Espectrofotometria UV Vis - Análises Farmacêuticas

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Espectrofotometria no UV/Vis 
 
 
Princípio da espectrofotometria 
Medida da luz que é absorvida ou emitida por uma espécie química. Sendo que no 
ultravioleta, no visível e no infravermelho são técnicas de absorção de energia. 
Geralmente é utilizada para determinar espécies orgânicas. 
As diferentes substâncias apresentam máximos de absorção característicos, o que 
é importante para identificação e utilização na quantificação dos fármacos. 
As substâncias absorvem a radiação por conta dos grupos cromóforos. 
Esse processo envolve transições eletrônicas dos elétrons da camada de valência. 
Origem dos espectros de absorção 
 As moléculas absorvem energia nos seus elétrons sigma ou pi, que são orbitais de 
maior energia. Dessa forma, enfrentam variações relacionadas a vibração desses átomos 
na molécula e variações da energia de rotação. 
 As quantidades de energia absorvidas serão diversas, por isso não se observa no 
espectro uma linha de absorção, mas sim uma banda relativamente larga. 
Energia eletromagnética 
 A radiação eletromagnética consiste em energia propagada em forma de ondas. Se 
tem um campo elétrico e um campo magnético movendo em uma determinada direção, 
assim cada tipo de energia apresenta comprimento de onda (λ) característico. 
♥ Quanto menor o comprimento de onda, mais intensa é a energia expandida. 
 
 A faixa de ultravioleta ocorre de 200 a 380 nm, aproximadamente, enquanto o visível 
ocorre de 380 a 780 nm. Dessa forma, são utilizados dois tipos de lâmpadas para fazer as 
leituras: lâmpada de deutério, para UV e lâmpada de tungstênio, para visível. 
Transições eletrônicas 
♥ Elétrons com ligação covalente (sigma); 
♥ Elétrons ligados a átomos de cloro, oxigênio ou nitrogênio; 
♥ Elétrons em ligações duplas ou triplas (pi). 
 A absorção de uma dada substância é afetada pela presença de cromóforos. 
→ exemplos: ligações duplas ou triplas conjugadas ou grupos carbonílicos. 
♥ Quando for trabalhar com fármacos que não têm grupamentos cromóforos, não pode 
ser no ultravioleta. Dessa forma, pode-se trabalhar no visível, se alguma parte da molécula 
estiver absorvendo nessa faixa, ou em outra técnica de análise. 
Terminologias 
 Cromóforo: átomo ou grupo de átomo responsável pela absorção de luz; 
 Grupos auxocromos: grupo saturado que, quando ligado a um cromóforo, altera 
tanto o comprimento de onda quanto a intensidade de absorção. 
→ exemplos: OH, NH2 e Cl. 
 Efeito batocrômico: desloca a absorção da molécula para um comprimento de onda 
maior (direita); 
 Efeito hipsocrômico: desloca a absorção da molécula para um comprimento de onda 
menor (esquerda); 
 Efeito hipercrômico: aumento a intensidade de absorção sem alterar o comprimento 
de onda; 
 Efeito hipocrômico: diminui a intensidade de absorção sem alterar o comprimento de 
onda. 
Leis de absorção de luz 
𝑃0 = 𝑃𝑎 + 𝑃𝑡 + 𝑃𝑟 
P0 = energia incidente; 
Pa = quantidade de energia absorvida; 
Pt = quandidade de energia transmitida; 
Pr = quantidade de energia refletida. 
 
 
Lei de Lambert 
Relaciona a energia incidente e a transmitida. 
A energia transmitida é uma fração da energia total aplicada. 
𝑇 =
𝑃𝑡
𝑃0
 
T = transmitância. 
Lei de Beer 
Relaciona a absorbância e transmitância com a concentração da substância em 
análise. 
A absorbância (A) é diretamente proporcional à concentração da substância em 
solução e inversamente proporcional à transmitância. 
𝐴 =
1
𝑇
 
