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1 Ebook Atualização em Reprodução Ultrassonografia Vacas 2 Sumário Anatomia e Fisiologia do Sistema Genital da Vaca..................................................................3 Ovários .....................................................................................................................................3 Tubas Uterinas .........................................................................................................................5 Útero ........................................................................................................................................6 Fisiologia do Ciclo Estral ...............................................................................................................9 Ciclo Estral ................................................................................................................................9 Crescimento Folicular ...............................................................................................................9 Hormônios ..............................................................................................................................10 Seleção folicular e dominância ...............................................................................................11 Diferenciação .........................................................................................................................12 Seleção do folículo dominante ...............................................................................................13 ULTRASSONOGRAFIA APLICADA A REPRODUÇÃO DE BOVINOS ..............................................16 Bases biofísicas do ultrassom .....................................................................................................16 TERMINOLOGIA ..........................................................................................................................17 ARTEFATOS.................................................................................................................................17 TRANSDUTORES .........................................................................................................................17 CUIDADOS COM O APARELHO DE ULTRASSOM .........................................................................19 LIMPEZA .....................................................................................................................................19 Aplicações na reprodução animal ..............................................................................................21 Seleção do aparelho ...................................................................................................................21 Utilização da ultrassonografia na reprodução de bovinos .........................................................22 Exame do trato genital ...............................................................................................................22 Útero ......................................................................................................................................22 Ovários ...................................................................................................................................23 Dinâmica folicular...................................................................................................................23 Monitoramento da involução uterina pós-parto ....................................................................23 Diagnóstico de gestação .........................................................................................................23 Sexagem fetal .........................................................................................................................24 Guia para punção folicular de oócitos ....................................................................................25 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................................26 3 Ultrassonografia aplicada à reprodução de bovinos Anatomia e Fisiologia do Sistema Genital da Vaca O conhecimento exato da anatomia e fisiologia dos órgãos genitais é de suma importância para melhor compreensão da semiologia e patologias do trato reprodutivo feminino, bem como para as atividades relacionadas com sincronização do ciclo estral. Pode-se subdividir o aparelho genital em órgãos produtores de gametas (ovários) e hormônios sexuais (folículos e corpos lúteos), órgãos condutores e receptores dos gametas (tubas e útero) e órgãos copuladores (vagina, vestíbulo e vulva). O aparelho reprodutivo feminino compõe-se de (Figura 01): ovários tubas uterinas útero cervix vagina vestíbulo e vulva. Figura 01- Esquema representativo do sistema reprodutivo da fêmea bovina Os órgãos genitais internos (ovários, útero, tubas e cervix) são sustentados pelo ligamento largo do útero na cavidade pélvica e abdominal. O ligamento largo é subdividido em mesovário, mesosalpinge e mesométrio. Na vaca, a união do ligamento largo é dorsolateral na região do íleo, de modo que o útero fica disposto como os cornos do carneiro, com a convexidade dorsal e os ovários localizados próximos à pelve. Ovários O ovário (Figura 02), composto de medula e córtex, é circundado pelo epitélio germinativo. A medula ovariana consiste de tecido conjuntivo fibro-elástico irregularmente distribuído, de nervos extensivos e sistemas vasculares que atingem o ovário pelo hilo. O córtex ovariano contém folículos e/ou corpos lúteos em vários estágios de desenvolvimento e regressão. O tecido conjuntivo do córtex contém muitos 4 fibroblastos, algumas fibras colágenas e reticulares, vasos sanguíneos, vasos linfáticos e nervos. Os ovários estão situados ao nível da entrada da pelve de cada lado dos cornos uterinos e conectam-se ao útero através da tuba uterina, possuindo duas funções principais: exócrina (gametogênica) e outra endócrina (produção de hormônios). A primeira é responsável pela produção de oócitos e liberação dos mesmos, enquanto a segunda responsável pela produção dos hormônios estrogênicos e progesterona principalmente. A forma dos ovários da vaca é ovoide