Trabalho imuno - Elisa

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SANAR
O ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um teste sorológico imunoenzimático cuja metodologia se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. As enzimas mais comumente utilizadas como marcadores nos ELISA são peroxidase e fosfatase alcalina.
HISTORICO
O teste ELISA foi desenvolvido e descrito por Peter Perlmann e Eva Engvall na Universidade de Estocolmo, Suécia, em 1971, quando demonstraram a medida quantitativa de IgG no soro de coelho utilizando a enzima fosfatase alcalina como marcador.
Antes do surgimento do ELISA, as técnicas de imunoensaio usavam marcadores radioativos, o que trazia riscos para a saúde dos pacientes. O ELISA então surge como um método imunoenzimático alternativo, cuja técnica permite a análise de amostras de proteínas imobilizadas em poços de microplacas, usando anticorpos específicos e enzimas como marcadores.
TELELAB
O ELISA é um teste imunoenzimático que se baseia na interação antígeno-anticorpo evidenciada pela ação de uma enzima e o substrato apropriado, e revelada por um cromógeno.
Utilizado para detectar e mensurar tanto Acs (anticorpo) como Ags (antígeno)
Cromógeno – substância que revela a ação de uma enzima sobre o substrato por meio de mudança de cor.
São componentes do ELISA: fase sólida, antígeno, enzima, substrato, cromógeno e solução de bloqueio da reação.
Fase sólida: material capaz de adsorver o antígeno ou o anticorpo que será empregado no teste.
A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2.
Variações encontradas nos componentes do ELISA
Fase Sólida: 
· placas de microtitulação - produzidas, geralmente, em poliestireno transparente com 96 cavidades ou em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo chato ou arredondado
· pérolas - pequenas esferas de poliestireno
Antígeno – frações do patógeno, ou o patógeno em si 
Enzima: 
· fosfatase alcalina ou
· peroxidase
Substrato - peróxido de hidrogênio (H2O2)
Cromógenos: 
· ortofenilenodiamina (OPD) ou
· tetrametil benzidina (TMB)
Solução de Bloqueio:
· H2SO4 ácido sulfúrico ou
· HCl ácido clorídrico 
VANTAGENS
· ELISA monoespecífico (imunoensaio enzimático com um único antígeno) proporciona material in-vitro quantitativo para detecção de anticorpos. O perfil de ELISA proporciona um material in-vitro semiquantitativo para detecção de diferentes anticorpos em uma única microplaca.
· A fase sólida do Pool ELISA é coberta com uma composição de antígenos para detecção semiquantitativa de anticorpos cuja especificidade deve ser investigada em sequência através de material monoespecífico.
DESVANTAGENS
· atividade enzimática endógena, armazenamento
· inadequado dos conjugados.
ELISA INDIRETO Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos)
• Na etapa 1, os antígenos estão adsorvidos à fase sólida;
• Na etapa 2, a amostra é adicionada, sendo reagente, contém anticorpos específicos que se ligam à fase sólida;
•Na etapa 3, com a adição de um conjugado, composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (antiimunoglobulina), ocorre a interação conjugado e anticorpo da amostra;
• Na etapa 4, adicionam-se o substrato e o cromógeno;
•Na etapa 5, a ação da enzima no substrato é revelada pelo cromógeno, que sofre um processo de oxidação dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A cor varia de acordo com o tipo de cromógeno utilizado. Nessa etapa, é adicionada uma solução de bloqueio para interromper o processo de oxidação. Se esse processo não for interrompido, haverá aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados falso-positivos.
ATENÇÂO - Se não houver anticorpo específico na amostra, ou seja, se ela for não reagente, a reação não acontecerá e consequentemente não haverá desenvolvimento de cor. 
Como definir se um resultado de ELISA é reagente, não reagente ou indeterminado??
No ELISA o resultado de uma reação é definido pela leitura da absorbância ou densidade ótica (DO) em espectrofotômetro, utilizando um filtro com comprimento de onda indicado pelo fabricante do conjunto diagnóstico. Usualmente, cada conjunto tem sua forma de calcular o ponto de corte (cut-off-CO), acima ou abaixo do qual as amostras são consideradas reagentes, não reagentes ou indeterminadas. As amostras indeterminadas são aquelas cujos valores de DO estão incluídos na zona cinza (borderline). A zona cinza compreende a faixa de valores em torno do cut-off, dentro da qual não se pode ter certeza do resultado.
Como definir a zona cinza no ELISA??