Lei de Lambert-Beer 
 As leis de Lambert e Beer podem ser combinadas na lei de Lambert-Beer, a qual 
afirma que a intensidade de luz transmitida diminui exponencialmente com a espessura da 
cubeta (caminho óptico) e concentração da amostra. 
 A absorbância é diretamente proporcional à concentração da solução, sendo também 
proporcional ao caminho percorrido pela energia radiante. 
𝐿𝑜𝑔 (
1
𝑇
) = 𝐴 = 𝑎. 𝑏. 𝑐 
a = absorvidade molar; 
b = espessura da cubeta; 
c = concentração da solução. 
fonte de luz monocromador cubeta detector 
Curva de Ringbom 
 Determina a faixa de concentração de uma 
determinada substância na qual o método 
obedece a lei de Lambert-Beer. 
 Quando não se sabe concentração adequada 
para se trabalhar com um determinado fármaco, 
pode-se utilizar essa curva. 
 A faixa mais adequada é a faixa central. 
Soluções coradas 
 Quando se trata de soluções coradas, tem-se algumas particularidades. 
 A primeira particularidade é que a cor encontrada de uma determinada substância é 
chamada de cor complementar, não é a cor absorvida. 
Critérios para análise colorimétrica 
♥ Especificidade da reação corada; 
♥ Proporcionalidade entre cor e concentração; 
♥ Estabilidade da cor; 
♥ Reprodutibilidade da cor; 
♥ Limpidez da solução; 
♥ Sensibilidade elevada. 
Preparação da amostra: derivatização 
 Conversão de um composto sem absorção em outro com intensa absorção. Assim, 
passa de um incolor ou uma cor clara para uma cor mais intensa. 
 Aplicada a fármacos com baixa ou nula absorção no UV. 
 Métodos de derivatização: 
♥ Reações de diazotação; 
♥ Reações com íon férrico; 
♥ Reações com grupos carbonila; 
♥ Reações com azul de tetrazólio; 
♥ Método extrativo colorimétrico. 
Ordens de derivada 
 Processo matemático onde os sinais obtidos são convertidos em respostas 
matemáticas. 
 O objetivo dessa técnica é eliminar interferentes e é utilizada também para análise 
multicomponente. 
♥ Quanto mais se aumenta a ordem, mais interferência de sinal se tem. 
Zero ordem: 𝐴 = 𝜀𝑏𝑐 
Primeira ordem: 
𝑑𝐴
𝐷λ
= 
𝑑𝜀
𝑑λ
𝑏𝑐 
Segunda ordem: 
𝑑𝑛𝐴
𝑑λ′
= 
𝑑𝑛𝜀
𝑑λ′
𝑏𝑐 
Análise multicomponente 
 Também é possível realizar a análise multicomponente pelo somatório de sinais em 
diferentes comprimentos de onda, sem fazer as ordens da derivada, utilizando apenas 
equações matemáticas. 
𝐴(𝑥+𝑦)
" = 𝐴𝑥
" + 𝐴𝑦
" = 𝑒𝑥
" 𝑏𝑐𝑥 + 𝑒𝑦
" 𝑏𝑐𝑦 
 
 
Instrumentação 
 Fonte de luz: onde é produzido a energia radiante. A intensidade da energia deve ser 
alta, uniforme e de baixo custo. 
→ Tungstênio (350-750 nm): fonte pobre de radiação UV, é utilizada para região do visível; 
→ Deutério (190-370 nm): não é boa fonte de luz visível, mas produz luz na região do UV. 
 Monocromador: seleciona o comprimento de onda desejado. 
 Compartimento da amostra: onde a amostra está contida. Geralmente são cubetas 
de quartzo (UV) ou vidro (visível) e possuem 1 cm de espessura. 
 Detector: constituído de um fotomultiplicador que registra a energia sob a forma de 
um sinal elétrico. 
 Amplificador: eleva o sinal do detector para uma voltagem suficiente para operar no 
registrador. O sinal amplificado é convertido e registrado em unidade de transmitância ou 
absorbância. 
 Registrador: dispositivo de leitura, traduz o sinal elétrico a um sinal matemático 
compreensível. É o componente final da série no qual o resultado da análise ou medição é 
apresentado. 
Espectrofotômetro de feixe simples 
 É o mais barato e antigo. 
 Quando a energia entra é 
dispersada pelo prisma, e na saída 
tem-se apenas um comprimento de 
onda, que passará pela amostra na 
cubeta. Passando pela amostra, 
chega no detector, onde terá a 
resposta. 
 
Espectofotômetro de feixe duplo 
 É mais requintado e caro, mas 
permitem uma análise não só da 
amostra como também da solução 
padrão ao mesmo tempo. 
 Dessa forma, tem-se o mesmo 
esquema do monocromador, onde 
este seleciona apenas um 
comprimento de onda. Porém através 
de vários espelhos o comprimento de 
onda vai dispersar, uma luz vai passar para a referência, que é o padrão/branco, e a outra 
para a amostra. 
Detector simples 
 No detector simples, tem-se a fonte 
de luz e um monocromador, que 
seleciona um comprimento de onda 
para passar pela amostra. 
 