e lembra uma amêndoa, embora a presença, ora de folículos, ora de corpos lúteos, ou mesmo de ambos, em diferentes estágios de ovulação, ou regressão possa modificá-la consideravelmente. Os folículos podem ser palpados no ovário bovino em todos os estágios do ciclo reprodutivo. Uma vesícula com parede fina (1,5 até 2,0 cm de diâmetro) e acompanhada por contractilidade pronunciada do útero é identificada como um folículo de “Graaf” (folículo pré-ovulatório). Uma vesícula palpável e com flutuação não pode ser diferenciada como folículo de “Graaf“, ou como um folículo de uma onda anovulatória. Os folículos são frequentemente palpáveis no final da primeira metade do ciclo estral – a primeira onda folicular. Neste estágio, o ovário apresentará um corpo lúteo relativamente grande, que em geral não está presente durante o estro. O ciclo estral alterado pode ser acompanhado por folículos que medem 1,5 a 2,5 cm, às vezes com parede espessa ou múltiplas vesículas adjacentes. Estas alterações são diagnosticadas como degeneração macrocística, ou degeneração microcística quando, após um novo exame 8 a 14 dias depois, a condição se mantém inalterada. Entre o segundo e o quinto dia do ciclo, não são palpadas vesículas nem estruturas sólidas (corpo lúteo). Esta aparência pode ser confundida com anestro, problema a ser resolvido por um novo exame, alguns dias após (sobretudo em animais entre o segundo e o quarto dia do ciclo, que apresentam o útero ainda bem contraído e a mucosa vaginal levemente hiperêmica e úmida, em comparação com vacas com distrofia ovariana).Um corpo lúteo pequeno e macio (corpo lúteo em desenvolvimento) pode ser palpado do quinto dia do ciclo em diante; ele atinge seu tamanho máximo entre o oitavo e o 12º dia do ciclo, podendo alcançar o tamanho de uma noz. O próximo estágio é a formação de um pedúnculo e uma depressão no cálice, que sobressai da superfície do ovário. O corpo lúteo hemorrágico tem consistência elástica. Uma frequente falha de interpretação se dá quando se diagnostica apenas a parte que se encontra na superfície, ou se interpreta o tecido ovariano macio como sendo um corpo lúteo. A forma do corpo lúteo presente na superfície do ovário pode variar, tanto que não se podem tirar conclusões sobre o estágio funcional. Os corpos lúteos persistentes são aqueles que não demonstram alteração ao exame repetido em uma vaca que não tem apresentado estro por algum tempo (corpo lúteo gravídico, ou pseudogravídico). O diagnóstico de anestro exige, via de regra, um novo exame, pois sem ocorrer um novo ciclo estral, nenhuma estrutura é palpável durante vários dias. Nas seguintes condições, o diagnóstico pode ser correto, mesmo com apenas um exame: ovários pequenos e duros; ambos os ovários aproximadamente com o mesmo tamanho e a mesma superfície lisa; útero pequeno e flácido; mucosa vaginal pálida e seca. As principais causas de erro são falhas no reconhecimento de folículos e de pequenos cistos; a não percepção de um corpo lúteo e a confusão entre corpo lúteo, cisto e folículo. A palpação dos ovários é de fundamental importância para a verificação da fase do ciclo estral, juntamente com o exame vaginal. Deve-se observar seu tamanho, a 5 consistência superficial, a mobilidade e, principalmente as estruturas funcionais (folículos e corpos lúteos). O registro dos achados do exame ovariano é realizado como segue: Figura 02- Imagem do ovários com folículos e corpo lúteo Tamanho do ovário: Deve-se incluir todas as estruturas presentes na superfície do ovário E: ervilha N: noz F: feijão G: ovo de galinha A: azeitona Pa: ovo de pata P: ovo de pomba Ga: ovo de gansa Consistência das vesículas: 1: firme e tensa, sem flutuação 2: flutuação tensa 3: flutuação nítida 4: flutuação intensa (folículo maduro) 5: plástica, flácida e macia (ruptura recente do folículo) Tubas Uterinas As tubas uterinas (Figura 03) são em número de duas, direita e esquerda, encontram-se em continuidade aos ovários e estão suspensas pela mesosalpinge, proveniente da dobra lateral do mesovário. As tubas estão envolvidas por uma prega peritoneal derivada do ligamento largo do útero, denominada mesosalpinge. Esta última, forma um saco peritoneal denominado bolsa ovárica, situada crânio-lateralmente ao ovário. São condutos sinuosos que partem dos cornos uterinos e terminam junto aos ovários em forma de funil (cálice). As tubas são subdivididas em três segmentos: infundíbulo, ampola e istmo, apresentando ao final do desenvolvimento corporal, em conjunto, comprimentos médios de 20 a 28cm, com diâmetro externo de 1 a 2mm. 6 Figura 03- Imagem da tuba uterina A porção cranial, denominada infundíbulo, apresenta forma caliciforme recoberta de cílios (fímbrias), com função de captação dos óvulos libertados pelos ovários. Em continuidade a esta, encontra-se o istmo de aspecto igualmente contorcido, no entanto com lúmen bastante reduzido que se continua até a extremidade cranial dos cornos uterinos. As tubas são estruturas difíceis de palpar quando saudáveis. Aumentos de diâmetro e alterações na consistência ocorrem na salpingite. As tubas tornam-se duras, espessas e endurecidas em vacas com tuberculose e flutuantes na hidrosalpinge e na piosalpinge. Elas são responsáveis pela captação dos óvulos liberados pelos ovários, recepção e capacitação dos espermatozoides e proporcionam ainda, condições para a permanência dos zigotos desde a fecundação do óvulo até o estágio de 16-células. A fecundação ocorre na ampola, na junção Ampola-Istmo. O transporte dos gametas é muito importante para que ocorra a fecundação e pode-se citar que: 1. o movimento dos gametas viáveis é um item essencial para que a reprodução ocorra; 2. o transporte dos gametas masculino e feminino ocorre em direções opostas; a) Oócitos: do ovário para o infundíbulo (ampola) e daí para a Junção Ampola- Istmo b) Espermatozoide: da vagina para o cervix, direcionando-se para o útero, e deste ao Istmo e finalmente para a Junção Ampola-Istmo c) Complexo de transporte 3. a fecundação ocorre na ampola, na junção Ampola-Istmo; 4. o tempo é importante - o espermatozoide deve estar no oviduto quando o oócito alcança a junção ampola-istmo. Útero O útero (Figura 03) é dividido anatomicamente em