Em geral, o fabricante do conjunto diagnóstico indica como definir a zona cinza. Quando não existir a orientação do fabricante, recomenda-se que sejam consideradas indeterminadas as amostras com valores de DO incluídas no intervalo de 10% a 20%, abaixo ou acima do valor do cut-off.
Acompanhe um exemplo do cálculo do intervalo de 10% para definição da zona cinza:
· ELISA com CO= 0,20
· 10% do CO = 0,20/10 = 0,02
· Limite inferior da zona cinza = CO-10% = 0,20 – 0,02 = 0,18
· Limite superior da zona cinza = CO +10% = 0,20 +0,02 = 0,22
Quais os materiais utilizados para execução do ELISA?
Materiais geralmente fornecidos pelo fabricante
· placa de microtitulação ou pérolas sensibilizadas com antígeno T. cruzi
· selos ou tampas de cobertura
· soro-controle negativo
· soro-controle positivo
· soluções-tampão para a diluição das amostras e do conjugado
· solução-tampão para a lavagem
· conjugado
· substrato e cromógeno
· solução-tampão para diluir o substrato
· solução de bloqueio de reação
Materiais não fornecidos pelo fabricante
· relógio (timer)
· pipetas manuais de volume ajustável (de 5 a 50 µl, de 50 a 200 µl e de 200 a 1.000 µl)
· mono e multicanal
· ponteiras para pipetas manuais de volume ajustável
· pipetas graduadas de 5 ml e 10 ml
· pêra de borracha ou outro auxiliar de pipetagem
· barquetes (reservatórios) para a utilização de pipetas multicanal
· béquer de 1.000 ml
· provetas de 100 ml, 500 ml e 1.000 ml
· frasco com tampa de 1.000 ml
· bastão de vidro
· equipamentos de proteção individual: luvas, máscaras, avental ou jaleco
· recipiente de paredes rígidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sódio a 2%
Além dos materiais constantes do Quadro 8, o laboratório deve estar equipado com banho-maria com termostato para regulagem de temperatura; estufa com termostato regulável; sistema de lavagem e de leitura compatíveis com os métodos empregados e com as especificações dos conjuntos diagnósticos disponíveis.
Quais os procedimentos necessários para executar o ELISA?
1. confira o conjunto diagnóstico, verificando todos os seus componentes, se eles estão sob condições adequadas de conservação e dentro do prazo de validade;
2. leia todas as instruções do conjunto diagnóstico antes de iniciar a reação;
3. providencie os outros materiais, não fornecidos pelo fabricante, necessários para a realização dos testes;
4. utilize exatamente os volumes indicados para preparar as soluções, não faça qualquer alteração com o intuito de economizar reagentes;
5. deixe as amostras e os reagentes que serão utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar a reação;
A temperatura ambiente em laboratórios deve estar entre 20ºC e 26ºC
6. Homogeneize as amostras;
7. inclua, além dos controles fornecidos pelo fabricante, o controle de qualidade interno da reação, conforme orientação dos cursos TELELAB – “Controle de Qualidade de Testes Sorológicos em Unidade Hemotérápicas e Laboratórios de Saúde Pública”
8. faça um protocolo de trabalho, relacionando os controles e as amostras. Veja o exemplo de um protocolo de ELISA no Anexo 3 deste manual;
9. siga rigorosamente os tempos de incubação e os ciclos de lavagem indicados pelo fabricante, tendo o cuidado de evitar a contaminação cruzada das amostras;
10.Faça a leitura da absorbância em espectrofotômetro, utilizando o filtro recomendado pelo fabricante; siga as orientações do fabricante do conjunto diagnóstico para o cálculo do cut-off.
11.Verifique se os resultados obtidos para os controlesestão de acordo com os critérios definidos pelo fabricante. Caso contrário, faça novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. Só considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critérios do fabricante;
12.registre os resultados no protocolo;
· Despreze as amostras e os resíduos do conjunto diagnóstico utilizado e, recipiente apropriado para material infectante. 
· Jamais inicie a execução dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e equipamentos necessários.
Que medidas devem ser levadas em consideração para que você possa garantir a qualidade dos resultados do ELISA?
•Verifique se os reagentes apresentam turvação, precipitação ou alteração de cor, o que os torna impróprios para uso. Não use reagentes com prazo de validade vencido;
• Não misture controles, conjugados, pérolas ou placas de diferentes lotes e/ou fabricantes;
•Armazene os conjuntos diagnósticos de acordo com as recomendações do fabricante;
•Não exponha o substrato à luz durante o armazenamento ou incubação da reação, evitando assim a fotodecomposição do mesmo;
• Não coloque o substrato em contato com substâncias oxidantes ou metais, para evitar sua degradação, evidenciada pela alteração de cor;
•Faça limpeza e a manutenção periódica dos equipamentos de lavagem, evitando dessa maneira o acúmulo de sais e outros compostos químicos;
•Verifique se o filtro usado para a leitura da absorbância é aquele indicado pelo fabricante.
