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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
Unidade II
5 NOÇÕES GERAIS DE TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
O século XXI é um momento particularmente emocionante para as ciências biomédicas. Houve grande 
avanço nos métodos para analisar células, proteínas, DNA e RNA, gerando uma imensa quantidade de 
informações e permitindo que os cientistas estudassem as células e suas macromoléculas de maneiras 
inimagináveis. Veremos agora os métodos clássicos da biologia molecular utilizados para estudar o DNA, 
RNA e proteínas.
5.1 Extração de ácidos nucleicos
De forma geral, o primeiro passo para estudos de expressão gênica e caracterização de transcritos 
é a extração de DNA e RNA a partir de tecidos e/ou células. A extração pode ser realizada a partir de 
diferentes organismos como bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e animais. Diversos métodos foram 
estabelecidos para isolar as moléculas de DNA e RNA a partir de materiais biológicos como sangue, 
saliva, células epiteliais, urina e outros fluidos corporais. Não há um método padrão para o isolamento 
dos ácidos nucléicos, existe uma infinidade de protocolos e reagentes específicos para cada tipo de tecido 
e/ou células. Cada um deles é destinado a aplicações distintas, muitas vezes uma metodologia usada 
para fins diagnósticos, por exemplo, pode não ser a mais adequada para determinação de paternidade 
ou para a prática de PCR, uma técnica muito sensível.
A extração feita a partir de kits comerciais, com tubos e reagentes específicos de cada empresa, é 
uma forma mais simples e geralmente com maior reprodutibilidade e qualidade da extração tanto de 
DNA quanto de RNA. Esses kits utilizam colunas “filtrantes” nos tubos de extração; o que aumenta o 
rendimento das amostras e diminui o tempo do procedimento, em comparação à extração convencional 
a partir de solventes. Apesar de a qualidade e o rendimento dos ácidos nucléicos serem melhores, o 
custo desses tipos de kits muitas vezes é um fator limitante para sua utilização.
5.1.1 Extração de DNA
Em sua forma original de dupla fita, o DNA apresenta alta estabilidade, é muito resistente e se 
mantém inalterado em várias condições de meio. Entretanto, alguns cuidados são aconselháveis, para 
que seja evitada a degradação das amostras obtidas em laboratório. Uma vez que o DNA é vulnerável a 
forças leves, a pipetagem ou agitação pode gerar tensão na molécula e quebra das ligações fosfodiéster. 
A extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos: 1) lise das células (citólise) e 2) purificação 
do DNA. Após a citólise o DNA deve ser separado dos restos celulares e das proteínas, precipitado e 
suspenso em água ultrapura ou solução tampão adequada.
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Unidade II
A amostra de sangue periférico é a mais utilizada para extração de DNA a partir de leucócitos. 
Inicialmente, o sangue periférico é diluído em tampão concentrado de cloreto e bicarbonato de amônio, 
com a finalidade de promover lise das hemácias e obter pellet leucocitário. Em seguida, o rompimento 
da membrana leucocitária e liberação do DNA são realizados com o auxílio de enzimas proteases e 
reagentes desnaturantes em solução de pH alcalino e temperatura entre 37 ºC e 56 ºC. Na presença da 
solução salina saturada, as proteínas se precipitam e são descartadas. Posteriormente, na presença do 
etanol absoluto ocorre precipitação do DNA e, dessa maneira, torna-se possível separá-lo. Finalmente, o 
DNA é ressuspendido em água ou tampão.
A seguir, é apresentado um protocolo de extração do DNA genômico em leucócitos de sangue 
periférico, como sugestão do procedimento (LIPAY, 2015). Analise-o cuidadosamente e identifique as 
etapas citadas anteriormente. Além disso, identifique a protease e o agente desnaturante responsáveis 
pela lise da membrana dos leucócitos.
Protocolo para extração do DNA a partir de sangue periférico:
• Material: 8 mL de sangue periférico coletados em tubo contendo EDTA.
• Hemólise: transferir o sangue total para um tubo de 50 mL, adicionar 20 mL de tampão 
1× de 0,144 M cloreto de amônia (NH4Cl) + 0,001 M de bicarbonato de amônia (NH4CO3), agitar 
em agitador de soluções por aproximadamente 30 s, incubar a 4 ºC por 10 min e centrifugar a 
3.000 rpm por 10 min a 4 ºC.
