Questionário Métodos Imunológicos - Biofísica II

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Métodos Imunológicos
Brendha C. B. Martins
1. Com base nos materiais disponíveis, construa um método imunológico para detectar
se uma proteína qualquer se encontra dentro ou fora do núcleo de células em
cultura. imunocito
É viável a utilização do método de imunocitoquímica, no qual é possível realizar a
determinação de vários aspectos. Dentre eles, a avaliação de células em suspensão e
tecidos, assim como a obtenção de informações sobre a distribuição de tecido de uma
determinada proteína e sua distribuição subcelular, visualizando a localização de vários
componentes celulares, proteínas, tecidos entre outros. Neste caso, pode-se aplicar a
técnica indireta, em que são utilizados dois anticorpos: primário e secundário. Os anticorpos
a serem escolhidos devem ser um anticorpo primário para a proteína e um secundário com
composto fluorescente, para que possa ser identificado através da microscopia. Para que
isso aconteça, é necessário fixar a célula por alguma substância química, como o metanol,
por exemplo, e seguir com os procedimentos de preparação, como as lavagens e a
incubação com o anticorpo. O anticorpo secundário se liga de forma específica ao anticorpo
primário, de modo a conferir fluorescência, que pode ser detectada através de microscopia
óptica de fluorescência. Tornando-se assim possível identificar a localização da proteína.
2. É possível aplicar o método acima em células vivas? Justifique
Como a imunocitoquímica requer a fixação das células, por meio de substâncias químicas
como o metanol e o paraformaldeído, este método não seria o indicado para aplicação em
células vivas. Isto pois o processo de fixação, que tem como objetivo preservar a estrutura
celular, acaba por matar as células, a fim de evitar a destruição da célula por suas próprias
enzimas (autólise) e proteger para que resistam às etapas seguintes.
3. Com base nos materiais disponíveis, construa um método imunológico para detectar
se uma proteína qualquer está fosforilada ou não. (western?/imunocito)
O Western blot é uma técnica geralmente utilizada para detectar, identificar e analisar as
proteínas, através de anticorpos específicos. Como as proteínas, neste método, são
identificadas por meio da “ligação” com anticorpos específicos, ele pode ser utilizado para
detectar a presença de proteínas fosforiladas, estas agindo como antígenos. O
procedimento é iniciado com a preparação da amostra com os procedimentos padrão, para
posterior eletroforese em gel, e mistura da mesma com SDS. Em seguida, é realizada a
separação das proteínas, conforme tamanho, através de eletroforese em gel. Para a
eletroforese seria necessário utilizar uma fonte de eletroforese e cuba de eletroforese. As
proteínas, então separadas, são transferidas para uma membrana, como a de nitrocelulose,
por meio de uma cuba de eletrotransferência e a membrana é bloqueada para evitar a
ocorrência de reações inespecíficas. A membrana é incubada com anticorpo primário, com
afinidade pela proteína de interesse, e lavada, a fim de retirar qualquer anticorpo primário
que não tenha se ligado. A incubação é realizada novamente, porém com anticorpo
secundário com fluoróforo, que permite a detecção e visualização da proteína de interesse.
Outro método que pode ser utilizado é a imunocitoquímica, por meio da qual os anticorpos
se ligam a um antígeno alvo específico. A amostra é preparada por meio dos procedimentos
já conhecidos e, então, é necessária a escolha de um anticorpo com afinidade pela proteína
fosforilada, para efetiva detecção. Neste caso, a fluorescência do fluoróforo ligado ao
anticorpo permitiria a identificação da fosforilação na proteína, através da microscopia de
fluorescência.
4. Considerando o método acima, qual a importância da espécie animal em que um
certo anticorpo foi desenvolvido?
Para o método ser efetivo, o anticorpo secundário deve ser específico para o animal em que
os anticorpos primários foram desenvolvidos.
5. Com base nos materiais disponíveis, construa um método imunológico para detectar
se uma proteína qualquer está ligada a outras proteínas dentro da célula ou não.
(imunoprecipitação) e western?
A imunoprecipitação é normalmente utilizada para a análise de interações proteína-proteína,
caracterização de complexos proteicos e identificação de modificações pós-traducionais.
Nesta técnica, a molécula de interesse (proteína) é isolada em uma solução por sua ligação
a um anticorpo, de modo a formar um complexo antígeno-anticorpo. Logo, este método
pode ser utilizado para a resolução do proposto. O procedimento é iniciado com a lise das
células em um tampão não-desnaturante, a fim de manter as interações proteína-proteína.
Então, adiciona-se o anticorpo, com afinidade pela proteína e a proteína ligada à agarose.
