinase fosforile de maneira eficiente suas proteínas-alvo e, desse modo, induza eventos específicos do ciclo celular. 
O aumento e a diminuição dos níveis de ciclinas são os determinantes primordiais da atividade das Cdks durante o ciclo celular. Contudo, vários mecanismos adicionais ajudam a controlar a atividade das Cdks em estágios específicos do ciclo. A fosforilação de um par de aminoácidos na cavidade do sítio ativo da cinase inibe a atividade de um complexo de ciclina-Cdk. A fosforilação desses sítios por uma cinase conhecida como Wee1 inibe a atividade das Cdks, enquanto a desfosforilação desses sítios por uma fosfatase conhecida como Cdc25 aumenta a atividade das Cdks.
 
A ligação de proteínas inibidoras Cdk (CKIs) inativam complexos ciclina-Cdk. A estrutura tridimensional de um complexo de ciclina-Cdk-CKI revela que a ligação de CKI estimula um grande rearranjo na estrutura do sítio ativo da Cdk1, tornando-o inativo. 
Enquanto a ativação de complexos específicos ciclina-Cdk controla a progressão através do Início e transições G2/M, a progressão através da transição metáfase-anáfase é desencadeada não pela fosforilação proteica, mas pela degradação de proteínas, levando a estágios finais da divisão celular. O principal regulador da transição entre metáfase e anáfase é o complexo promotor da anáfase, ou ciclossomo (APC/C), um membro da família enzimática de ubiquitinas-ligase.
O APC/C catalisa a ubiquitinação e a destruição de dois tipos principais de proteínas. A primeira é a securina, que protege as ligações proteicas que mantêm os pares de cromátides-irmãs unidos no início da mitose. A destruição de securinas na metáfase ativa a protease que separa as cromátides-irmãs e desencadeia a anáfase, como descrito mais tarde. As S-ciclinas e as M-ciclinas são os segundos principais alvos do APC/C. A destruição dessas ciclinas inativa a maioria das Cdks da célula. O resultado é que muitas proteínas fosforiladas por Cdks da fase S ao início da mitose são desfosforiladas por várias fosfatases na célula em anáfase. Essa desfosforilação de alvos das Cdks é necessária para a conclusão da fase M, incluindo as etapas finais da mitose e citocinese. Seguindo sua ativação na metade da mitose, APC/C permanece ativa em G1 para fornecer um período estável de Cdk inativa. Quando G1/S-Cdk é ativada em G1 tardio, APC/C é inativado, permitindo, desse modo, um acúmulo da ciclina no próximo ciclo celular.
O sistema de controle do ciclo celular também utiliza outra ubiquitina-ligase chamada SCF. Ela tem várias funções na célula, mas seu principal papel no ciclo celular é ubiquitinar certas proteínas CKI em G1 tardio, ajudando, portanto, o controle da ativação de S-Cdks e replicação de DNA. SCF é também responsável pela destruição das ciclinas G1/S na fase S inicial. Tanto o APC/C como a SCF são grandes complexos de multissubunidades que possuem componentes em comum, mas que são diferencialmente regulados. As modificações na atividade de APC/C durante o ciclo celular, inicialmente como resultado das trocas nas suas associações com uma subunidade ativadora – tanto Cdc20 na metade da mitose ou Cdh1 a partir do final da mitose através de G1 precoce. Tais subunidades ajudam o APC/C a reconhecer suas proteínas-alvo. A atividade de SCF depende das subunidades ligadas ao substrato chamadas proteínas F-box. Contudo, diferentemente da atividade do APC/C, a atividade da SCF é constante durante o ciclo celular. Em vez disso, a ubiquitinação pela SCF é controlada por mudanças no estado de fosforilação de suas proteínas-alvo, uma vez que as subunidades de F-box reconhecem somente proteínas específicas fosforiladas.
Quando as condições para a proliferaçãocelular são adequadas, vários sinais externos e internos estimulam a ativação de G1-Cdk, que por sua vez estimula a expressão de genes que codificam G1/S-ciclinas e S-ciclinas. Então, a ativação resultante de G1/S-Cdk controla a progressão através do Início da transição. Por meio de mecanismos que discutiremos posteriormente, as G1/S-Cdks desencadeiam uma onda de atividade das S-Cdks, que inicia a duplicação dos cromossomos na fase S e também contribui para alguns eventos iniciais da mitose. Então, a ativação de M-Cdk dispara a progressão através da transição de G2/M e eventos da mitose inicial, levando ao alinhamento de pares de cromátides-irmãs na placa equatorial do eixo mitótico. Finalmente, APC/C, junto ao ativador Cdc20, dispara a degradação de securinas e ciclinas, desencadeando a separação de cromátides-irmãs e a segregação e finalização da mitose. Quando a mitose está completa, múltiplos mecanismos colaboram na supressão da atividade das Cdks, resultando em um período estável de G1.
