Diagnósticos Moleculares de Doenças

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Conceitos Básicos do Método ELISA
O método ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) tem diversas aplicações, nas mais variadas áreas.
Quando se trata de um número grande de amostras, seu grande atrativo é o baixo custo comparado com outras técnicas.
Alternativas de automação do método também são bastante conhecidas e difundidas.
Mostramos aqui uma breve explicação deste método, em caráter introdutório, valendo-se de termos mais utilizados em análises clínicas, onde a utilização deste método é muito mais difundida.
I – Preparação
A fase da preparação por vezes não é considerada no método em sí, pois são muito difundidos os "kits" de ELISA, onde o "meio físico" (cubetas, microplacas) já vem sensibilizado com os Antígenos.
Nesta etapa o objetivo será obter um meio que contenha os Antígenos aderidos à sua "parede" (sensibilização da placa).
1. Sintetizar os vírus com a proteína do Antígeno.
2. Separar o vírus da proteína do Antígeno, por exemplo por ultrasom.
3. Centrifugar para isolar as proteínas do antígeno.
4. Sensibilizar a microplaca com os Antígenos sintetizados.
Quando se adquire um "kit" de ELISA, a microplaca ou a cubeta vem com estes Antígenos aderidos à parede da mesma.
II - Procedimento do Ensaio
A partir das Placas ou cubetas sensibilizadas com antígenos, agora o objetivo será aplicar as amostras em estudo, em busca da reação Antígeno-Anticorpo, que resultará em uma coloração.
1. Diluir amostras e incubar : 
Com anticorpos presentes, ocorrerá uma ligação Antígeno-Anticorpo.
2. Adicionar Conjugado(Enzima/ Anti-Anticorpo), Incubar :
Com anticorpos presentes ocorrerá uma ligação Antígeno -Anticorpo -Conjugado).
3. Adicionar Substrato (específico à enzima associada ao Conjugado), Incubar : 
Se o Conjugado estiver presente, o substrato fará com que a Enzima mude de cor.
Observe que entre estas etapas sempre são feitas "lavagens" da amostra. A "lavagem" consiste em se retirar o líquido, para não "carregá-lo" para a etapa seguinte.
Basicamente é dispensado e aspirado o líquido de lavagem, repetidas vezes.
III - Finalização e Leitura
1. Adicionar a Solução de Parada :
A Ação da enzima será interrompida e desenvolverá uma cor .
2. Realizar a leitura da microplaca/cubeta.
Esta leitura, em alguns casos, pode ser feita visualmente, caso deseje saber somente se é "positivo" ou "negativo".
Isto é normalmente chamado de ELISA QUALITATIVO. 
Ainda neste caso, também pode-se definir aquelas amostras "duvidosas", ou "indeterminadas", que talvez devam ser submetidas a outro tipo de teste para confirmação.
Para resultados mais precisos, com instrumentos de leitura como um Espectrofotômetro ou uma Leitora de Microplacas por Absorbância, pode-se obter até mesmo a concentração.
Este já é chamado de ELISA QUANTITATIVO.
Normalmente para isto, deve-se possuir padrões, com valores de concentração conhecidos. A partir destes padrões, pode-se traçar uma curva de calibração.
Hoje, as Leitoras de Microplacas possuem graus elevados de automação, e isto é feito rapidamente, em segundos.
Porque Lavar ?
As placas devem ser lavadas para retirar os anticorpos, o conjugado e o substrato, que não se ligaram durante o processo de preparação do Elisa.
Porém a velocidade com que o líquido é dispensado e aspirado da microplaca, deve ser controlada, constante e uniforme em todas as cavidades da placa.
Com altas velocidades, corre-se o risco de destruir as ligações que foram obtidas, pelo desprendimento do Antígeno da placa.
Conseqüência: Baixos valores de Absorbância.
Por outro lado, baixas velocidades, não serão eficientes para retirar os agentes que não se ligaram durante o processo.
Conseqüência: Altos valores de Absorbância.
Exemplo de Lavadora de Microplacas : Columbus (Tecan - Áustria).
Porque utilizar uma leitora ?
Com a utilização de uma leitora automática de microplacas, os valores de absorbância, além de serem obtidos com alta precisão, poderão ser submetidos aos cálculos necessários para a correta obtenção dos resultados.Com a leitora de microplacas Sunrise, mesmo cálculos complexos poderão ser realizados. Vantagem: Maior segurança e agilidade na obtenção de resultados.A leitora Sunrise, é capaz de realizar todos os cálculos necessários, mesmo quando não controlada pelo computador
Vantagem: Economia de espaço e de recursos de informática.
Imunofluorescência 
É uma técnica que permite a visualização de antigénios nos tecidos ou em suspensões celulares utilizando corantes fluorescentes, que absorvem luz e a emitem num determinado comprimento de onda (c. d. o.). Quando o corante está ligado ou conjugado com um anticorpo, os locais de reacção entre o antigénio e o anticorpo conjugado podem facilmente ser visualizados. Os fluorocromos mais utilizados em técnicas de imunofluorescência são a fluoresceína isocianetada (FITC) e rodamina. Os fluoroforos depois de exicitados por um comprimento de onda específico(espectro de absorção) emitem fluorescência (fotões de luz) a um comprimento de onda superior (espectro de emissão). Por exemplo o FITC tem um c. d. o. máximo de excitação a 496 nm (azul a caminho do verde) e uma emissão de fluorescência máxima a 520 (o chamado verde fluorescente). O uso combinado de filtros que barram a luz para c. d. o. previamente determinados permitem visualizar estas moleculas. Virtualmente, alguns antigénios podem ser detectados pela imunofluorescência. A combinação de sensibilidade, especificidade e simplicidade torna este método muito útil. Em muitos laboratórios de histopatologia, biópsias de rim e de pele são examinadas com técnicas de imunofluorescência, sendo a diferenciação de tumores com técnicas imunoenzimáticas para observação em microscopia de luz.