três porções: cornos uterinos, corpo e cérvix. Os cornos uterinos são em número de dois e é neles que se desenvolve o embrião e o feto. A forma, tamanho e posição do útero variam de acordo com alguns fatores, como a idade e gestação. Assim, nas nulíparas, o útero é pequeno e encontra-se usualmente na cavidade pélvica, relacionando-se com o reto dorsalmente, e com a bexiga ventralmente. Nas multíparas, ele é maior e situa-se parte na cavidade abdominal e parte na cavidade pélvica. Nas vacas gestantes, o útero está alojado na cavidade abdominal a partir dos 90-120 dias. Histologicamente encontra-se no endométrio entre 30 e 160 carúnculas que são áreas desprovidas de glândulas e que se hipertrofiam durante a gestação. Sobre as 7 carúnculas desenvolvem-se os cotilédones, união esta que se denomina placentoma, responsável pelas trocas feto-maternais. À palpação do útero observam-se o tamanho, a simetria, a consistência e a contractilidade, a motilidade e eventuais conteúdos. O tamanho do útero é estimado, podendo ser ou não abrangido pela mão. O diâmetro dos cornos pode ser medido comparando-os com o diâmetro dos dedos. A simetria é verificada inserindo-se o dedo médio na bifurcação e palpando-se os dois cornos, comparando-os. A assimetria dos cornos não gravídicos não é necessariamente patológica, pois pode ser consequência de uma gestação anterior. A consistência e a contractilidade fornecem informação sobre o estado dos tecidos uterinos (edema e contractilidade pronunciada = estro; consistência pastosa = inflamação aguda grave; tecido duro = fibrose devida a inflamação crônica, ou neoplasia; crepitação sob a serosa = flegmão gasoso). O útero involuído no período do puerpério precoce possuirá dobras longitudinais bem definidas. A mobilidade espontânea do útero pode ser limitada, ou impedida por aderência fibrinosas, ou fibrosas ao grande omento, à parede abdominal, ou aos órgãos adjacentes. Elas surgem após parto distócico e, particularmente, após cesariana. Os eventuais conteúdos do útero não gravídico, como muco, sangue, pus, gás e urina, podem ser sentidos palpando-se cuidadosamente os cornos e deixando-os passar entre os dedos. Se há um feto no útero, deve-se procurar determinar se está vivo ou morto (e se está mumificado, macerado ou enfisematoso). Os seguintes códigos podem ser usados para registrar os resultados da palpação do útero, em particular quando tem grande número de vacas para examinar: Tamanho onde G = espessura: GI O útero pode ser recolhido dentro da mão e os cornos apresentam mais ou menos da espessura de um dedo. GII O útero pode ser recolhido dentro da mão e os cornos são da espessura de 2 dedos. GIII O útero pode ser recolhido dentro da mão e os cornos são da espessura de 3 a 4 dedos. GIV O útero pode ser delimitado pela mão, com a curvatura maior do tamanho aproximado de um braço humano de porte médio até um pão grande. GV O útero quase é delimitadopela mão e a curvatura maior apresenta-se do tamanho de um pão grande, não podendo ser mais totalmente palpado. GVI O útero não pode ser mais delimitado com a mão, pois a curvatura maior está fora do alcance da mão. Simetria: S ambos os cornos do mesmo tamanho (simétricos) As os cornos são de tamanhos diferentes (assimétricos) As+++ o corno direito é bem maior que o esquerdo +As o corno esquerdo é um pouco maior que o direito Consistência e contractilidade: CI útero macio e pouco contrátil CII contractilidade moderada CIII contractilidade forte 8 Eventuais conteúdos: Anotar a quantidade (pouca, média ou muita), bem como a consistência (mole ou flutuação tensa; firmeza). Se há presença de secreção vaginal, registrar sua coloração, viscosidade, odor e quaisquer conteúdos estranhos presentes. Figura 03- Imagem representativa do trato reprodutivo feminino, detalhados cornos e corpo uterino e cervix 9 Fisiologia do Ciclo Estral Ciclo Estral O ciclo estral das vacas dura em média 21 dias, ou seja, um cio a cada 21 dias. Durante o ciclo existe uma cascata de hormônios que são liberados e que controlam todos os sinais que visualizamos nos animais. Podemos relacionar esta cascata de hormônios ao envolvimento também de diversos órgãos. O hipotálamo e a hipófise são estruturas presentes no cérebro dos animais. O hipotálamo deve liberar o Hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH), um hormônio que age na hipófise, que por sua vez ao ser estimulada libera o Hormônio Folículo Estimulante (FSH) e o Hormônio Luteinizante (LH), estes dois últimos hormônios citados, FSH e LH irão agir nos ovários e assim ao final do ciclo estimular a ovulação. Após a ovulação do folículo, no ovário, forma-se o corpo lúteo, estrutura que é responsável pela secreção de progesterona, ou seja, se ocorrer um cio fértil e o óvulo for fertilizado, o corpo lúteo formado será responsável pela secreção de progesterona, hormônio vital para manutenção da gestação. Se após 21 dias não houver um embrião implantado no útero, o próprio útero secretará prostaglandina, hormônio que irá lisar o corpo lúteo e assim estimular um novo cio, o retorno ao cio. Ainda podemos citar o hormônio estradiol que é o estrógeno biologicamente ativo produzido pelo ovário, age sobre o Sistema Nervoso Central para induzir o cio comportamental na fêmea, sempre que há um folículo dominante, prestes a ovular, este secreta estrógeno e assim visualizamos os sinais de cio nas fêmeas bovinas. O controle do ciclo estral é mantido pela intima regulação dos hormônios hipotalâmicos, hipofisários e ovarianos. Altos níveis de progesterona inibem o cio e a onda ovulatória de LH, quando há uma queda nestes níveis há liberação de GnRH e assim liberação de FSH, LH e nova ovulação. Precisamos ainda esclarecer que dentro deste intervalo de 21 em 21 dias, entre um cio e outro, não há só uma mudança no perfil hormonal das vacas, mas também nas características anatômicas do trato reprodutivo, o que caracteriza as fases do ciclo estral (estro, metaestro, diestro e proestro). Crescimento Folicular O crescimento folicular em novilhas pré-púberes ocorre numa sequência de eventos organizados descritos como ondas. Cada onda é precedida por um pico de FSH sérico. As ondas foliculares estão presentes nas novilhas já na