PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES

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BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO
Maria Eduarda Rocha 
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
- A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica reprodutiva que permite recolher oócitos de uma fêmea (doadora), manipulá-los em laboratório para maturarem, serem fecundados, cultivados e desenvolverem em embriões para então transferi-los para fêmeas (receptoras) com a finalidade de completarem o período de gestação. 
- Biotécnica reprodutiva importante para exploração do potencial genético de fêmeas bovinas.
- A coleta de oócitos a partir da punção/aspiração folicular guiada por ultrassom ("ovum pick-up" - OPU) associada à produção in vitro, tem sido utilizada como instrumento importante para exploração maximizada do potencial reprodutivo dos rebanhos bovinos.
- Permite a interação entre o espermatozoide e o oócito fora do trato reprodutivo da fêmea, com a formação de um novo indivíduo, através da produção do embrião. Assim, embriões produzidos in vitro são aqueles produzidos pela manipulação de gametas fora do organismo materno.
PIVE (produção in vitro de embriões):
Obtenção de oócitos por aspiração folicular na doadora (OPU) → Maturação in vitro (MIV) → Fertilização in vitro (FIV) → Cultivo embrionário in vitro (CIV) → Classificação dos embriões → Criopreservação dos embriões → Transferência de embrião para a receptora (TE)
HISTÓRICO: 
· 1º nascimento após PIVE em coelhos (Chang, Nature, 1959) 
· 1º nascimento após PIVE em camundongos (Mukherjee & Cohen, Nature, 1970)
· 1º nascimento após PIVE em humanos (1978) Técnica em constante expansão! 
· 1º nascimento após PIVE em bovinos (Brackett et al., Biology of Reproduction, 1982)
· 1º nascimento após PIVE em ovinos e suínos (Chang et al., Theriogenology, 1986)
· 1º nascimento após PIVE em bovinos no Brasil (1994) 
APLICAÇÕES: 
· Reprodução assistida – em humanos e na medicina veterinária 
· Resolução de problemas de infertilidade (principalmente em humanos)
· A primeira humana gerada por fertilização in vitro (Louise Brown) foi feita devido à problemas de infertilidade que os pais apresentavam e recorreram à reprodução assistida 
· Em animais, a reprodução assistida é mais aplicada em pets (cachorros e gatos) em situações específicas, pois na produção animal geralmente o animal é descartado quando apresenta infertilidade
· Animais em extinção 
· Em 2018, embriões de rinocerontes brancos do Norte foram produzidos em laboratório (os oócitos foram coletados da única fêmea que restava, e fertilizados com sêmen criopreservado de um macho), e o embrião foi transferido para uma rinoceronte fêmea branca do Sul (receptora) 
· Em 2016, três bezerros de Bison produzidos por FIV nasceram saudáveis 
· Pesquisa científica 
· Estudo de processos fisiológicos 
· Desenvolvimento de outras biotécnicas (clonagem, ICSI, transgenia) 
· Aumento da produção de animais geneticamente superiores e elevação da produção de alimentos 
VANTAGENS: 
· Melhor aproveitamento do potencial genético das fêmeas e redução do intervalo entre gerações 
· Acelera a produção de animais geneticamente superiores
· Seleção e aprimoramento genético dos filhotes gerados 
· Definição das características mais importantes para a produtividade e para a melhoria da caracterização do rebanho