• Lavagem: descartar o sobrenadante e adicionar 20 mL do mesmo tampão. Em agitador de soluções, 
agitar por 30 s para ressuspender o sedimento leucocitário. Incubar por 10 min a 4 ºC. Centrifugar 
por 10 min a 3.000 rpm na temperatura de 4 ºC.
• Lise: descartar o sobrenadante, retirar o excesso de sangue. Ao sedimento leucocitário, adicionar:
— 200 μL de SDS 10% (dodecil-sulfato de sódio).
— 3 mL de um segundo tampão preparado com 10 mM (0,010 M) Tris HCl pH 8 + 400 mM (0,400 M) 
NaCl + 2 mM (0,002 M) EDTA pH 8.
— 500 μL de um terceiro tampão preparado com 50 μL de SDS 10% + 2 μL de EDTA 0,5 M pH 8 + 
488 mL de água ultrapura + proteinase K.
— Observação: a proteinase K deve ser diluída no terceiro tampão antes de ser adicionada na 
reação de extração, ou seja, 2 μL de proteinase K na concentração de 20 mg/mL são suficientes 
para diluir em 5 mL do terceiro tampão, e esse volume é suficiente apenas para 10 amostras. No 
caso de maior quantidade de amostra, sugere-se realizar cálculo proporcional. Após adicionar 
todas as soluções anteriores, incubar a 37 ºC em estufa por 12 a 18 h.
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• Precipitação: adicionar 1 mL do quarto tampão de NaCl 6 M, preparado com 175,3 g de NaCl, 
e completar o volume com 500 mL de água ultrapura. Misturar vigorosamente durante 1 min 
em agitador de soluções e centrifugar 3.000 rpm por 20 min a 4 ºC. Fazer a transferência do 
sobrenadante para tubo de 15 mL. Em seguida, adicionar 3 a 4 mL de etanol 100% mantido a 
–20 ºC, “capturar” o DNA precipitado com auxílio de uma ponteira e transferir para criotubo de 
1,5 mL, que já deve conter 1 mL de etanol 70%. Essa etapa deve ser realizada em recipiente 
com etanol 70% mantido a -20 ºC contendo gelo, a fim de promover menores temperaturas. 
Centrifugar a 4 ºC por 15 min a 13.500 rpm, descartar o sobrenadante e aguardar evaporar 
o etanol à temperatura ambiente e em local seco e preservado de contaminação (ideal entre 
12 e 8 h). Após a secagem, ressuspender o sedimento (DNA) em 1 mL de TE 1× preparado a 
10 mM Tris-HCl pH 8 + 1 mM EDTA pH 8 ou hidratado em volume de água ultrapura estéril. 
Aguardar de 12 a 18 h para utilizar o DNA. O volume da solução para hidratar depende da 
concentração final de DNA desejada. Na maioria dos casos, pode-se hidratar com 1 mL.
5.1.2 Extração de RNA
O processo de extração do RNA, assim como do DNA, envolve a lise celular e a posterior purificação 
do RNA. Entretanto, diferente do DNA, o RNA é altamente instável, ou seja, facilmente degradado. A 
maior dificuldade no processo de extração de RNA é evitar a ação das ribonucleases (RNases) ativas nos 
tecidos, enzimas muito estáveis responsáveis por essa degradação. Sendo assim, a primeira etapa na 
maioria dos métodos de isolamento de RNA após a homogeneização do tecido é a imediata exposição 
desse material a tampões de extração que apresentam substâncias como o cloreto de lítio, que auxilia 
a precipitação do RNA, e o isotiocianato de guanidina, que permite a manutenção do RNA intacto 
nas etapas posteriores da extração por meio da degradação das ribonucleases endógenas (SAMBROOK; 
RUSSEL, 2002).
Evitar a contaminação com microrganismos é obrigatório quando se trabalha com RNA. É possível 
encontrar com facilidades RNases provenientes de fungos e bactérias que habitam a microbiota da 
nossa pele. Dessa forma, o uso de luvas, além da esterilização de toda estação de trabalho com inibidor 
de RNase é imprescindível na garantia de obtenção de RNA íntegro e de boa qualidade ao final do 
processo de extração.