segunda semana de vida. 10 O número de pequenos, médios e grandes folículos (3 a 5; 6 a 8 e > 9mm de diâmetro, respectivamente), bem como o diâmetro dos folículos grandes aumenta da 2ª para a 14ª semana de idade. Entre a 6 e 24ª semanas de vida, há aumento marcado, porém transitório, da concentração sérica de FSH e LH. No entanto, somente 30 a 80 dias antes da primeira ovulação o aumento da frequência dos pulsos de LH resulta no aumento do diâmetro folicular e da concentração de estradiol sérico culminando com a primeira ovulação. O FSH sérico permanece relativamente estável. As novilhas usualmente não demonstram o estro antes da primeira ovulação, o corpo lúteo é pequeno e pode ser ativo por pequeno período de tempo. Este ciclo curto é usualmente seguido de estro e de fase lútea fisiológica longa. Embora o crescimento dos folículos ovarianos na bezerra parece ser estimulado pelas gonadotrofinas, o mecanismo de controle gonadotrófico ainda não está bem esclarecido. Hormônios A secreção de gonadotropinas hipofisárias (LH/FSH) é o principal fator que regula a função ovariana. O controle do ciclo estral é mantido pela intima regulação dos hormônios hipotalâmicos, hipofisários e ovarianos. O GnRH regula a síntese de gonadotrofinas e a liberação de LH. Os esteróides ovarianos regulam a liberação de GnRH e consequentemente a de LH. No entanto, a regulação de FSH é realizada pelo estradiol e inibina, sendo que o GnRH parece não ter influência na liberação de FSH pela hipófise, mas somente por sua síntese. Neurônios hipotalâmicos especializados produzem e secretam o hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH) que controla a função hipofisária. O GnRH é secretado em pulsos discretos, que através do sistema porta hipotalâmico-hipofisiário, alcançam a adeno-hipófise. Os pulsos de GnRH determinam a secreção típica de pulsos de gonadotropinas hipofisárias (LH/FSH). Os hormônios esteróides são secretados pelo ovário, testículos, placenta e córtex adrenal e os esteróides que estão diretamente ligados ao controle da reprodução são o estrógeno, progesterona e testosterona. Sua atividade secretora pelas gônadas está sob controle da hipófise anterior. O estradiol é o estrógeno biologicamente ativo produzido pelo ovário, age sobre o Sistema Nervoso Central para induzir o cio comportamental na fêmea e apresenta um controle retrógrado negativo e positivo através do hipotálamo sobre a liberação de LH e FSH. A progesterona é produzida pelo corpo lúteo, pela placenta e pela adrenal. A secreção de progesterona é principalmente estimulada pelo LH. A progesterona também 11 atua na pré-sensibilização dos centros hipotalâmicos em relação à ação do estradiol no desencadeamento dos sinais de cio. Altos níveis de progesterona inibem o cio e a onda ovulatória de LH. A inibina é um hormônio proteico produzido pelas células da granulosa (do folículo). Sua função é inibir a secreção pituitária de FSH exercendo um feed back negativo na hipófise, mas sem interferência na produção e liberação de LH. Seleção folicular e dominância Sabe-se que os estágios iniciais da foliculogênese ocorrem independentemente dos hormônios gonadotróficos. Folículos antrais respondem inicialmente ao FSH e posteriormente tornam-se dependentes deste. No bovino, a emergência de uma onda folicular é caracterizada pelo repentino crescimento (de 1 a 2 dias) de mais de 20 pequenos folículos que só poderão ser detectados por ultrassonografia com um diâmetro de 3 a 4mm. Durante aproximadamente 2 dias, a taxa de crescimento é similar entre os folículos da mesma onda e, a partir daí, um folículo é selecionado (recrutamento) para continuar a crescer (folículo dominante), enquanto os demais tornam-se atrésicos e regridem (folículos subordinados). Em ciclos estrais de 2 ou 3 ondas, a emergência da primeira onda folicular ocorre consistentemente no dia da ovulação (dia 0). A emergência da segunda onda ocorre no 9º ou 10º dia para ciclos de duas ondas, e no 8º ou 9º dia para ciclos de 3 ondas (ou seja, 1 ou 2 dias mais cedo). Em ciclos de 3 ondas, a terceira onda emerge no 15º ou 16º dia. Sucessivas ondas foliculares permanecerão anovulatórias até que a luteólise ocorra. O folículo dominante presente no início da luteólise se tornará o folículo ovulatório e a emergência da próxima onda é atrasada até o dia da ovulação. O corpo lúteo começa a regredir mais cedo nos ciclos de duas ondas (dia 16) que nos ciclos de 3 ondas (dia 19), resultandoconsequentemente num ciclo estral mais curto (20 dias vs. 23 dias, respectivamente). Portanto, a duração do ciclo estral pode fornecer uma ideia do número de ondas foliculares que uma determinada vaca tem em cada ciclo. A supressão folicular periódica de FSH preserva as reservas do ovário, evitando contínuo recrutamento de folículos antrais, 99% dos quais são perdidos pela atresia. O aumento transitório de FSH permite crescimento folicular suficiente de forma que alguns folículos adquiram responsividade ao LH. A responsividade ao LH propicia a 12 habilidade para sobreviver sem o FSH. No momento que os perfis de crescimento dos folículos dominantes e subordinados começam a divergir (momento da seleção), 2 ou 3 dias depois da emergência da onda, o FSH sofre rápido declínio. O folículo destinado a se tornar dominante aparentemente adquire receptores para LH e tem vantagem competitiva sobre os folículos destinados a se tornarem subordinados. O FSH na circulação é subsequentemente suprimido pela retroalimentação negativa de produtos dos folículos emergentes (estradiol e inibina) e a queda no FSH evita a emergência de uma nova onda folicular. A dominância parece ter dois aspectos: a habilidade do folículo dominante em inibir o crescimento dos folículos menores e de ovular sob condições hormonais apropriadas. De acordo com a concepção de dominância, os folículos selecionados sobrevivem, ao menos transitoriamente, na medida que apenas um folículo em cada onda folicular se tornará dominante. Adicionalmente, este folículo dominante suprime o desenvolvimento dos folículos subordinados. Diferenciação No início do ciclo estral ocorre o recrutamento de uma população de folículos do pool de folículos antrais menores (2 a 4 mm), sendo que 2 