· Viabiliza a utilização de animais bastante jovens, diminuindo o intervalo de gerações, aumentando a intensidade de seleção e permitindo selecionar matrizes potenciais, levando à produção de novilhas de reposição apenas de animais geneticamente superiores, o que contribui para a otimização do melhoramento genético
· Aumento da produção de bezerros por fêmea por unidade de tempo
· Enquanto que em um ciclo estral apenas um oócito se desenvolve até a ovulação, a PIVE possibilita que numerosos oócitos que teriam se degenerado tornem-se embriões
· Possibilidade da reprodutora gerar mais bezerros de alto valor genético por ano. Uma vaca consegue parir uma vez ao ano (9 meses de gestação), porém utilizando essa biotecnologia é possível que um animal geneticamente superior entregue muitos produtos por ano
· Controle na transmissão de doenças infecto-contagiosas
· Facilidade no transporte, estocagem e comércio de material genético 
· Utilização de animais jovens, gestantes, em período pós-parto (lactantes), ou com problemas de infertilidade adquiridos
· A utilização de bezerras de alto potencial genético como doadoras de oócitos em programas de TE oferece um potencial considerável para acelerar o ganho genético pela redução do intervalo entre gerações
· Fêmeas a partir dos seis meses de idade, gestantes até o terceiro mês (90 dias) ou no período pós-parto podem ser usadas como doadoras de oócitos na PIVE
· Não é necessária a aplicação de hormônios 
· Viabilidade maior do uso de sêmen sexado 
· Permite a utilização de touros diferentes para doadoras individuais, assim como viabiliza o emprego do sêmen sexado
· Devido ao fato do sêmen sexado sofrer injúrias mecânicas, é um sêmen mais sensível que deve ser inseminado na fêmea o mais próximo possível da ovulação, devido à sua menor resistência e viabilidade. Ao utilizar o sêmen sexado na fertilização in vitro, tem-se um controle maior desse tempo no momento da fecundação, visto que tudo é feito no laboratório e independe de protocolos e manejos, assim, haverá maior eficiência na utilização do sêmen sexado 
· Maior aproveitamento do sêmen (com apenas uma dose pode-se fertilizar oócitos de mais de uma fêmea) 
DIFICULDADES: 
· Processo trabalhoso 
· Alto custo financeiro 
· Necessidade de equipamentos especializados 
· Mão-de-obra especializada 
· Condições adequadas do rebanho (genética, sanidade, nutrição, manejo, bem-estar)
· Protocolos não consolidados para parte das espécies de animais domésticos 
CONTEXTO: 
Biotécnicas da reprodução segundo a complexidade e avanço na ciência: 
TÉCNICA DA PIVE EM BOVINOS:
· A produção in vitro de embriões envolve a seleção de doadoras, sincronização das receptoras, aspiração folicular dos oócitos, evolução in vitro de embriões (maturação, fertilização e cultivo) e o processo da transferência dos embriões para a receptora, ou seja, tem a combinação de vários processos interdependentes, que vão desde a obtenção dos oócitos imaturos (OPU - aspiração folicular) à transferência dos embriões para as fêmeas receptoras, que levarão a gestação a termo.
· Indicações:
· Aumentar o ganho genético e eficiência reprodutiva 
· Fêmeas com distúrbios reprodutivos adquiridos (endometrite, por exemplo)
· Fêmeas não responsivas a protocolos de superovulação 
· Fêmeas jovens 
· Pós-mortem 
· A inseminação artificial possibilita 1 prenhez/ano/fêmea, já na PIVE é possível em média 36 prenhezes/ano/fêmea 
Alguns profissionais aspiram as fêmeas com intervalos de 15 dias, mas o indicado são 30 dias, pois assim não “esgota” a vaca e mantém uma boa eficiência de aspiração.