5.2 Reação de polimerização em cadeia (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR – polymerase chain reaction) é considerada uma técnica 
de biologia molecular revolucionária. Desenvolvida por Kary Banks Mullis (prêmio Nobelde química de 
1993) em abril de 1983, essa técnica consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos. A PCR 
apresenta ampla gama de aplicações em vários ramos da pesquisa científica e diagnóstico. A utilização 
da PCR permite que uma determinada região do genoma de qualquer organismo possa ser amplificada 
e multiplicada em milhões de cópias. Os elementos envolvidos na reação de PCR, basicamente, são os 
mesmos presentes no processo de replicação que ocorre nas células.
Para que seja possível o processo de amplificação de um segmento de DNA específico, é necessário 
que as extremidades da sequência de pares de bases sejam conhecidas. Os iniciadores ou primers que 
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delimitam e são complementares à região alvo de amplificação apresentam cerca de 15 a 25 nucleotídeos de 
extensão. Os primers são projetados de modo que um é complementar ao filamento de uma molécula 
de DNA em um lado da sequência alvo e o outro é complementar ao outro filamento da molécula de 
DNA no lado oposto da sequência alvo.
Para que ocorra a PCR, é necessária a presença dos seguintes componentes: DNA genômico total 
ou uma população de cDNA; DNA polimerase termoestável; primers, tampão (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 
50 mM KCl), cloreto de magnésio (cofator da reação) e nucleotídeos necessários para a síntese das novas 
fitas de DNA (dNTPs: dATPs, dTTPs, dCTPs e dGTPs).
Durante o procedimento, as amostras devem ser submetidas à combinação adequada de temperatura 
e de tempo. Cada ciclo da PCR apresenta três fases fundamentais: desnaturação, anelamento e extensão. 
A desnaturação ocorre por meio da elevação da temperatura para cerca de 94 ºC a 95 ºC. Nessa fase, o 
DNA perde sua estrutura de dupla hélice, separando as duas fitas. Dessa forma, o DNA os primers podem 
ligar à região complementar a sua sequência na fita simples que foi exposta. Uma vez desnaturado 
o DNA, a temperatura da reação é reduzida para a temperatura de anelamento (50 a 70 ºC) e 
ocorre o pareamento dos primers por meio de ligações de hidrogênio ao DNA-alvo de fita simples. A 
temperatura de anelamento é sempre específica para cada par de primers e depende da quantidade de 
citosina e guanina da sequência a ser amplificada.
A última etapa do processo é a extensão. Nesse momento, a temperatura é elevada até cerca de 
72 ºC, para que a enzima DNA polimerase (Taq-DNA-polimerase) se posicione junto aos primers que se 
anelaram anteriormente e seja iniciada a síntese da cadeia complementar. A síntese da nova fita de DNA 
se inicia a partir dos primers ou iniciadores. A enzima DNA polimerase catalisa a reação que insere os 
nucleotídeos (dNTPs) complementares à fita-molde. Dessa maneira, novas fitas de DNA de dupla hélice 
são formadas, correspondentes a região alvo de amplificação (delimitada pelos primers). A figura a 
seguir esquematiza as etapas de um ciclo da PCR.
Etapa 1 
Aquecer 
para 
separar 
as fitas
Primeiro ciclo de amplificação
Região do DNA de fita 
dupla a ser amplificada
+ DNA - polimerase
+ dATP
+ dGTP
+ dCTP
+ dTTP
Produtos do 
primeiro ciclo
Par de 
iniciadores
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
Etapa 2
Resfriar para 
anelar os 
iniciadores
Etapa 3
Síntese de DNA
Figura 85 – Ciclo de PCR. Cada ciclo da PCR inclui três etapas: (1) o DNA de fita dupla é aquecido brevemente para separar as duas 
fitas; (2) o DNA é exposto a uma quantidade excessiva de um par iniciadores específicos – projetados para limitar a região do DNA 
a ser amplificada – e a amostra é resfriada para permitir que os iniciadores hibridizem com as sequências complementares nas duas 
fitas de DNA; (3) essa mistura é incubada com DNA-polimerase e os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato, de modo que o DNA 
possa ser sintetizado, a partir dos dois iniciadores. Para amplificar o DNA, o ciclo é repetido muitas vezes por meio do reaquecimento 
da amostra para separar as fitas de DNA recém-sintetizadas
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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
 Saiba mais
A técnica de PCR depende do uso de uma DNA polimerase especial 
isolada a partir de microrganismos cujos habitats naturais são as fontes 
quentes (p. ex., a amplamente utilizada Taq DNA polimerase é obtida de 
Thermus aquaticus); essa polimerase é estável a temperaturas muito mais 
altas do que as DNA polimerases eucarióticas, assim ela não é desnaturada 
pelo tratamento de calor. Portanto, essa enzima não precisa ser adicionada 
novamente após cada ciclo.