 
 
 
Detector arranjo de diodos 
 No detector arranjo de diodos, a 
fonte de luz é passada diretamente na 
amostra. Depois o sinal é disperso pelo 
policromador. 
 
 
 
 
Cubetas 
 Na esquerda tem-se uma cubeta padrão (3-4mL), 
enquantona direita tem-se uma cubeta de pequeno 
volume (0,5-1mL). 
 Quando se trabalha no UV, entre 200-300nm, é 
necessário utilizar cubetas de quartzo. Enquanto a 
cubeta de vidro é mais indicada para utilizar no visível. 
 
 
Solventes 
 Cada solvente tem um ponto de 
corte, o cut-off, que depende do 
comprimento de onda da amostra. 
Assim, é preciso utilizar um solvente 
que tenha um ponto de corte do 
comprimento de onda menor do que o 
máximo de absorção da substância. 
→ exemplo: caso o máximo de 
absorção da substância seja 220nm, 
não se pode usar o clorofórmio, pois 
este tem 246nm de ponto de corte. 
 
Resposta analítica 
 Sobre a resposta analítica, é 
importante a absorbância real x a 
absorbância medida pelo equipamento. 
Dessa forma, tem-se estipulado que o 
máximo de absorbância que se pode 
analisar com precisão é até 1. Com 
absorbância maior que 1 tem-se 
desvios dependendo da substância. 
Assim, até 1 tem-se valores reais e 
reprodutíveis. 
 Também é importante fazer a escolha 
adequada do comprimento de onda. Nem 
sempre o melhor comprimento de onda é o 
mais intenso. 
 No lado esquerdo da figura tem-se um 
máximo de absorção de 241 nm, mas nessa 
faixa a absorbância está em torno de 1.2. 
Então pode-se usar outro comprimento de 
onda para uma melhor faixa de absorbância. 
 
 Outro fator importante é sobre a limpidez da 
amostra. Por conta disso, é sempre necessário fazer a 
filtração das amostras antes de fazer a leitura. 
 Caso a amostra esteja límpida, tem-se uma 
resposta plena chegando no detector, então a mesma 
energia absorvida chega até o detector. Porém, quando 
se tem uma amostra com partículas, a energia incidente 
bate na amostra e chega menor no detector, o que 
influenciará na resposta. 
 
 
 
 
Aplicação na análise de fármacos 
 O processo de absorção pode ser usado para análise quantitativa e qualitativa. 
 Quantitativo: 
Método da curva padrão: consiste na determinação experimental da curva padrão de 
uma solução de concentração conhecida com uma solução desconhecida: plotando em 
gráfico absorbância A x C. O R2 precisa estar acima de 0,99. 
 
 Método da comparação: compara a absorbância produzida pela solução da amostra 
com a absorbância de uma solução da substância padrão, no comprimento de onda de 
absorção máxima. 
𝐶𝐴 =
𝐴𝑏𝑠𝐴. 𝐶𝑆𝑄𝑅
𝐴𝑏𝑠𝑆𝑄𝑅
 
AbsA: absorbância da amostra; 
CSQR: absorbância da SQR; 
AbsSQR: concentração da SQR. 
detector 
detector 
amostra transparente 
amostra com partículas 
𝐶% = (𝐶𝐴. 100)/𝐶𝑇 
CA: concentração encontrada na amostra; CT: concentração teórica do fármaco. 
 Extinção: a intensidade de uma banda de absorção em um espectro no ultravioleta é 
usualmente expressa como absortividade molar no máximo de absorção. Quando não se 
conhece o peso molecular do material que absorve, pode-se exprimir a intensidade de 
absorção através da extinção. 
𝐸1% = 177 
1 g 100 mL 177 
1000 mg 100 mL 177 
10 mg 1 mL 177 
1 mg 1 mL 17,7 
0,1 mg 1 mL 1,77 
0,01 mg 1 mL 0,177 
 Qualitativo 
Embora não seja largamente utilizada para identificação como para doseamento, 
mudanças batocrômicas e hipsocrômicas (baseadas na mudança de pH) são ocasionalmente 
utilizadas para identificar a possível presença ou ausência de substâncias. 
Vantagens 
♥ Boa precisão e robustez do método; 
♥ Boa sensibilidade; 
♥ Simplicidade e facilidade de realização; 
♥ Problemas no método podem ser resolvidos com uso do espectro derivado. 
Desvantagens 
♥ Especificidade limitada; 
♥ Interferência de excipientes; 
♥ Não permite completa automação.