Os ensaios de imunofluorescência são de grande importância na imunologia clínica e necessitam de considerações especiais. Trata-se de uma reação imunológica revelada com um marcador.
A primeira técnica utilizada foi a imunofluorescência direta, onde se pesquisou um antígeno em uma reação com anticorpo preparado com o fluorocromo. Para este tipo de reação são utilizados anticorpos purificados específicos para um determinado antígeno ou grupo de antígenos conjugados com um fluorocromo. Esta técnica também é chamada de técnica de camada simples.
A reação da imunofluorescência indireta, ou técnica de dupla camada (Figura 16), é realizada por antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente. E por último coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. Esta técnica apresenta como vantagem à possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários. Outra vantagem é que por esta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos para diferentes tipos de antígenos e pode-se identificar qual a classe que o anticorpo pertence.
A técnica de imunofluorescência por sanduíche recebe este nome porque o antígeno fica entre dois anticorpos. Esta técnica é aplicada para estudar tecidos linfóides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido. 
(A)          (B)                  (C)
Fig. 16. Imunofluorescência indireta. O Anticorpo primário marcado com um fluorocromo (A) é excitado a emitir cor (B), que é visualizado na foto de  um lâmina (C).
Fundamentos da Técnica de PCR
Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reacção em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorrein vivo . Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. Para amplificar uma determinada região são necessários dois iniciadores complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2). Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.
Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizável, as DNA polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reacção. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado após electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de DNA.
RT-PCR é uma reação da transcriptase reversa, seguida da reação em cadeia da polimerase . Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
É necessária ligação ao RNA e a ligação da transcriptase reversa a uma "cadeia" de poli T, pois sempre ao final da cadeia de mRNA existe uma "cauda" de poli A.
A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo: células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares, por exemplo.
Inverta a reacção em cadeia do Polymerase da transcrição 
A reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição (RT-PCR) é baseada na reacção em cadeia do polymerase (PCR). É baseada mais importante no processo de transcrição reversa, que o reverso transcreve o RNA no ADN e foi isolado inicialmente dos retroviruses.
As técnicas de RT-PCR permitem a formação de cDNA (complementar ou de ADN da cópia) do RNA, que armazena a seqüência do RNA (tal como o RNA de mensageiro, mRNA) no formulário mais estável do ácido nucleico, ADN. Esta transcrição reversa do RNA em seu ADN reverso do complemento (cDNA) é a primeira etapa de um processo geralmente two-step de RT-PCR. Além disso, copiando o RNA no ADN, um pode então amplificar a seqüência do cDNA usando as primeiras demão específicas para a seqüência do ADN. Esta amplificação é a segunda etapa principal final do processo two-step de RT-PCR. 
O processo de RT-PCR 
A primeira etapa de RT-PCR é referida como a “primeira reação da costa”. Na reação da primeiro-costa, o cDNA igualmente denominado complementar do ADN, é feito do molde do RNA de mensageiro do interesse usando o descolamento oligo (ato poli-dTs similar às primeiras demão e ao ligamento aos 3 ' seqüência situada nos 3 ' UTR - região untranslated do polyA, que estão atuais em a maioria de mRNAs), dNTPs do oligonucleotide, e um polymerase de ADN RNA-dependente, inverte o transcriptase, com o processo de transcrição reversa. 
Estes fatores são combinados em um amortecedor reverso do transcriptase para 1 hora em 37°C. Depois que a reação reversa do transcriptase está completa, e o cDNA estêve sintetizado, RNaseH está adicionado (uma enzima da digestão do RNA) que digere o RNA longe do híbrido do RNA-cDNA. Após a incubação com RNaseH, o PCR ou a reacção em cadeia padrão do polymerase são conduzidos usando as primeiras demão oligo do ADN específicas para a seqüência do interesse. Esta segunda etapa é referida como a “segunda reação da costa”.
Assim adicionando o polymerase de ADN thermostable, as primeiras demão rio acima e a jusante do ADN, o único ADN encalhado transformam-se dobro encalhado e são amplificadas, permitindo a deteção de mesmo seqüências raras ou baixas do mRNA da cópia amplificando seu ADN complementar.
Aplicações de RT-PCR
A amplificação exponencial da seqüência complementar do mRNA ou as seqüências do RNA através da reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição permitem uma técnica elevada da deteção da sensibilidade, onde o baixo número de cópia ou as moléculas menos abundantes do RNA possam ser detectados. É usado igualmente para clonar seqüências do mRNA sob a forma do ADN complementar, permitindo que as bibliotecas do cDNA (bibliotecas do cDNA) sejam criadas que contêm todas as seqüências do mRNA dos genes expressados em uma pilha. Além disso, permite a criação das construções do cDNA que foram clonadas por RT-PCR e permitem a expressão dos genes a níveis do RNA e da proteína para um estudo mais adicional.