FASE S
A replicação do DNA inicia nas origens de replicação, que estão espalhadas por numerosos locais em cada cromossomo. Durante a fase S, a replicação do DNA é iniciada nessas origens quando a helicase de DNA desenrola a dupla-hélice e as enzimas da replicação de DNA se ligam às duas fitas-molde simples. Isso leva à fase de alongamento da replicação, quando a maquinaria de replicação se distancia da origem em duas forquilhas de replicação. A fim de garantir que a duplicação dos cromossomos ocorra somente uma vez por ciclo celular, a fase de iniciação da replicação do DNA é dividida em duas etapas distintas, que ocorrem em etapas diferentes do ciclo celular. O primeiro passo ocorre na mitose tardia e G1 inicial, quando um par de helicases de DNA inativas se ligam à origem de replicação, formando um grande complexo, chamado de complexo pré-replicativo ou pré-RC. Essa etapa é ocasionalmente chamada de licenciamento das origens de replicação, pois a iniciação da síntese de DNA ocorre somente em origens que contêm um pré-RC. O segundo passo ocorre na fase S, quando helicases de DNA são ativadas, resultando no desenrolamento do DNA e no início da síntese de DNA. Uma vez que a origem de replicação tenha sido iniciada nessa via, as duas helicases se movem para fora da origem na forquilha de replicação, e a origem não pode ser reutilizada até que uma nova pré-RC seja adicionada no final da mitose. O resultado é que as origens podem ser ativadas somente uma vez por ciclo celular. 
Um fator fundamental é um grande com plexo multiproteico denominado complexo de reconhecimento da origem (ORC; do inglês, origin recognition complex), que se liga às origens de replicação no decorrer do ciclo celular. Na mitose tardia e em G1 precoce, as proteínas Cdc6 e Cdt1 colaboram com ORC para ligar as helicases inativas ao DNA, perto da origem. O grande complexo resultante é o pré-RC, estando, então, a origem pronta para a replicação. No início da fase S, S-Cdk desencadeia a ativação da origem pela fosforilação específica de proteínas iniciadoras, as quais promovem a formação de um grande complexo proteico que ativa a helicase de DNA e recruta a maquinaria para síntese de DNA. Outra proteína-cinase chamada DDK também é ativada na fase S e ajuda a desencadear a ativação da origem pela fosforilação específica de subunidades da helicase de DNA. Ao mesmo tempo que S-Cdk inicia a replicação de DNA, muitos mecanismos previnem a ligação de novas pré-RCs. S-Cdk fosforila e dessa forma inibe proteínas ORC e Cdc6. A inativação do APC/C no final de G1 também ajuda a evitar a formação do pré- RC. Na mitose tardia e G1 precoce, APC/C desencadeia a degradação de um inibidor Cdt1 chamado geminina, permitindo, assim, que Cdt1 se torne ativa. Quando APC/C é inativada em G1 tardia, ocorre o acúmulo de geminina e a inibição de Cdt1 que não está associada ao DNA. Também, a associação de Cdt1 com uma proteína na forquilha de replicação ativa, estimula a degradação de Cdt1. Nessas várias vias, a formação de pré-RC é impedida da fase S à mitose, assegurando, dessa forma, que cada origem seja ativada apenas uma vez por ciclo celular.
MITOSE
A mitose é tradicionalmente dividida em cinco etapas – prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase –, inicialmente definidas com base no comportamento do cromossomo como visto em microscópio. Uma vez concluída a mitose, o segundo principal evento da fase M – citocinese – divide a célula em duas metades, cada uma com um núcleo idêntico. De um ponto de vista de regulação, a mitose pode ser dividida em duas partes principais, cada uma influenciada por componentes distintos do sistema de controle do ciclo celular. Primeiro, um aumento abrupto na atividade de M-Cdk na transição G2/M desencadeia eventos no início da mitose (prófase, prometáfase e metáfase). Durante esse período, a M-Cdk e várias outras cinases mitóticas fosforilam uma série de proteínas, levando à formação do fuso mitótico e à ligação deste aos pares de cromátides-irmãs. A segunda parte principal da mitose começa na transição entre metáfase e anáfase, quando o APC/C provoca a degradação da securina, liberando uma protease que cliva a coesina e, com isso, inicia a separação das cromátides-irmãs. O APC/C também promove a degradação de ciclinas, levando à inativação das Cdks e à desfosforilação de alvos das Cdks, o que é necessário a todos os eventos do final da fase M, inclusive a conclusão da anáfase, a dissociação do fuso mitótico e a divisão da célula por citocinese.