Saiba mais sobre o descobrimento da técnica em:
BO, G. M. Nobel Lectures, Chemistry 1991-1995. Singapura: World 
Scientific Publishing Co., 1997. Disponível em: https://www.nobelprize.org/
prizes/chemistry/1993/mullis/lecture/. Acesso em: 27 abr. 2020. 
O processo de desnaturação, anelamento e extensão é repetido várias vezes, até que se obtenha 
grande quantidade do DNA a ser amplificado. Os filamentos de DNA recém-sintetizados, mesmo 
complementares, formam uma segunda cópia da sequência alvo original, gerando, assim, uma 
amplificação exponencial (2, 4, 8, 16, 32… cópias). A PCR é uma reação em cadeia porque as fitas 
de DNA, recentemente sintetizadas, atuarão como molde para mais uma síntese de DNA nos ciclos 
subsequentes. Após cerca de 25 ciclos de síntese de DNA, os produtos da PCR incluem, além do 
DNA que iniciou a reação, cerca de 105 cópias da sequência alvo específica. Na PCR convencional, 
para visualização do produto da reação, também chamado de amplicon, é necessário realizar uma 
eletroforese e os resultados são qualitativos.
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Unidade II
Aquecer 
para 
separar 
as fitas 
e
resfriar 
para 
anelar os 
iniciadores
Síntese de 
DNA
Produto do 
primeiro ciclo
Final do 
primeiro ciclo
Segundo ciclo (produz 4 moléculas 
de DNA de fita dupla)
Terceiro ciclo (produz 8 moléculas 
de DNA de fita dupla)
Síntese de 
DNA
Aquecer 
para 
separar 
as fitas 
e
resfriar 
para 
anelar os 
iniciadores
Figura 86 – PCR utiliza repetidos ciclos de desnaturação, anelamento e extensão para amplificar o DNA. Cada ciclo duplica a quantidade 
de DNA sintetizada no ciclo anterior, de modo que dentro de poucos ciclos, o DNA predominante seja idêntico à sequência delimitada 
pelos dois iniciadores no molde original, incluindo a sequência deles. No exemplo aqui ilustrado, três ciclos de reação produzem 
16 cadeias de DNA, 8 das quais (em amarelo) correspondem exatamente a uma ou a outra fita da sequência original
Além da análise do DNA, pequenas amostras de RNA podem ser analisadas pela reação em cadeia 
da polimerase. Nesse caso, é utilizada a RT-PCR, uma reação da transcriptase reversa seguida de PCR. 
A partir do RNA (fita simples), a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar 
(chamada de cDNA). Ao cDNA, aplica-se a técnica de PCR. Uma vez que analisa o RNA responsável pela 
síntese de proteínas, a RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica.
 Observação
A tecnologia da reação em cadeia da polimerase apresenta vasta 
aplicabilidade, porém, não existe um protocolo único que seja apropriado 
para todas as situações. Dessa forma, é necessário que seja realizada uma 
otimização para cada nova aplicação da PCR. Existe uma grande variedade 
de técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase. 
Neste livro-texto, focaremos apenas em esmiuçar os princípios da PCR em 
tempo real. 