a 4 dias após detecta-se por meio de ultrassonografia vários folículos com diâmetro médio entre 6 a 9mm. Imediatamente após este período inicia-se a fase de seleção no qual um folículo emerge do pool de folículos recrutados e continua crescendo. Posteriormente, este folículo se transforma em dominante (período de dominância) inibindo o crescimento dos demais. A diferenciação é caracterizada pelo crescimento contínuo do maior folículo, sendo o único com capacidade de ovular e de suprimir os folículos subordinados. Os dois maiores folículos crescem em velocidade semelhante por alguns dias, até que o folículo maior atinja aproximadamente 8,5mm. O folículo dominante parece regular o crescimento dos folículos subordinados. Os folículos subordinados podem tornar-se dominante se o folículo dominante original for removido, ou se houver uma suplementação exógena de FSH. A remoção do maior folículo no momento esperado do início da diferenciação, ou poucos dias após, é seguido pelo incremento das concentrações de FSH circulante seguido pelo crescimento do segundo maior folículo em poucas horas. Este novo folículo torna-se dominante, mas continua sendo menor do que o folículo dominante que foi removido. 13 Seleção do folículo dominante Entre o surgimento do pico de FSH e o início da divergência, todos os folículos da onda, continuam necessitando de FSH e alguns destes contribuem para a diminuição do FSH. Associado com o início da divergência a relação folículo/FSH muda, apesar de vários folículos necessitarem de FSH, somente o folículo dominante continua a crescer, mesmo em baixas concentrações de FSH. A queda do FSH é necessária para que se estabeleça a divergência; o aumento do FSH endógeno ou a administração de FSH precoce em uma onda faz com que vários folículos tornem-se dominantes. Com a diminuição das concentrações séricas de FSH, os folículos modificam-se, a produção de estrógenos reduz, os níveis de inibina de alto peso molecular reduzem e há aumento das quantidades de IGF-BP de baixo peso molecular, culminando com apoptose das células da granulosa. Neste ambiente, somente o folículo dominante é capaz de continuar a crescer e produzir esteróides. O FSH estimula a produção de estradiol, ativina-A e inibina-A. Estes fatores FSH-estimulados tem papel intrafolicular na divergência. Ambos, estradiol e inibina, suprimem as concentrações circulantes de FSH. O mecanismo ligado à diferenciação folicular não está bem definido, mas está relacionado com a indução de receptores para LH nas células da granulosa, aumento do 17β-estradiol circulante, decréscimo plasmático do FSH e aumento de IGF-1 livre no liquido folicular. A seleção do folículo dominante é um processo no qual o primeiro folículo a adquirir receptores para LH nas células da granulosa é selecionado como dominante, ou seja, o folículo dominante é capaz de responder, tanto ao FSH quanto ao LH para crescer. O folículo selecionado para tornar-se dominante, é apto a continuar seu crescimento sob influência hormonal que é supressiva aos folículos menos desenvolvidos. O início de cada onda folicular é precedido (1 ou 2 dias) pelo incremento transitório nas concentrações de FSH que atinge seu pico no tempo aproximado da emergência folicular. Entretanto, as concentrações atingem valores baixos antes da diferenciação folicular. Durante o declínio das concentrações de FSH, as concentrações de LH aumentam, atingindo um platô aparente 24 horas antes da diferenciação e declínio 16 a 24 horas após a diferenciação. O folículo quando atinge 5mm de diâmetro adquire a capacidade de diminuir as concentrações circulantes de FSH. Apesar disso, os níveis decrescentes de FSH continuam a exercer efeito positivo no requerimento dos folículos. No momento em que o folículo maior atinge o diâmetro de 8,5mm (o início esperado da diferenciação), 14 aumenta o declínio contínuo das concentrações de FSH. A redução da concentração de FSH no momento da diferenciação é inferior ao mínimo requerido pelos folículos subordinados, mas suficiente para o crescimento contínuo do folículo dominante. Fatores intra-ovarianos como inibina, ativina e IGF-1 estão relacionados no estabelecimento da dominância folicular em associação com a atresia dos folículos subordinados. O aumento das concentrações de inibina deve estar ligado à produção de estrógenos pelo folículo. Estudos sugerem que o estradiol e a inibina atuam sinergicamente na supressão da secreção do FSH e bloqueio do recrutamento de outros folículos, enquanto que a progesterona é o maior regulador do pulso e frequência do LH. Coincidentemente, as concentrações de LH aumentam e têm função no crescimento do maior folículo selecionado (ovulatório, ou não) após o início da diferenciação. O futuro folículo dominante adquire receptores para o LH nas células da granulosa e as concentrações de estradiol no líquido folicular começam a aumentar para estabelecer a dominância, privando os folículos subordinados do crescimento. A atresia do folículo dominante está relacionada com a frequência lenta dos pulsos de LH (em decorrência da presença de um corpo lúteo secretor de progesterona). A maturação final e ovulação estão associadas com rápida frequência dos pulsos de LH que só ocorrem se as concentrações de progesterona decrescem (<1ng/ml), como consequência da luteólise provocada por uma onda endógena ou exógena de prostaglandina. O folículo dominante desta onda produz estradiol suficiente para desencadear o comportamento do cio, estimular a liberação de GnRH induzindo pulsos de LH e o subsequente pico final de LH que é o responsável pela ovulação. 