ELISA direto:
· O antígeno é imobilizado (impregnado) na placa.
· Pipeta-se um anticorpo ligado a uma enzima uma enzina (HRP, Biotina, etc.)
ELISA indireto:
· O antígeno é imobilizado na placa, é uma detecção em 2 passos. Primeiro um anticorpo primário é ligado ao antígeno específico depois é adicionado um segundo anticorpo ligado à uma enzima que se liga ao anticorpo primário.
ELISA Sanduiche:
· O anticorpo é impregnado à placa, o antígeno se liga à ele, posterirormente é adicionado outro anticorpo ligado à enzima para se ligar em um outro epítopo do antígeno e formar o complexo.
ELISA por competição:
· O antígeno ou anticorpo está impregnado à placa e o local de ligação tem a competição do antígeno ou anticorpo da amostra com um outro pipetado no kit. Esta competição torna o valor da leitura inversamente proporcional, pois quanto menos quantidade da substância a ser identificada, menos sítios de ligação serão utilizados por elas, os outros sítios de ligação serão ocupados pelas substâncias que foram adicionadas.
MÉTODO DIRETO – AGS (ACS primários conjugados)
SANDWICH E COMPETITIVO – AGS E ACS
ELISA Direto
Quando o antígeno/alvo está ligado na placa, e um anticorpo (AC) primário já conjugado com um emissor de cor ou fluorescência é colocado diretamente sobre o alvo. A sensibilidade deste tipo de ELISA é a mais baixa e quase não é usado.
 ELISA Indireto
Semelhante ao direto, mas se utiliza um AC secundário marcado. Apresenta maior especificidade no teste, por usar o AC secundário.
ELISA Sanduíche
Este provavelmente é o ELISA mais comum, e parte do princípio de ter o anticorpo de captura específico para o alvo já adsorvido em uma placa (ou deixado para se ligar à placa overnight, o que chamam de sensibilizar a placa), e a amostra é adicionada na placa, incubada, e os analitos-alvo se ligam ao seu AC de captura, e ficam aderidos à placa. Então um outro AC específico para o alvo é adicionado, e um AC secundário marcado, que tem como alvo o AC colocado anteriormente é adicionado. Possui grande sensibilidade e poder de amplificação do sinal.
ELISA de Competição ou bloqueio 
· Utiliza um antígeno marcado para competir com o alvo. O antígeno marcado se liga menos quando houver mais antígeno não-marcado (da amostra) e assim, a cor fica mais fraca quando houver muito do alvo na amostra. É utilizado principalmente quando o alvo possui poucos epítopos de ligação ou é muito pequeno.
· Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que a presença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno. Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.
A seguir, temos um modelo de teste de ELISA de bloqueio, desenvolvido por nós e utilizado amplamente em nosso laboratório para o diagnóstico de anticorpos contra herpesvírus bovinos.
1 – Sensibilizar as placas de ELISA com o antígeno, previamente diluído (no nosso exemplo, diluído a 1/200, correspondente à diluição considerada ótima em titulações anteriores), em tampão carbonato (vide fórmulas no final), 100 ul por orifício, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitirá a ligação do antígeno à placa.
2- No dia seguinte, remover a solução de antígeno e lavar a placa 3 vezes com líquido de lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por orifício.
3- A placa pode então ser armazenada para uso posterior (em sacos plásticos fechados a – 20 oC, ou utilizada imediatamente.
4- Acrescentar os soros a testar em uma diluição previamente determinada ( ½ em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem, em volumes de 100 ul/orifício. Incubar por uma hora a 37 oC. 
5- Remover a diluição dos soros e lavar três vezes com líquido de lavagem.
6- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do anticorpo monoclonal (1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar três vezes com líquido de lavagem.
8- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do conjugado (anti- IgG de camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
9- Remover a diluição de conjugado e lavar três vezes com líquido de lavagem.
10- Acrescentar 100 ml por orifício de uma solução de OPD (ortofenilenodiamina) preparada em tampão citrato-fosfato acrescentado de 0,001% de H2O2. Incubar por 15 minutos a 37 oC.
11- A reação é interrompida pela adição de 50 ml por orifício de uma solução de H2SO4 2M.
12- Os resultados são obtidos com base na leitura da densidade ótica (D.O.) em espectrofotômetro com filtro de 492 nm.