· O seguinte gráfico demonstra a crescente ascensão da produção in vitro de embriões, frente à redução da produção in vivo de embriões: 
· Embriões in vitro x in vivo no Brasil 
· Os embriões produzidos in vitro passaram a produção de embriões in vivo 
· O embrião é transferido no estádio de blastocisto 
· O blastocisto é uma esfera oca de células embrionárias, conhecidas como blastômeros, em torno de uma cavidade interna cheia de fluido chamada blastocele
· O embrião em estádio de blastocisto é composto por uma cavidade central e por dois tipos de células: as células da trofoectoderme (que mais tarde vão se desenvolver e formar a placenta) e as células da massa celular interna (que irão formar o feto)
· O blastocisto representa o estádio de desenvolvimento embrionário prévio à implantação no útero materno
· Animais zebuínos (Bos indicus) produzem maior quantidade de oócitos por coleta que os animais taurinos (Bos taurus)
ETAPAS DA PIVE:
· 1) Colheita dos oócitos imaturos 
· Punção folicular: 
· Ovários obtidos de abatedouro
· Mais utilizado em pesquisas ou empresas comerciais que coletam os oócitos para testarem meios de cultivo e demais etapas de produção 
· Transportedos ovários em solução salina estéril 
· Ao chegar no laboratório, realizar lavagem com solução salina aquecida 
· Tempo entre abate e laboratório: ideal 4 horas 
· Aspiração com agulha 40x12 dos folículos de 2 a 8 mm (intermediários)
· Evitar folículos pré-ovulatórios 
· O diâmetro dos folículos recomendado para recuperação é de 2 a 8 mm
· Aspiração folicular guiada por ultrassom (“ovum pick up” – OPU)
· Coleta dos oócitos diretamente dos ovários das vacas doadoras
· Anestesia epidural (articulação sacro-caudal) e higienização 
· Oócitos são selecionados na propriedade e enviados ao laboratório 
· Um sistema de bomba à vácuo conectado à agulha permite a recuperação dos oócitos e do líquido folicular para dentro de um tubo coletor
· Punção folicular com uma agulha acoplada a uma sonda transvaginal, de forma que os folículos a serem puncionados são visualizados na tela do ultrassom
· O ultrassom é muito importante para visualizar os folículos ovarianos e guiar o operador durante toda a operação. Depois de identificados, os folículos são penetrados com uma agulha ligada a um sistema de vácuo, que serve para aspirar o conteúdo líquido e consequentemente o oócito
· Com a mão esquerda enluvada no reto do animal, introduzimos o transdutor setorial adaptado para a punção na vagina e, em seguida, a guia apresentando uma agulha descartável em sua extremidade, é acoplada ao transdutor. Localizamos os ovários e os tracionamos, um de cada vez, para a superfície de contato do transdutor, que toca a parede do saco vaginal. A imagem gerada no monitor corresponde ao ovário e suas estruturas, sendo os folículos apresentados de forma anecóica (preto), pela presença de líquido, e o parênquima de forma ecogênica (cinza claro)
· Não é necessário o uso de hormônios para a recuperação dos oócitos, mas para ter mais sucesso com a aspiração folicular pode-se aplicar um protocolo de superovulação, sendo assim opcional
· Aspira-se cerca de 20 oócitos de cada vaca, tendo 8 oócitos viáveis em média
· Após a recuperação dos oócitos, realiza-se em seguida a seleção dos oócitos em microscópio, de acordo com o número de camadas de células do complexo cumulus-oócito (oócito envolto por células da granulosa, no interior do folículo) e o aspecto do citoplasma. Os oócitos selecionados são então transportados em meio de maturação até o laboratório para que se tenha início o processo de produção in vitro de embriões
· Selecionar oócitos com qualidade boa (avaliar COC – complexo cumulus-oócito)
· Grau I: 3 ou mais camadas, citoplasma homogêneo 
· Grau II: 2 ou mais camadas, citoplasma homogêneo 
· Grau III: camada incompleta, citoplasma homogêneo ou heterogêneo 
· Grau IV: degenerado, desnudo 
· Geralmente utiliza-se oócitos avaliados em grau I e grau II
· As células do complexo cúmulos-oócito são muito importantes para o processo de maturação do oócito, por isso devem estar presentes 
· 2) Maturação in vitro (MIV)
· Modificações no núcleo e citoplasma → oócitos maduros (competência oocitária)
· A maturação envolve uma série de mudanças no citoplasma e no núcleo do oócito, para que este possa ser fecundado e, posteriormente, possa se desenvolver até o estádio de blastocisto
· Os oócitos, assim que retirados dos folículos ovarianos, não se encontram ainda aptos para sofrerem fecundação normal e desenvolvimento embrionário inicial, sendo necessário passarem por uma série de modificações estruturais e bioquímicas no núcleo (maturação nuclear) e citoplasma (maturação citoplasmática) 	
· É importante que ocorra tanto a maturação nuclear quanto a maturação citoplasmática! 