15 16 ULTRASSONOGRAFIA APLICADA A REPRODUÇÃO DE BOVINOS Desde a descoberta do efeito dos cristais piezoelétricos pelos irmãos Curie em 1880, ocorreu um intenso aperfeiçoamento para a utilização destes na medicina. Sendo aplicado pela primeira vez na medicina humana em 1950. Em medicina veterinária intensificou-se o seu uso após o lançamento do primeiro livro tratando da ultrassonografia aplicada à reproduçãoequina em 1986. E em 1990 já se faz uso da ultrassonografia no manejo de éguas Puro Sangue de Corrida, biometria testicular e uso em reprodução de ovinos e bovinos. Bases biofísicas do ultrassom Um aparelho de ultrassonografia é composto por um transdutor, também conhecido por sonda ou probe, um monitor e um software. A ultrassonografia se baseia na produção de imagens pelo uso de ondas sonoras de alta frequência As ondas acústicas do ultrassom são ondas de pressão, produzidas pela compressão e descompressão alternadas das moléculas dos tecidos adjacentes. Estas ondas de pressão são geradas pela vibração de cristais com propriedades piezoelétricas, presentes no transdutor do aparelho, quando submetidas a correntes elétricas alternadas. Estas ondas têm a propriedade de se propagar pelos tecidos orgânicos. À medida que uma onda atravessa um determinado corpo, parte é refletida na forma de um eco e parte prossegue interagindo com tecidos mais profundos. A densidade e a organização de um tecido determinam que proporção da onda ultrassonográfica será refletida. Líquidos não refletem as ondas, sendo caracterizados como anecóicos ou não-ecogênicos, originando imagens escuras; tecidos muito densos refletem a maior parte da onda, sendo caracterizados como hiperecóicos ou hiperecogênicos, produzindo imagens mais claras. Cada tecido apresenta um padrão ultrassonográfico próprio. Tecidos de diferentes resistências acústicas, quando em contato, produzem interfaces que permitem diferenciá-los. Os cristais agem, ao mesmo tempo, como transmissores e como receptores. As ondas refletidas pelos tecidos são reconvertidas pelos cristais do transdutor em pulsos elétricos. Os pulsos são amplificados, compensados para diferenças de intensidade e utilizados por um receptor na geração de uma imagem bidimensional. O tempo entre a emissão do pulso elétrico e o retorno do eco é utilizado no cálculo da distância entre a estrutura e o transdutor. Um tecido mais distante do transdutor, no momento da análise, apresenta imagem na porção inferior da tela. A imagem é representada por uma escala de tonalidades cinza. A profundidade que o som alcança depende da frequência do transdutor. A frequência é definida como o número de vezes que uma onda é repetida (ciclos) por segundo. O comprimento de onda é a distância que a onda percorre 1 ciclo. A frequência e o comprimento de onda são inversamente relacionados. Quanto menor o comprimento de onda, maior a frequência e melhor a resolução. 17 A profundidade que o som penetra no tecido é inversamente proporcional à frequência empregada. Sons de alta frequência são mais atenuados que sons de baixa frequência, atingindo menor profundidade. A posição do ultrassom na superfície do órgão do animal irá determinar a orientação da imagem, podendo ser longitudinal (sagital) ou transversal. TERMINOLOGIA Anecóico-Anecogênico-Transônico: ausência de eco, cor preta. Ecóico-ecogênico: presença de ecos. Hiperecóico-Hiperecogênico: ecos brilhantes. Estruturas altamente reflexivas (cor branco). Hipoecóico- Hipoecogênico: ecos esparsos, reflexão intermediaria (cinza). Isoecóico: estruturas com a mesma ecogenicidade. ARTEFATOS REVERBERAÇÃO: imagem de linhas ecogênicas sucessivas, paralelas à superfície da pele, determinadas pela repetição do eco devido a ar ou gás na trajetória do ultrassom. A reverberação externa ocorre quando o contato entre transdutor e pele não é total. A reverberação interna é determinada quando existe gases no interior do corpo do paciente. SOMBRA ACÚSTICA: Zona anecóica determinada por estrutura hiperecóica que impede a progressão do ultrassom nos tecidos, refletindo-o completamente. REFORÇO ACÚSTICO: uma estrutura anecóica (conteúdo líquido) conduz muito bem o som, fazendo com que este chegue com muita intensidade nos tecidos posteriores à mesma, determinando imagem hiperecóica. TRANSDUTORES É a parte do aparelho que merece maior cuidado e também é a mais frágil e cara, justificando este cuidado. Deve-se adequar ao tipo principal de uso. Deve ser acoplado e desacoplado do aparelho somente com este desligado. 18 Transdutor linear: os cristais são arranjados em filas. A imagem é tipicamente retangular. Este estilo de transdutor é bem adequado para visualização reprodutiva transrretal. Transdutor setorial: possuem sondas com uma cabeça móvel e são particularmente adequada para visualização transvaginal (aspiaração foliular-OPU e outras aplicações com imagens feitas por esta via). Fornecem uma imagem triangular (formato de pedaço de pizza). Transdutor convexo: são adequados para visualização esterna (ex. através da parede abdominal-diagnóstico de gestação em ovelhas) ou do tórax (entre costelas), também pode ser utilizado para obtenção de imagem ultrasonográfica dos testículos. Possuem formato que facilita o contato com a pele. Fornecem imagem triangular. A seguir esquema reprentativo do transdutor e imagem ultrasonografica obtida de transdutor convexo. 19 CUIDADOS COM O APARELHO DE ULTRASSOM Transportar em caixa ou bolsa com espuma de proteção. Evitar quedas, altas temperaturas ou umidade. Realizar a limpeza após o trabalho. Cuidado com o manuseio da probe evitando dobrar o fio ou conectar/desconectar com o aparelho ligado. Ao ligar sempre observar a voltagem do aparelho e da rede. É aconselhável o uso de estabilizador. LIMPEZA Item fundamental para funcionamento de qualquer equipamento eletrônico, particularmente o ultrassom que possui uma série de componentes sensíveis ao acúmulo de poeira. A limpeza correta e constante permitirá vida longa ao aparelho e melhor preço de revenda na troca por outro equipamento. Gabinete e Teclado: a limpeza destes componentes poderá ser feita com um pano levemente umedecido somente com água, sabão neutro. Não utilizar dentro do teclado ou partes elétricas. Transdutores: devem ser limpos com pano úmido ou papel toalha a cada fim de exame; nunca deixar o gel secar no transdutor. Não utilizar álcool e nenhum produto que contenha ácido, pois tais produtos podem danificar e corroer a película que recobre os cristais do transdutor. Frente do Monitor: geralmente de acrílico; deve ser limpo com água, pois o uso de outro produto pode manchar ou prejudicar a transparência deste material. Cabos dos Transdutores: podem ser limpo com produto tipo sabão neutro ou outro produto de limpeza similar. 