Genética - Isolamento e Manipulação de Genes

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isolamento e manipulação de genes 
 
 
→ Exemplo: planta do tabaco, em que foi 
inserido o gene da luciferase do vagalume, 
fazendo essa planta fluorescente 
→ Como um gene é isolado e amplificado por 
clonagem? 
→ Temos que utilizar a tecnologia do DNA, que 
consiste nas técnicas coletivas para 
obtenção, amplificação e manipulação de 
fragmentos específicos de DNA 
→ Essa amplificação pode ser feita em células 
bacterianas vivas (in vivo) ou em tubos de 
ensaio (in vitro) 
→ Clonagem de DNA e PCR (Reação em Cadeia 
da Polimerase) 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
→ Também chamada de Clonagem de DNA; 
→ Clonagem: método utilizado para produzir 
cópias idênticas de uma molécula de DNA in 
vivo; 
→ Quem são agentes importantes nesse 
processo? 
→ Como em todos processos temos as enzimas, 
e as enzimas têm um papel fundamental 
nessa tecnologia do DNA recombinante 
→ Endonucleases de restrição: enzimas que 
reconhecem sequências específicas de DNA 
(em geral 4 a 6 pares de bases) e clivam a 
dupla fita (rompem a ligação fosfodiéster) 
→ Uma enzima de restrição cortará o DNA em 
vários fragmentos de restrição 
→ De acordo com o tipo de enzima de restrição 
que for utilizada, teremos diferentes 
padrões de corte, e isso é muito importante, 
pois direciona o processo 
→ Importante: essas endonucleases de 
restrição, ou seja, as extremidades coesivas 
geradas pelas enzimas de restrição 
permitem que quaisquer dois fragmentos de 
DNA possam ser unidos, desde que os 
fragmentos tenham sido gerados pela 
mesma nuclease de restrição, pois o padrão 
de corte vai ser o mesmo 
COMO É FORMADA UMA MOLÉCULA DE DNA 
RECOMBINANTE? 
→ Tenho que ter um vetor e um DNA de 
interesse, e vou usar a mesma endonuclease 
de restrição para fazer o mesmo tipo de 
corte em ambos, tanto no DNA do vetor, 
quanto no DNA de interesse 
→ Nesse figura usei a enzima EcoRI, cortei o 
meu vetor, e o meu DNA de interesse. Os 
cortes são iguais 
 
→ Depois eu uso uma enzima, chamada de DNA 
Ligase, que vai ser usada para ligar as 
extremidades do DNA, através de Ligações 
Covalentes (ligação fosfodiéster) 
→ Como o padrão de corte foi o mesmo, tem-se 
a sobreposição perfeita desses fragmentos, 
formando então a molécula de DNA 
recombinante 
→ Microscopia mostrando esse processo, 
cortei o vetor e o DNA de interesse com a 
mesma endonuclease, e a DNA ligase 
formando o DNA recombinante 
Amanda Barreiros – Medicina Ufes 
 
→ Mas como é o processo da tecnologia do DNA 
recombinante? 
TDR “VISTA GERAL” 
→ Primeiro: clivagem do DNA de interesse 
pelas Endonucleases de Restrição (ER); 
→ A mesma ER é usada para clivar o DNA de um 
vetor (no mesmo local, ou seja, no mesmo 
padrão de corte); 
→ Uso de DNA ligases para juntar as 
extremidades 
→ Foi formado o DNA Recombinante (DNA R) 
→ Esse DNA recombinante tem que ser 
inserido na células hospedeira 
→ E tenho que fazer a identificação da célula 
hospedeira que recebeu corretamente o 
vetor (normalmente uso um Gene que 
confira resistência a algum antibiótico) 
→ Depois vão ser Geradas várias cópias do DNA 
de interesse 
→ Então eu tenho o meu vetor, o DNA de 
interesse que foi cortado no mesmo local. 
Depois eu usei uma DNA ligase para unir 
esses fragmentos, formando o meu DNA 
recombinante. O DNA recombinante tem o 
gene de resistência e eu adiciono ampicilina 
ao meio. Essa bactéria recebeu o DNA 
recombinante, e essa não recebeu. Isso vai 
influenciar no que? Essa bactéria que não 
recebeu plasmídio, não tem gene de 
resistência ao antibiótico. Portanto não vai 
conseguir se manter viva no meio com 
ampicilina. Já a bactéria que recebeu 
corretamente o vetor tem o gene de 
resistência. Conclusão: apenas as bactérias 
que receberam corretamente o plasmídio e 
possuem o “Gene de Resistência” a 
antibiótico sobreviverão. 
 