· Oócitos imaturos (prófase I) → MIV → oócitos maduros (metáfase II)
· A MIV garante a extrusão do primeiro corpúsculo polar 
· Garantia de condições e meios para que os oócitos se desenvolvam e passem pelo processo de maturação 
· Quando os oócitos são aspirados dos folículos ovarianos para serem utilizados na PIVE, eles ainda são imaturos e necessitam sofrer o processo de MIV
· Os meios de maturação são comerciais, ou seja, são comprados prontos 
· Para garantir a maturação in vitro, é necessário um meio de maturação e estufa para manter a atmosfera gasosa e temperatura controlada e adequada. O meio de maturação deve ter características similares à composição do fluido folicular
· Meio de maturação suplementado com antibióticos, soro fetal bovino/albumina, hormônios (LH, FSH)
· 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar e umidade saturada a 38,5°C
· A maturação confere aos oócitos a capacidade de serem fecundados e terem desenvolvimento embrionário normal
· 3) Fecundação/fertilização in vitro (FIV)
· Após estarem maturados, os oócitos estão prontos para serem fecundados 
· Processo em que o espermatozoide entra em contato com o oócito, gerando o zigoto, que, posteriormente, se desenvolve até o estádio de blastocisto
· A FIV (fertilização in vitro) é uma etapa da PIVE (produção in vitro de embriões), que consiste em colocar os oócitos maturados (após MIV) junto com os espermatozoides para fertilização e posterior formação dos embriões
· Incubação de oócitos maduros com espermatozoides capacitados, em meio de fecundação
· Antes da colocação dos espermatozoides, os oócitos são lavados em meio FIV 
· Os espermatozoides também precisam ser previamente preparados 
· Para fecundação, normalmente utiliza-se o sêmen criopreservado/convencional, mas o sêmen sexado e o sêmen a fresco também podem ser utilizados
· Na escolha do sêmen, a utilização do sêmen sexado (capaz de produzir descendentes machos ou fêmeas, ou seja, permite a seleção do sexo na concepção) permite reduzir o tempo para atingir certos objetivos
· Na maioria dos laboratórios, utiliza-se sêmen congelado/criopreservado para o processo de fecundação in vitro em bovinos. No entanto, após o descongelamento, é necessário selecionar os espermatozóides vivos e capazes de fecundar. Esta seleção é realizada, na maioria das vezes, pela separação em gradiente de Percoll, embora outros sistemas possam ser utilizados como o “swim-up” ou o lavado espermático
· Sêmen criopreservado: descongelar sêmen (37ºC/30 seg) → submeter o volume da palheta (0,25 ml) ao gradiente de Percoll para separar as células viáveis das não viáveis → centrifugação → separar, lavar e avaliar espermatozoides viáveis (motilidade/concentração) → espermatozoides viáveis → ajustar volume e depositar espermatozoides na gota de FIV com oócitos 
· O método de separação pelo gradiente Percoll permite a obtenção da fração espermática viva e viável após o descongelamento
· Espermatozóides e oócitos maduros são incubados em um meio específico
· Meio de fecundação contendo agentes capacitantes (heparina e epinefrina dão mais vigor e motilidade ao espermatozoide), albumina e antibiótico 
· 18 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar e umidade saturada a 38,5% 
· Capacitação espermática 
· Os espermatozoides devem passar a barreira de células do cumulus 
· No processo in vivo, os espermatozoides precisam chegar até a ampola da tuba uterina para fecundar o oócito, e que durante esse trajeto, substâncias presentes no sistema reprodutor da fêmea induzem a capacitação dos espermatozoides, onde se observam modificações bioquímicas que resultam na hiperativação espermática. Já no processo in vitro, para que ocorra todo esse processo, os meios e os protocolos usados devem fornecer um ambiente adequado, contendo agentes capazes de promover a capacitação espermática para que ocorra a fecundação