20 Painel de Controle: deve ser limpo também com um pano umedecido somente com água; é preciso muito cuidado com o painel, pois o gel pode e infiltrar-se nas placas e danificá-lo. Filtro: o filtro do equipamento merece um cuidado especial, pois têm a função de filtrar o ar que entra para refrigeração do aparelho impossibilitando um superaquecimento. Durante a limpeza, não utilizar papéis ou materiais que soltem fiapos ou se desmanchem – isto poderá ocasionar um entupimento do filtro e um superaquecimento das placas do equipamento. Todas as entradas de ar existentes no aparelho devem a ser aspiradas; o acúmulo de poeira e sujeira nestas seções com superaquecimento decorrente do equipamento é o principal causador de danos em aparelhos de ultrassonografia. 21 ULTRA-SONOGRAFIA EM REPRODUÇÃO BOVINA Aplicações na reprodução animal A ultrassonografia tem diversas aplicações como método de diagnóstico em várias espécies, especialmente no exame do aparelho reprodutor. Dentre as vantagens da técnica está o fato de não ser invasiva, relativamente simples de ser efetuada, segura tanto para o animal como para o operador, pode ser realizada à campo e fornecer diagnósticos imediatos na maioria dos casos. Até o início da utilização da ultrassonografia em medicina veterinária, a avaliação semiológica do trato reprodutivo, e particularmente dosovários de grandes animais, estava limitada aos achados oriundos da técnica de palpação retal e de técnicas invasivas, como a laparotomia e laparoscopia. As limitações destas técnicas são evidentes. No caso da palpação retal, pela subjetividade ou inexatidão na avaliação dos parâmetros e pela eventual lesão tecidual ocasionada pelos processos de laparotomia e laparoscopia. O estudo da atividade folicular e luteal, com base em achados realizados após o abate ou retirada do órgão, impossibilitava o monitoramento sequencial das estruturas ovarianas ao longo do ciclo estral. A ultrassonografia transrretal, por ser uma técnica não-invasiva e permitir a visualização de estruturas de maneira bem correlata à imagem de seu corte anatômico, permitiu a superação de grande parte destas limitações. A técnica de ultrassonografia transrretal demonstrou ter múltiplas aplicações na avaliação morfológica e funcional do aparelho reprodutor feminino em equinos e bovinos e também em outras espécies. O uso do ultrassom possibilitou grandes avanços no estudo da fisiologia ovariana, particularmente na caracterização do padrão de crescimento folicular, desenvolvimento, manutenção e regressão luteal, e ocorrências durante a fase inicial da gestação. As principais aplicações da ultrassonografia em reprodução animal são: - Estudo da fisiologia ovariana e uterina durante o ciclo estral e gestação; - Avaliação das gônadas do macho e estruturas de acesso pélvico; - Auxílio no diagnóstico de alterações patológicas de útero e ovário; - Avaliação ginecológica de animais destinados à reprodução; - Diagnóstico de gestação precoce; - Monitoramento da gestação inicial para verificação de perdas embrionárias; - Sexagem fetal; - Guia para punção folicular de oócitos. Seleção do aparelho Antes de se adquirir um aparelho deve-se ter em mente que embora exista um grande potencial de aplicações, na maioria das vezes um único aparelho não é capaz de executar da forma mais adequada todas estas atividades, principalmente sem alguns acessórios. Assim é importante verificar a utilização principal do mesmo e direcionar a 22 compra para um equipamento que possa executar um maior número de atividades previstas. As principais características são: 1. Resolução: primeira característica a ser considerada. 2. Tipo de transdutor: 3. Frequência de onda 4. Características do software 5. Tipo de uso: Fixo ou móvel; 6. Fonte de energia própria e auxiliar (bateria de automóvel); 7. Tamanho da tela; 8. Garantia, assistência técnica, peças de reposição e outros; 9. Relação custo benefício Utilização da ultrassonografia na reprodução de bovinos A relação custo-benefício é a principal variável a ser observada na incorporação de novas tecnologias, em qualquer setor produtivo. Sem as informações corretas sobre esta condição, a aplicação de certas técnicas, em determinadas situações pode trazer resultados diferentes dos esperados, o que ás vezes faz com que diminua a credibilidade e o interesse para a mesma. Ultrassonografia aplicada a reprodução de fêmeas bovinas Exame do trato genital Útero: Deve-se ajustar a posição do transdutor para obter uma boa imagem do corno uterino. Em geral, uma visão do corno é mais útil em seções sagitais, pois seções angulares são mais difíceis de interpretar. Seções transversais podem auxiliar no diagnóstico de algum conteúdo na luz. Um exame sistemático dos cornos uterinos é recomendado iniciando-se pela cervix e progredindo distalmente ao longo de cada um dos cornos uterinos. A aparência ultrassonográfica do útero e das estruturas presente nos ovários auxilia a determinação do estágio do ciclo estral. Os fluidos intrauterinos começam a aumentar três a quatro dias antes do estro, atingindo o máximo por volta do estro, e então declinando. A eco textura uterina é relativamente uniforme durante o diestro, mas torna-se muito mais grosseira próxima ao momento do estro. Os fluidos intrauterinos nos casos de metrite ou endometrites tem graus variados de eco densidade variando de um aspecto floculento até intensamente branco. Pelo contrário, fluido intrauterino fisiológico é totalmente não-ecoico. 