→ E ai eu tenho várias cópias do meu DNA de 
interesse 
→ Quem são os vetores? 
VETORES 
→ Sãos os veículos responsáveis pela inserção 
do DNA de interesse na célula hospedira 
→ Tipos de vetores principais: 
o Plasmídeo 
o Bacteriófago 
o Fosmídeos 
o Cromossomo Artificial Bacteriano 
(BAC) 
 VETOR: PLASMÍDEO 
→ São pequenas moléculas circulares de 
DNA que replicam o seu DNA 
independentemente do cromossomo 
bacteriano 
→ Possuem genes de resistência a fármacos 
(antibióticos) e fornecem um método 
eficiente de selecionar as células 
transformadas 
→ Desvantagem: aceitam insertos de DNA 
estranho de apenas 100pb – 10 kb 
 VETOR: BACTERÍOFAGO 
→ Abriga DNA como um inserto 
“compactado” na partícula do fago 
→ Vetor de clonagem efetivo para insertos 
de DNA com comprimento de 10 a 15 kb 
 VETOR: FOSMÍDEO 
→ São vetores que podem levar insertos de 
35 a 45 kb 
→ Eles são híbridos criados por engenharia 
genética de DNA do fago  e DNA de 
plasmidio bacteriano 
→ O inserto humano pode compreender até 
80% da capacidade do fosmídeo 
 VETOR: CROMOSSOMO ARTIFICIAL BACTERIANO 
(BAC) 
→ Vetor mais popular para a clonagem de 
insertos muito grandes de DNA 
→ Derivado do plasmidio F, ele carreia 
insertos de 100 a 200kb, uma 
quantidade muito grande de material 
genético 
→ Inserto humano compreende até 90% do 
BAC 
→ Quanto melhor a capacidade desse vetor 
carregar um inserto humano, mais 
eficiente ele vai ser 
 
→ Resumo: 
→ Qual a quantidade cada um desses 
vetores conseguem carregar 
 
→ Como encontrar um ácido nucleico 
específico em uma mistura de ácidos 
nucleicos? 
→ O primeiro passo para encontrar um 
ácido nucleico específico em uma 
mistura de ácidos nucleicos é a 
eletroforese 
→ Eletroforese é uma técnica de separação 
de partículas carregadas, quando 
submetidas a um campo elétrico, sejam 
proteínas, DNA ou RNA 
ELETROFORESE 
→ Precisa de um suporte (matriz ou gel), que 
podem ser feitas de diferentes substâncias, 
podem ser Geis de agarose, Géis de 
poliacrilamida, que servem como suporte. 
Formam tramas de poros de tamanhos 
variáveis, que possibilitam a separação 
→ Trama formada por esse suporte, uma 
mistura de macromoléculas. As moléculas 
menores migram com mais velocidade, pois 
conseguem passar com maior facilidade por 
essa trama. As moléculas maiores têm maior 
dificuldade, então ficam mais retidas 
PARA O DNA 
→ A técnica é: 
→ 1º: uma mistura de moléculas lineares de 
DNA é colocada em cubas contendo gel de 
agarose 
→ O gel é orientado de maneira que as 
concavidades estejam na extremidade 
catódica (de carga negativa) e o DNA migre 
para a extremidade anódica (de carga 
positiva), por causa de sua carga negativa 
→ O DNA por ser um ácido possui carga 
negativa 
→ A velocidade de migração das moléculas de 
DNA no gel é inversamente dependente do 
seu tamanho. Portanto, os fragmentos em 
classes de tamanhos distintos vão formar 
bandas distintas no gel, que pode ser 
visualizadas corando-se o DNA com brometo 
de etidio, que faz com que ele fique 
fluorescente a luz ultra-violeta 
→ O tamanho absoluto de cada fragmento na 
mistura pode ser determinado comparando 
sua distância de migração com um conjunto 
de fragmentos padrão de tamanhos 
desconhecidos 
→ Southern blotting: 
→ É utilizado para DNA 
→ Técnica: 
→ 1. O DNA é separado por eletroforese 
→ 2. A membrana é hibridizada com a sonda 
marcada 
→ 3. Um autorradiograma revelara quaisquer 
bandas no gel que sejam complementares a 
sonda 
→ A comparação dessas bandas com 
marcadores revela o número e o tamanho 
dos fragmentos nos quais as sequências-alvo 
são encontradas 
 