· Fecundação dos oócitos	
· O espermatozoide toca a zona pelúcida e o citoplasma, bloqueando a entrada de outros espermatozoides e iniciando o processo de fecundação 
· Os espermatozoides vivos são adicionados nas gotas de fecundação contendo os oócitos, garantindo assim a interação entre espermatozoide e oócito. Neste momento, ocorre a combinação do material genético dos gametas e a formação do zigoto
· Para que a FIV ocorra com sucesso é necessário que os oócitos tenham sofrido uma maturação completa e que os espermatozóides tenham sido adequadamentepreparados
· 4) Cultivo in vitro (CIV)
· Após fecundados, os presumíveis embriões estão prontos para serem cultivados
· Para isso, deve ser feita a retirada de excesso das células do complexo cumulus-oócitos dos embriões 
· Semelhante aos processos de maturação e fecundação, o cultivo embrionário in vitro também requer um ambiente adequado, com tempo, atmosfera e temperatura controlados. Desse modo, geralmente o tempo de cultivo in vitro é de 7 dias 
· São lavados e colocados em meio de cultivo SOF (sem ou com co-cultivo)
· Alta x baixa tensão de oxigênio 
· Alta tensão de oxigênio (20%)
· Baixa tensão de oxigênio (5%)	
· Benéfico para as células, pois diminuem-se as espécies reativas de oxigênio, produzindo então embriões de melhor qualidade (mais claros e com menor acúmulo de lipídeos)
· Porém, esses embriões são mais sensíveis à mudanças na tensão de oxigênio, então se a estufa for aberta com frequência para manipulação, os embriões podem sofrer alterações e perderem a qualidade 
· Feeding (suplementação do meio durante o cultivo) e avaliação da clivagem (divisões celulares iniciais do embrião) no dia 3 de desenvolvimento 
· Cultivo até o dia 7 de desenvolvimento → blastocisto 
· 80% de clivagem é uma taxa satisfatória 
· Período de desenvolvimento inicial → divisão celular → ativação do genoma embrionário (aproximadamente 8 células) → compactação (mórula → mórula compacta) → formação da blastocele (mórula → blastocisto) 
· No D7 espera-se encontrar o embrião em estádio de blastocisto, com blastocele (cavidade) e massa celular interna
· No 7º dia, o embrião deve ser transferido para a receptora ou criopreservado 
· 5) Criopreservação ou transferência dos embriões 
· Após cultivados, os embriões em forma de blastocisto são envasados em palhetas e diretamente transferidos à fresco para as receptoras devidamente protocoladas, ou podem também ser criopreservados (mantidos em nitrogênio líquido) antes de serem transferidos 
· Se o embrião for criopreservado, posteriormente terá que ser descongelado para ser transferido para a fêmea receptora 
· Embriões in vitro x in vivo (2019)
· In vivo: 60% do total de embriões produzidos in vivo transferidos foram de embriões criopreservados (240.000 de 400.000 embriões) 
· In vitro: 45% do total de embriões produzidos in vitro transferidos foram de embriões criopreservados (450.000 de 1.000.000 embriões) 
· O objetivo da criopreservação de embriões é manter a viabilidade embrionária por longo período em estado de letargia que seja reversível pós-descongelação 
· Vantagens:
· Aproveitamento dos embriões excedentes 
· Aproveitamento de receptoras excedentes 
· Facilidade de comércio 
· Escolha da data de parto 
· Banco de germoplasma 
· Crioprotetores (substituem e/ou removem a água intracelular):
· Os crioprotetores protegem o embrião para que ele seja viável mesmo após descongelação, tentando inibir a formação de cristais de gelo 
· Realiza-se uma desidratação do embrião 
· Penetrantes (atravessam a membrana celular): glicerol, etilenoglicol, DMSO