23 Ovários: A ultrassonografia é o principal método de avaliação da dinâmica de desenvolvimento folicular. Os folículos ovarianos aparecem como estruturas não eco- ecoícas, geralmente como uma borda delgada. Os folículos podem parecer irregulares devido à compressão por outras estruturas ovarianas. O corpo lúteo é facilmente detectável um ou dois dias após a ovulação. Numa fêmea ciclando, o corpo lúteo regride alguns dias antes do estro. O corpo lúteo (CL) é geralmente visível aproximadamente até a ovulação subsequente (às vezes até dois ou três dias após a próxima ovulação). Daí em diante, o CL não pode ser distinguido do estroma ovariano. Uma cavidade central se forma em aproximadamente 70% dos CL. As cavidades centrais não possuem efeito significativo sobre fertilidade, duração do ciclo ou concentração plasmática de progesterona. Folículos ovarianos císticos têm paredes de espessura variável, desde muito finas (cisto folicular) até vários mm de espessura (cisto luteínico). Um folículo ovariano cístico pode ser difícil de distinguir de um folículo ou de um CL com uma grande cavidade. Geralmente, um cisto terá pelo menos 20mm de diâmetro. Folículos ovarianos císticos não são estruturas estáticas. Pode haver mais do que um folículo cístico presente e, ao longo do tempo, um folículo cístico regredir enquanto que outro aumenta em tamanho. Geralmente não existe corpo lúteo presente. Dinâmica folicular: Em pesquisas para conhecimento das ondas foliculares. Acompanhamento do desenvolvimento do corpo lúteo após aspiração folicular. Monitoramento da involução uterina pós-parto: É possível avaliar a involução uterina no período pós-parto e com base na quantidade de líquido e características deste verificar a ocorrência de metrite e endometrites de grau I, II ou III. Diagnóstico de gestação: Em qualquer método de diagnóstico de gestação em bovinos, o que principalmente interessa ao técnico na prática, ou seja, a maior atenção deve ser sempre dispensada às fêmeas não gestantes. É imprescindível que para cada um destes animais seja feito um exame minucioso de todo o genital seguido de uma recomendação de qual procedimento executar para tornar esta fêmea gestante o mais rápido possível. Neste quesito, a ultrassonografia é insuperável, pois além de permitir um diagnóstico acurado e precoce, permite naquelas fêmeas não gestantes uma excelente avaliação de todo o genital. O diagnóstico de prenhez com ultrassom geralmente não é acurado antes do 22º dia. Antes do 20º dia é difícil detectar conteúdo característico de gestação no interior do útero. O próprio embrião dificilmente pode ser detectado antes do 25º dia. Em condições de campo, um operador experiente com um bom equipamento deve ser capaz de detectar o embrião ao 28º dia, na maioria das vacas. O embrião localiza-se na base da 24 primeira curvatura do corno uterino. Neste período embrião está acoplado à face dorsal do lume uterino. Entre o 20º e 25º dia, o embrião está em íntima aposição ao endométrio e encontra-se circundado por uma pequena área circular de fluido. Após o 25º dia, a detecção do fluido cório-alantóico é fortemente sugestiva de prenhez. No entanto, a detecção do próprio embrião, com o batimento cardíaco é o método mais confiável de verificar a viabilidade do feto. Acima de 30 dias de gestação é possível a clara visualização do feto, que nesta fase se encontra mais distante (solto) do endométrio. Com aparelhos de boa resolução é fácil a percepção dos batimentos cardíacos e com isto identificar a viabilidade fetal. Sexagem fetal: A sexagem fetal tem apresentado um demanda crescente com o desenvolvimento da ultrassonografia embovinos. Ela pode ser utilizada para eliminação da prenhez de um sexo indesejável, geralmente machos em rebanhos leiteiros, comercialização de receptoras de embrião com prenhez de determinado sexo, programação de formação de planteis etc. O diagnóstico do gênero fetal baseia-se na determinação da localização do tubérculo genital (TG). Esta estrutura existe nos fetos de ambos os sexos. Na fêmea dará origem ao clitóris e no macho originará o pênis. O TG é uma estrutura bilobulada, eco- densa de aparência muito característica. Localiza-se inicialmente sobre a linha média, entre os membros posteriores, detectada a partir do 50º dia de gestação. Até esta idade não é possível detectar diferenças em fetos macho ou fêmea. A partir do 55º dia de gestação inicia a migração do tubérculo. Na fêmea o TG migra a uma pequena distância em sentido posterior (ventral à base da cauda) e torna-se o clitóris. No macho, o TG migra uma distância maior em sentido anterior, até imediatamente posterior ao cordão umbilical, e torna-se o pênis. O acurado diagnóstico do sexo fetal é possível aproximadamente entre o 55º e o 75º dia ou mais tarde, desde que se tenha acesso para visualizar as áreas corretas. 25 Guia para punção folicular de oócitos: Outra aplicação importante da ultrassonografia. Com o crescimento da técnica de fecundação in vitro, houve maior demanda para aspiração folicular de oócitos via ultrassonografia. Potencialmente podem ser aspirados todos os folículos visíveis de acordo com a resolução do equipamento. Utiliza-se uma probe geralmente setorial, ou mais recentemente micro-convexa colocada via vaginal, acoplada a uma guia de punção. Requer muita habilidade do técnico que manuseia o equipamento, a fim de evitar lesões nos órgão genitais, principalmente ovários. Vários trabalhos têm procurado adequar o ritmo de coleta de oócitos no sentido de maximizar a produção e minimizar as lesões que a técnica provoca na fêmea doadora. Na aspiração guiada por ultrassom o transdutor é inserido na vagina e o ovário é fixado por palpação retal. Quando a imagem ultrassonográfica do folículo é alinhada com a linha de punção no monitor, a cânula de aspiração é introduzida via vaginal para aspirar o conteúdo folicular 26 CONSIDERAÇÕES FINAIS: A ultrassonografia revolucionou a avaliação do genital de fêmeas de grande porte. Com esta técnica foi determinado o padrão de desenvolvimento folicular que auxiliou o desenvolvimento de procedimentos mais avançadas de manipulação da fisiologia, como superovulação, sincronização de cio, Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) e outras. Além disto permitiu-se melhorar a avaliação de várias patologias e a realização do diagnóstico de outras, antes impossível. É capaz de avaliar de estruturas muito pequenas, a partir de 1mm, não somente na superfície dos órgãos, mas também no interior dos mesmos. Aumentaram sobremaneira as informações que podem ser obtidas, porém não diminuiu a necessidade de conhecimentos sólidos de anatomia, fisiologia e endocrinologia, imprescindíveis para interpretar esta maior gama de achados. Quanto maior o número de informações a serem relacionadas, maior a necessidade de conhecimentos para a elaboração do diagnóstico preciso. A ultrassonografia auxilia na geração e necessita de conhecimentos para quem utiliza a técnica.
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