→ Como o DNA é amplificado sem clonagem? 
Ou seja, como é a amplificação de um gene in 
vitro? 
PCR (REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE) 
→ Método para produzir cópias de um 
segmento de DNA específico 
→ Um sistema de clonagem “in vitro” 
→ Reagentes utilizados nessa técnica: 
o Iniciadores “Primers” 
o Taq polimerase 
o dNTP’s (ATCG) 
o MG²+ 
o Tampão Tris-HCl 
→ Figura do magnésio no sítio daenzima, ele é 
um cofator, e aqui a molécula de DNA 
 “PRIMERS” OU INICIADORES: 
→ São utilizados dois “primers”, que delimitam 
o segmento amplificado e determinam o 
crescimento exponencial do número de 
moléculas de DNA 
→ Enzima Taq Polimerase: 
→ Faz a polimerização, é uma enzima que foi 
isolada da bactéria Thermus thermophilus 
de águas quentes, e por isso ela suporta altas 
temperaturas 
→ Polimerização é feita por uma DNA 
polimerase termoestável 
→ É utilizada uma fita molde de DNA 
→ A polimerase catalisa a síntese da fita 
complementar levando ao pareamento 
perfeito das bases – dupla hélice 
→ Todas fazem adição 5’-3’ 
→ Etapas do PCR 
→ 1ª: extração do DNA de interesse, posso 
extrair esse DNA de sangue, de material 
dentário, de ossos, de cabelo (bulbo capilar – 
onde tem o material genético) 
→ Depois vou misturar esse DNA com o “Mix”, 
que contém todos aqueles reagentes 
→ E coloco isso então no Termociclador 
→ Termociclador: equipamento em que vamos 
colocar diferentes temperaturas para que o 
processo aconteça 
→ 1 – temperatura para separar filamentos de 
DNA (95°) 
→ 2 – depois uma temperatura para anelar os 
“Primers” (55° a 65°) 
→ 3 – e depois uma temperatura para sintetizar 
nova fita de DNA através da Taq Polimerase 
(72°) 
→ Tenho a região que quero que seja 
amplificada; vai adicionar os reagentes e vai 
aquecer para separar a fita, e vai esfriar para 
que os primers possam se anelar; depois 
aquece a 72°C para permitir a síntese de 
DNA 
 
→ Esse passo a passo é repetido várias 
vezes 
→ E depois de 25 ciclos, a sequência-alvo foi 
amplificada em cerca de 106 vezes, o que 
é uma quantidade muito boa 
 
 
 