5.2.1 PCR em tempo real
Derivada da PCR convencional, a PCR em tempo real é uma inovação tecnológica e vem conquistando 
espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar 
resultados quantitativos, além de ser mais rápida e precisa, quando comparada à PCR convencional, que 
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apresenta resultados qualitativos. O método original de PCR apresentava algumas limitações sérias, ao 
amplificar primeiro a sequência de DNA e depois analisar o produto, a quantificação era extremamente 
difícil, uma vez que, independentemente da quantidade inicial de moléculasde DNA, ao fim de toda a 
reação era originado essencialmente a mesma quantidade de produto. Essa limitação foi resolvida em 
1992 pelo desenvolvimento da PCR em tempo real por Higuchi et al. (1992). 
Na PCR em tempo real, o produto formado é monitorado durante o curso da reação. A fluorescência 
de corantes ou sondas introduzidas na reação é monitorada em tempo real e é proporcional à 
quantidade de produto formado e ao número de ciclos de amplificação necessários para obter a amostra. 
A quantificação desses materiais ocorre com maior precisão e com maior reprodutibilidade, uma vez que 
os valores são determinados na fase exponencial da reação. Assumindo que a amplificação ocorra com 
eficiência, que normalmente é quase uma duplicação do número de moléculas por ciclo de amplificação, 
é possível calcular o número de moléculas de DNA da sequência amplificada que estavam inicialmente 
presentes na amostra. 
A principal característica da PCR em tempo real é a sua capacidade de monitorar o progresso da PCR 
enquanto ocorre a reação, e os dados são coletados ao longo dos ciclos. A detecção da formação dos 
amplicons ocorre por meio de um termociclador com sistema óptico para a captação da fluorescência e 
um computador com um software para aquisição de dados e análise da reação. Existe grande variedade 
de fabricantes desses equipamentos que apresentam diferenças quanto à capacidade da amostra, ao 
método de captação da fluorescência, à sensibilidade e aos softwares para a análise dos dados. 
Os usos típicos da PCR em tempo real incluem quantificação e análise de patógenos (viral, bacteriana 
ou de protozoários), análise de expressão gênica, análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), 
análise de produtos transgênicos, análise de aberrações cromossômicas e, mais recentemente, também 
detecção de proteínas por imuno PCR em tempo real.
5.3 Clivagem de DNA com endonucleases de restrição
A fita de nucleotídeos que forma a molécula de DNA é longa e pode ser considerada quimicamente 
monótona, uma vez que é uma mistura de apenas quatro tipos de nucleotídeos. O DNA é formado por 
centenas de milhares de genes que estão contidos nessa imensa molécula. Diferentemente das proteínas 
que podem ser separadas por tamanho, cargas ou propriedades de ligação diferentes, os genes estão 
interligados por regiões de DNA não codificante.
A descoberta das endonucleases de restrição, também chamadas de enzimas de restrição, possibilitou 
a fragmentação do DNA em sequências de nucleotídeos menores possibilitando o avanço das principais 
técnicas de biologia molecular. As endonucleases de restrição foram isoladas de bactérias, diferentes 
espécies produzem diferentes endonucleases que a protegem da entrada de DNA viral, por exemplo.
As endonucleases de restrição reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA, chamadas 
de sítios de restrição. Cada enzima de restrição reconhece apenas uma sequência específica de quatro 
a oito nucleotídeos de DNA. Quando ela encontra suas sequências alvo, a enzima de restrição fará um 
corte na dupla hélice da molécula de DNA. 