· Não penetrantes: sacarose, polivinilpirrolidona (PVP) 
· Métodos: 
· 1) Congelação lenta ou controlada: duração de aproximadamente 1h20 (mais aplicado para embriões produzidos in vivo) 
· Método mais difundido: aprimorado pela técnica da transferência direta (DT) 
· Por esse método, o embrião pode ser descongelado na propriedade mesmo e diretamente transferido para a receptora 
· Não há necessidade de remoção do crioprotetor 
· Crioprotetor: etilenoglicol (EG) 
· Método: 
· Lavar e manter os embriões por 10 min em meio crioprotetor a 35°C (1,5M de etilenoglicol) 
· Envase dos embriões (palhetas de 0,25 mL) 
· +6°C a -6°C/-7°C: queda de 1°C/min (5 min a -6°C) 
· Seeding (encosta a pinça mergulhada em nitrogênio líquido no local onde o embrião se encontra, para promover uma cristalização rápida): -6°C/-7°C (induzido com pinça/5 min a -6°C) 
· -6°C/-7°C a -33°C/-35°C: queda de 0,3°C a 0,5°C/min 
· -33°C/-35°C: imersos em nitrogênio líquido 
· Armazenamento em nitrogênio líquido 
· Descongelação (método com DT): 
· Retirada da palheta de dentro do botijão de nitrogênio líquido 
· 10 seg no ar 
· 30 seg em banho-maria a 35°C 
· Secar palheta e movimentá-la rapidamente para misturar as colunas 
· Praticidade e agilidade no processo 
· 2) Vitrificação: duração de aproximadamente 10 min (mais aplicado para embriões produzidos in vitro) 
· Método mais utilizado para embriões in vitro 
· Necessidade de altas concentrações de crioprotetor 
· Altas concentrações de crioprotetor formando solução viscosa que faz com que a água se solidifique em estado vítreo, sem formar cristais de gelo 
· O processo deve ser muito rápido, devido à alta toxicidade do crioprotetor (principalmente DMSO) 
· Baixo volume para ocorrer contato rápido com nitrogênio líquido 
· A criação e utilização da palheta OPS (open pulled straw) melhorou o processo (são palhetas menores que possibilitam congelação mais rápida e com menor risco de formação de cristais de gelo) e resultou em: 
· O primeiro bebê humano após a vitrificação do oócito 
· O primeiro animal clonado após a criopreservação de embriões 
· Geralmente não se realiza vitrificação de clones devido à baixa eficiência do método, então um processamento seria uma injúria a mais e diminuiria ainda mais essa eficiência. Porém, com a utilização dessas palhetas, mesmo com a redução da eficiência, é possível vitrificar clones 
· O primeiro bezerro após criopreservação de oócitos imaturos 
· As melhores taxas de desenvolvimento de sobrevivência após criopreservação de células ES humanas 
· Método: 
· Etapa 1: meio (7,5% etilenoglicol + 7,5% DMSO) por 1 minuto 
· Etapa 2: meio (16,5% etilenoglicol + 16,5% DMSO) por 20 segundos 
· Etapa 3: envase e imersão em nitrogênio líquido 
· Reaquecimento: 
· Processo complicado (tem que lavar o embrião antes de transferir, tem a dependência de equipamentos de laboratório e tem que envasar novamente para transferir) 
· Na vitrificação, o embrião deve ser lavado devido à toxicidade do crioprotetor (tem que retirar o crioprotetor!) 
· Retirada da palheta de dentro do botijão de nitrogênio líquido
· Etapa 1: primeira lavagem em meio (800 ul de meio HM (PBS + SFB) + 400 ul de meio SM (sacarose 0,5M) 
· Etapa 2: segunda lavagem em meio (800 ul de meio HM (PBS + SFB) + 400 ul de meio SM (sacarose (0,5M) 
· Envase para as palhetas 
· Transferência do embrião para a receptora
· Criopreservação lenta e vitrificação: ambas são utilizadas para criopreservação de embriões 
· A eficiência varia conforme a origem de produção do embrião (in vitro x in vivo), por isso dependendo do tipo do embrião, escolhe-se um tipo de criopreservação 
· Embrião produzido transferido para a fêmea receptora