→ Assistir a vídeo aula: como funciona o PCR 
em tempo real e qual a vantagem em relação 
ao PCR “convencional” 
→ Como o DNA é analisado após a clonagem? 
→ Depois da clonagem partimos para o 
sequenciamento 
→ Desde 1996 já se utiliza o sequenciamento 
automático de DNA 
→ Aplicação prática do sequenciamento: caso 
da Angelina Jolie, ela tinha mutação no gene 
BRCA 1 e 2 e histórico familiar de câncer de 
mama, então por isso ela retirou os seios e o 
ovário 
→ Importância de fazer o sequenciamento e 
identificar mutações, que da ao paciente a 
opção de fazer uma cirurgia preventiva do 
desenvolvimento de câncer 
→ Outra aplicação do sequenciamento muito 
interessante: genética forense 
→ A impressão genética, os Fingerprints do 
DNA diz que o perfil genético consiste em um 
padrão do DNA que provê forte evidência de 
identidade individual de cada pessoa 
→ Os perfis de DNA têm sido utilizados 
rotineiramente para identificar ou distinguir 
indivíduos, sendo uma ferramenta valiosa 
nos casos de identidade incerta como 
paternidade, casos de estupro, assassinato 
→ Como funciona a técnica: 
→ 1º - extração de DNA de diversas fontes 
→ 2º - PCR para vários marcadores 
moleculares (com cores diferentes) 
→ 3º - sequenciamento automático 
→ 4º - análise do perfil genético 
→ Temos PCR para vários marcadores 
moleculares diferentes 
→ Como se observa o resultado do 
sequenciamento? No caso dos Exames de 
Paternidade 
→ Tenho no meio o perfil genético da criança, 
vou comparar esse material, comparar a 
informação genética, com o material que 
veio da mãe e, o restante eu comparo com o 
do pai 
→ Compara-se a informação genética que veio 
da mãe e, o restante, obrigatoriamente vem 
do “Suposto Pai” 
→ Como se observa o resultado do 
sequenciamento? Em investigação criminal 
→ Ex: Material genético que foi obtido de 
sangue na cena do crime e aqui vários 
marcadores. Esse material genético 
encontrado na cena do crime é do suspeito 1 
ou 2? Suspeito 2, pois o material genético 
dele bate diretamente com o material 
genético que foi obtido na cena do crime. 
Isso é muito importante para resolver vários 
casos nessa área de genética forense 
ENGENHARIA GENÉTICA 
→ Consiste no uso de técnicas de DNA 
recombinante para alterar o genótipo e o 
fenótipo de organismos 
→ Um gene introduzido em uma célula ou 
organismo é chamado de transgene, para 
distinguir do gene endógeno 
→ O organismo que carrega o gene introduzido 
é dito transgênico 
 
→ Exemplo de Terapia gênica: foi 
diagnosticado um distúrbio genético 
recessivo chamado SCID (doença de 
imunodeficiência combinada grave – 
sistema imune não funcional), mais 
comumente conhecida como doença do 
menino da bolha 
→ Com relação a SCID, um gene ADA normal é 
“transplantado” para células do sistema 
imunológico do paciente, possibilitando 
assim a sobrevivência e a função normal 
dessas células 
→ O sistema imunológico da maioria dos 
pacientes mostrou melhora significativa 
→ Entretanto, a terapia teve um grave feito 
colateral: dois dos pacientes desenvolveram 
leucemia 
→ Em ambos os pacientes, o vetor retroviral 
inseriu-se (integrou-se) perto de um gene 
celular cuja expressão aberrante está 
associada a leucemia 
→ Bioética 
→ Questões importantes que devem ser 
avaliadas 
→ Bioética e direitos humanos 
→ O que é a verdade em matéria de ciência e 
tratamento? 
→ A vida humana deve ser preservada 
independente de sua qualidade 
→ É lícito adiar o morrer prolongando o sofrer? 
→ Vale a pena prolongar a vida física de quem 
já perdeu a dignidade de viver? 
→ Desafios da terapia gênica 
→ Problema da indução de mutagênese 
→ Necessidade de regulação precisa da 
atividade gênica 
→ Aspectos éticos e morais 
→ Conhecimento do metabolismo celular e seu 
controle 
→ Doenças causadas por regulação de vários 
genes 
→ Esperança: edição do DNA 
→ Para casa: descrever como funciona a 
técnica de CRISPR, técnica que nos promete 
a edição do DNA