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Unidade II
Sítio de clivagem
HaeIII
EcoRI
HindIII
5’
5’
5’
5’
5’
5’
C
T
T
T
T
C
A
G
A
A
G
G A
A G C T T
A
A
T T C
G
G
A
3’
3’
G GC C
G GC
C T
T C G A A
T
T
A A G
C3’
3’
3’
3’
3’
3’
G
A
C
T
5’
5’
T
T
T
C
A
G
A
A
C C 3’
G G 5’C C
Figura 87 – Nucleases de restrição clivam o DNA em sequências nucleotídicas específicas. Assim como as proteínas de ligação, 
as sequências específicas do DNA, as enzimas de restrição muitas vezes atuam como dímeros, e a sequência de DNA que elas 
reconhecem e clivam normalmente são simétricas em torno do ponto central. Aqui, ambas as fitas da dupla hélice de DNA são 
cortadas em pontos específicos dentro da sequência alvo (cor laranja). Algumas enzimas, como HaeIII, cortam direto através da 
dupla hélice e deixam duas moléculas de DNA com extremidades cegas; com outras enzimas, como EcoRI e HindIII, os cortes 
em cada fita formam degraus. Esses cortes em degrau geram “extremidades coesivas” – sobreposição de fita simples curtas 
que ajudam as moléculas de DNA cortadas a se unirem novamente pelo pareamento de bases complementares. As nucleases de 
restrição normalmente são obtidas a partir de bactérias, e seus nomes refletem suas origens: por exemplo, a enzima EcoRI 
 é proveniente de Escherichia coli. Atualmente, existem centenas de enzimas de restrição diferentes disponíveis; elas 
podem ser compradas de companhias que as produzem para fins comerciais
5.4 Análise de DNA por eletroforese em géis de agarose
Eletroforese é um método simples e muito eficiente para separar, identificar e purificar fragmentos 
de moléculas. Consiste na separação de moléculas ionizadas (aminoácidos, peptídeos, proteínas, 
nucleotídeos, ácidos carboxílicos e outras substâncias de relevância biológica), de acordo com sua carga 
elétrica e seu peso molecular. Moléculas com carga negativa migram para o polo positivo (ânodo) e 
moléculas com carga positiva migram para o polo negativo (cátodo).
Para que ocorra migração, é necessário estabelecer uma diferença de potencial entre dois eletrodos 
ligados aos terminais de uma fonte de corrente contínua e dispostos em dois compartimentos, 
catódico e anódico; ambos os compartimentos contêm, em geral, uma solução-tampão. O meio 
físico de separação (gel), também tamponado, comunica-se através de suas extremidades com 
as soluções-tampão dos eletrodos, fechando assim o circuito elétrico. Devido à presença do 
grupamento fosfato, os ácidos nucléicos possuem carga total negativa, migrando sempre em 
direção ao polo positivo (ânodo).
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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
Cuba de eletroforese
Solução-tampão Frangmentos de DNA
Eletrodo 
(cátodo)
Os fragmentos de DNA 
menores deslocam-se mais 
rápido ao longo do gel do 
que os fragmentos maiores
Eletrodo 
(cátodo)
Eletrodo 
(ânodo)
Eletrodo 
(ânodo)
Gel de agarose
Figura 88 – Separação de DNA por eletroforese em gel. A figura mostra um corte transversal lateral de um gel. A “canaleta” (poço no 
gel) em que a mistura de DNA é colocada está indicada à esquerda, na parte superior do gel. Essa também é a extremidade em que 
o cátodo do campo elétrico está localizado, com o ânodo localizado na base do gel. Como resultado, os fragmentos de DNA, que são 
carregados negativamente, deslocam-se pelo gel da esquerda para a direita (da parte superior para a base). A distância que cada DNA 
percorre é inversamente proporcional ao tamanho do fragmento de DNA
Os métodos de eletroforese em gel são úteis na análise do tamanho e da pureza das moléculas 
de DNA e RNA, assim como na análise de proteínas. Fragmentos pequenos de DNA (menores do que 
500 nucleotídeos de comprimento) podem ser separados em géis de poliacrilamida especialmente 
projetados para permitir a separação de moléculas que diferem em apenas um nucleotídeo no 
comprimento. Entretanto, moléculas de DNA maiores não podem ser separadas nesse tipo de gel, 
uma vez que os poros do gel são muito pequenos para permitir a sua passagem. Nesse caso, o mais 
indicado é a utilização de um gel muito mais poroso formado por uma solução diluída de agarose 
(polissacarídeo isolado de algas marinhas).
A eletroforese em gel pode ser utilizada para separar por tamanho as moléculas de DNA ou de 
RNA de uma mistura bruta. Não é possível observar as bandas de DNA separadas pela eletroforese 
em gel de agarose se o DNA não for marcado ou corado de alguma forma. O corante brometo de 
etídeo, que emite fluorescência sob a luz ultravioleta, é amplamente utilizado para corar o DNA. Outro 
método de detecção ainda mais sensível é a incorporação de radioisótopos na molécula de DNA antes 
mesmo da eletroforese. 
 Observação
O brometo de etídeo é um potente agente mutagênico. Utilize luvas e 
máscara para preparar a solução de estoque e para manipular os géis; não 
olhe diretamente para a luz ultravioleta.