Uma das características mais notáveis do controle do ciclo celular é que uma única proteína-cinase, a M-Cdk, ocasiona todos os diversos e complexos rearranjos celulares que ocorrem nos estágios iniciais da mitose. A M-Cdk deve, no mínimo, induzir a formação do fuso mitótico e assegurar que cada cromátide-irmã de um par esteja ligada ao polo oposto do fuso. Ela também desencadeia a condensação dos cromossomos – a reorganização em grande escala das cromátides-irmãs entrelaçadas em estruturas compactas, similares a um bastão. Em células animais, a M-Cdk também promove a desintegração do envelope nuclear e rearranjos do citoesqueleto de actina e do aparelho de Golgi. Acredita-se que cada um desses processos seja iniciado quando a M-Cdk fosforila proteínas específicas envolvidas no processo, embora a maioria dessas proteínas ainda não tenha sido identificada. A M-Cdk não atua sozinha na fosforilação de proteínas-chave envolvidas no início da mitose. Duas famílias adicionais de cinases, as cinases similares a Polo e as cinases Aurora, também dão importantes contribuições ao controle dos eventos mitóticos iniciais. A cinase Plk similar a Polo, por exemplo, é necessária à formação normal de um fuso mitótico bipolar, em parte porque fosforila proteínas envolvidas na separação dos polos do fuso no início da mitose. A cinase Aurora A também ajuda a controlar proteínas que promovem a formação e a estabilidade do fuso, ao passo que a Aurora B controla a ligação das cromátides-irmãs ao fuso, como discutiremos a seguir.
Na maioria dos tipos celulares, a síntese de M-ciclina aumenta durante G2 e M, devido principalmente ao aumento da transcrição do gene M- ciclina. O aumento da proteína M-ciclina leva a um correspondente acúmulo da M-Cdk (o complexo de Cdk1 e M-ciclina) à medida que a célula se aproxima da mitose. Embora nesses complexos a Cdk seja fosforilada em um sítio ativador pela cinase ativadora e Cdk (CAK), como anteriormente discutido, a cinase Wee1 a mantém em um estado inativo, por meio de fosforilação inibidora em dois sítios adjacentes (ver Figura 17-13). Assim, no momento em que a célula chega o fim de G2, ela contém um estoque abundante de M-Cdk, que está preparada e pronta para agir, mas está inibida por fosfatos que bloqueiam o sítio ativo da cinase. O que então desencadeia a ativação do estoque de M-Cdk? O evento crucial é a ativação da proteína-fosfatase Cdc25, que remove os fosfatos inibidores que restringem a M-Cdk (Figura 17-20). Ao mesmo tempo, a atividade inibidora da cinase Wee1é suprimida, assegurando ainda mais que a atividade da M-Cdk aumente. Os mecanismos que desencadeiam a atividade da Cdc25 no início da mitose não são bem entendidos. Uma possibilidade é que as S-Cdks que estão ativas em G2 e no início da prófase estimulem a Cdc25. Curiosamente, a Cdc25 também pode ser ativada, ao menos em parte, pelo seu alvo, a M-Cdk. A M-Cdk também pode inibir a cinase inibidora Wee1. A capacidade da M-Cdk de ativar seu próprio ativador (Cdc25) e inibir seu próprio inibidor (Wee1) sugere que a ativação da M-Cdk na mitose envolve ciclos de retroalimentação positiva.
CITOCINESE 
A etapa final do ciclo celular é a citocinese, a divisão do citoplasma. Em muitas células, a citocinese segue cada mitose, embora algumas delas, como as células embrionárias iniciais da Drosophila e alguns hepatócitos de mamíferos e células musculares cardíacas, entram em mitose sem citocinese e, dessa forma, adquirem múltiplos núcleos. Na maioria das células animais, a citocinese começa na anáfase e termina pouco depois da conclusão da mitose na telófase. A primeira mudança visível da citocinese em uma célula animal é o aparecimento repentino de uma reentrância, ou sulco de clivagem, na superfície celular. O sulco rapidamente se torna mais profundo e se espalha ao redor da célula, até dividir completamente a célula em duas. A estrutura subjacente a esse processo é o anel contrátil – um agrupamento dinâmico composto por filamentos de actina, filamentos de miosina II e muitas proteínas estruturais e reguladoras. Durante a anáfase, o anel se forma logo abaixo da membrana plasmática. O anel gradativamente se contrai, e, ao mesmo tempo, a fusão de vesículas intracelulares com a membrana plasmática insere novo material de membrana adjacente ao anel. Essa adição de membrana compensa o aumento na área de superfície que acompanha a divisão citoplasmática. Quando a contração do anel é concluída, a inserção e a fusão da membrana selam a lacuna entre as células-filhas.
Após a mitose concluir a formação de um par de núcleos-filhos, a citocinese finaliza o ciclo celular, dividindo a própria célula. A citocinese depende de um anel de filamentos de actina e miosina que se contrai no final da mitose em um sítio a meio caminho entre os cromossomos segregados. Em células animais, o posicionamento do anel contrátil é determinado por sinais liberados pelos microtúbulos do fuso da anáfase. A desfosforilação de alvos das Cdks, resultante da inativação das Cdks na anáfase, desencadeia a citocinese no momento correto após a anáfase. Depois da citocinese, a célula entra em um estado estável de G1 de baixa atividade das Cdks, onde aguarda por sinais para entrar em um novo ciclo celular.