Tais esferas, nas quais estão ligados os anticorpos e antígenos, são precipitadas através de
centrifugação e o sobrenadante é descartado. O precipitado é dissolvido em solução de
SDS-PAGE para a análise do antígeno em eletroforese. A eletroforese é uma técnica de
separação de moléculas, através da migração de partículas, em um gel, sob influência de
um campo elétrico. Portanto, o padrão de bandas visualizado na eletroforese permitiria a
inferência sobre a existência de outras proteínas.
6. O método acima é semelhante a qual tipo de cromatografia? Justifique e mencione
uma diferença entre os métodos.
A imunoprecipitação é semelhante a cromatografia de afinidade, pois ambas fazem uso da
interação específica entre molécula e ligante para promover a separação do composto de
interesse. No entanto, na cromatografia de afinidade, o anticorpo precisa estar ligado a uma
fase estacionária para que na passagem do lisado com o antígeno, o mesmo fique
retido/interaja na fase estacionária, por conta da afinidade, possibilitando a devida
separação. Na imunoprecipitação, o anticorpo (com afinidade pela proteína) que se liga às
esferas de agarose é adicionado ao lisado. Estes são submetidos a centrifugação e o
precipitado é dissolvido para a análise do antígeno em eletroforese.
Outra semelhança que normalmente ocorre é o uso de esferas de agarose, que na
cromatografia de afinidade estão localizadas na coluna e na imunoprecipitação se ligam aos
anticorpos para promover a precipitação do antígeno.
A cromatografia de afinidade é uma técnica de separação com base no reconhecimento
específico entre uma proteína e um ligante.na qual a interação antígeno-anticorpo é
explorada para a separação de moléculas
https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learnin
g-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunoprecipitation-ip.html
#:~:text=Immunoprecipitation%20is%20one%20of%20the,blotting%20and%20other%20ass
ay%20techniques.
7. Você tem células não tratadas e tratadas com fármaco F, que se supõe induzir o
aumento da fosforilação da proteína Akt citosólica com consequente translocação
para a membrana. Qual método imunológico você utilizaria para saber se a Akt é
fosforilada na posição 473 pelo tratamento com o fármaco F? Quanto? (western?)
Como já mencionado, o Western blot é utilizado para detecção, identificação e análise de
proteínas, por meio de anticorpos específicos. Por conta destas aplicações, este método
pode ser utilizado para a resolução do proposto. Primeiramente, as células devem ser
lisadas com o uso de um tampão de lise e as proteínas devem ser separadas em
eletroforese por SDS-PAGE. Como o gel de eletroforese não é o meio mais adequado para
imunodetecção, em seguida, as proteínas, agora separadas, devem ser transferidas para a
membrana de nitrocelulose, através de uma cuba de eletrotransferência. Estas membranas
são bloqueadas com leite em pó para que os anticorpos se liguem apenas ao antígeno. O
anticorpo primário Anti-phospho-Akt 473, que possui afinidade pelo antígeno (proteína) é
adicionado. Este é reconhecido pelo anticorpo secundário que será adicionado, o Anti-IgG
de coelho-peroxidase, que se liga ao substrato para a enzima peroxidase com agente
quimioluminescente.Através do filme fotográfico sensível a agente quimioluminescente é
possível inferir sobre a quantidade de proteína fosforilada. Como essa técnica é aplicada
para duas condições, células tratadas e não tratadas, através da comparação dos
resultados obtidos pode-se estimar sobre a quantidade de fosforilação induzida pelo
fármaco F. Este processo é refeito, porém com o Anti-Akt como anticorpo primário nesta
vez, a fim de obter mais informações sobre a quantidade de Akt presente nas células.
Dessa maneira, através da comparação dos resultados obtidos nos dois procedimentos,
pode-se concluir se o tratamento induz o aumento da fosforilação da proteína.
8. Qual método imunológico você utilizaria para saber se a Akt se transloca para a
membrana com o tratamento com o fármaco F? (imunocito)/(centrifugação e
western)
Como já mencionado, a imunocitoquímica permite a determinação de vários aspectos,
sendo um deles a localização de vários componentes celulares, proteínas e tecidos. Sendo
assim, se aplica a técnica indireta, na qual se utilizam um anticorpo primário e um
secundário. Uma vez que o tratamento com o fármaco F se supõe induzir o aumento da
fosforilação da Akt, deve se utilizar como anticorpo primário o Anti-phospho-Akt 473, de
modo que o secundário seja específico para o animal em que o primário foi desenvolvido,
ou seja, Anti-IgG de coelho-FITC. É realizada a fixação da célula, que será colocada em um
tampão permeabilizante celular, pois este permite que os anticorpos entrem na célula para
detecção da proteína. Após adicionado o anticorpo primário, são seguidos os
https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunoprecipitation-ip.html#:~:text=Immunoprecipitation%20is%20one%20of%20the,blotting%20and%20other%20assay%20techniques
https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunoprecipitation-ip.html#:~:text=Immunoprecipitation%20is%20one%20of%20the,blotting%20and%20other%20assay%20techniques
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https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunoprecipitation-ip.html#:~:text=Immunoprecipitation%20is%20one%20of%20the,blotting%20and%20other%20assay%20techniques
procedimentos de preparação, sendo realizadas as lavagens e a incubação e a célula é
tratada com o anticorpo secundário. Desse modo, é possível indicar a localização da
proteína, através de microscopia óptica de fluorescência, pois a mesma apresentará
coloração (verde).
9. Qual método imunológico você utilizaria para saber se a Akt translocada para a
membrana está mais ou menos fosforilada do que a que está no citosol? (imunocito)
Pode-se aplicar novamente a imunocitoquímica na técnica indireta, sendo que neste caso
se utilizaria dois anticorpos primários e secundários, com fluoróforos ligados a anticorpos
diferentes. Isto pois, deseja-se comparar a Akt que está na membrana com a do citosol para
que seja possível concluir qual a mais fosforilada, por meio das diferentes cores. Para que
isso seja realizável, é necessário fixar a célula. Desse modo, seguindo todos os
procedimentos de preparação já conhecidos, pode-se tratá-la com um anticorpo primário
para proteínas não fosforiladas, o Anti-Akt que seria reconhecido pelo anticorpo secundário
Anti-IgG de camundongo-rodamina e outro anticorpo primário para proteínas fosforiladas, o
Anti-phospho-Akt 473, reconhecido pelo anticorpo secundário Anti-IgG de coelho-FITC. O
anticorpo Anti-IgG de camundongo-rodamina está ligado a um fluoróforo (rodamina)
vermelho, o que na microscopia permitiria a visualização da posição da Akt presente na
célula, enquanto o Anti-IgG de coelho-FITC, ligado a fluoróforo (FITC) verde, permitiria a
identificação da Akt fosforilada. Dessa forma, torna-se viável a comparação entre ambas,
por meio de microscopia óptica de fluorescência, possibilitando detectar a localização das
proteínas mais fosforiladas (verdes).
10. Qual método imunológico você utilizaria para saber se a Akt fosforilada liga em
proteínas diferentes do que a não fosforilada? (imunoprecipitação)
Como já mencionado, a imunoprecipitação é utilizada para a análise de interações
proteína-proteína, portanto, pode ser aplicada para a resolução do proposto. A técnica é
iniciada com a lise das células em um tampão que mantenha as interações entre proteínas.
Realiza-se uma centrifugação para a sedimentação das organelas não lisadas. Então, são
adicionados os anticorpos primários, em tubos diferentes, Anti-Akt e Anti-phospho-Akt 473
juntos com a esfera de agarose ligada a proteína A, a qual possui afinidade por anticorpos.
Este complexo formado é submetido a centrifugação e o sobrenadante é descartado. O
precipitado, por sua vez, deve ser dissolvido para a análise da proteína por eletroforese. O
gel de eletroforese deve ser corado com o corante de proteínas Coomassie blue, para
visualização das proteínas de interesse. As bandas de proteínas associadas obtidas na
corrida da eletroforese devem ser recortadas para posterior análise no espectrômetro de
massas, utilizado para identificação das proteínas. Isto pois, através do resultado obtido na
espectrometria pode-se identificar as proteínas associadas e concluir se há a ligação das
proteínas de interesse (Akt e Akt fosforilada) com proteínas diferentes.
Ao comparar as bandas obtidas nos dois procedimentos, pode-se concluir se a proteína
fosforilada se liga em proteínas diferentes, através da visualização de bandas diferentes,
que indicam presença de outras proteínas.
A imunoprecipitação é normalmente utilizada para a análise de interações proteína-proteína,
caracterização de complexos proteicos e identificação de modificações pós-traducionais.
Nesta técnica, a molécula de interesse (proteína) é isolada em uma solução por sua ligação
a um anticorpo, de modo a formar um complexo antígeno-anticorpo. Logo, este método
pode ser utilizado para a resolução do proposto. O procedimento é iniciado com a lise das
células em um tampão não-desnaturante, a fim de manter as interações proteína-proteína.
Então, adiciona-se o anticorpo, com afinidade pela proteína e a proteína ligada à agarose.
Tais esferas, nas quais estão ligados os anticorpos e antígenos, são precipitadas através de
centrifugação e o sobrenadante é descartado. O precipitado é dissolvido em solução de
SDS-PAGE para a análise do antígeno em eletroforese. A eletroforese é uma técnica de
separação de moléculas, através da migração de partículas, em um gel, sob influência de
um campo elétrico. Portanto, o padrão de bandas visualizado na eletroforese permitiria a
inferência sobre a existência de outras proteínas.