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Unidade II
Marcadoresde tamanho 
de DNA
DNA de fita dupla
Corte 
com 
EcoRI
Aplicar DNA no gel e 
aplicar tensão
Eletrodo 
negativo
Direção da 
migração
Pa
re
s d
e 
nu
cl
eo
tíd
eo
s (
x 
1.
00
0)
Acima
6.5
4.3
2.3
(A) (B)Gel de agarose
2
+Eletrodo 
positivo
9
23
-
Abaixo
Corte 
com 
Hindlll
Figura 89 – Moléculas de DNA podem ser separadas por tamanho utilizando eletroforese em gel. Ilustração esquemática comparando 
os resultados do corte da mesma molécula (nesse caso, o genoma de um vírus que infecta vespas) com duas nucleases de restrição 
diferentes, EcoRI (esquerda) e HindIII (direita). Os fragmentos são, então, separados por eletroforese em gel usando uma matriz de gel 
de agarose. Como os fragmentos maiores migram mais lentamente do que os menores, as bandas na parte inferior do gel contêm os 
fragmentos de DNA menores. Os tamanhos dos fragmentos podem ser estimados comparando-os com um conjunto de fragmentos 
de DNA de tamanhos conhecidos – esquerda (A). Fotografia de um gel de agarose mostrando “bandas” de DNA que foram coradas 
com brometo de etídeo (B)
5.5 Hibridização
O DNA, uma vez desnaturado, é capaz de restaurar os pares de bases entre as fitas, reanelando-se. 
Dessa forma, quando misturados com segmentos de DNA desnaturados, homólogos ou com origens 
diferentes e sob condições apropriadas de temperatura e força iônica, formam moléculas híbridas. 
Esse processo de pareamento entre polinucleotídeos complementares de fita simples é conhecido 
como hibridização.
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Aquecimento
Resfriamento 
lento
Desnaturação em fitas simples 
(quebra das ligações de hidrogênio 
entre os pares de nucleotídeos)
Dupla hélice de DNA Renaturação restaura as 
duplas hélices do DNA (pares de 
nucleotídeos restaurados)
Figura 90 – Uma molécula de DNA pode sofrer desnaturação ou renaturação (hibridização). Para que duas moléculas fita 
simples hibridizem, elas devem ter sequências nucleotídicas complementares que permitam o pareamento das bases. 
Nesse exemplo, as fitas em vermelho e laranja são complementares entre elas, e as fitas em azul e verde são 
complementares entre elas. Embora a desnaturação por calor seja mostrada, o DNA também pode ser 
renaturado após a desnaturação por tratamento alcalino
A hibridização de DNA pode ser utilizada para identificação de moléculas de DNA específicas. Nesse 
caso, um fragmento purificado ou uma molécula de DNA sintetizada quimicamente com sequência definida, 
chamado de sonda, é utilizado para procurar moléculas que contenham uma sequência complementar 
a ela em misturas de ácidos nucléicos. Para facilitar sua localização, uma vez que ela tenha encontrado 
sua sequência alvo, a sonda de DNA deve ser marcada.
Existem vários métodos para a marcação de DNA. Um método básico envolve a adição da marcação 
a uma das extremidades de uma molécula de DNA intacta. Por exemplo, a adição do γ-fosfato 
(radioativo) do ATP a um grupo 5’-OH do DNA enzima pela enzima polinucleotídeo quinase. Outra 
forma de adicionar marcação à sonda é utilizando o método por incorporação. Nesse caso, a síntese 
de um novo DNA ocorre na presença de um precursor marcado. Essa abordagem é frequentemente 
realizada pela utilização da PCR com um precursor marcado. Geralmente, os precursores marcados 
são nucleotídeos modificados com uma porção fluorescente ou com átomos radioativos. Em geral, 
a porção fluorescente necessita apenas ser ligada à base de um dos quatro nucleotídeos utilizados 
como precursores para a síntese de DNA.
A detecção do DNA marcado com os precursores fluorescentes é realizada pela irradiação da amostra 
de DNA com luz UV de comprimento de onda apropriado e pelo monitoramento da luz emitida em 
resposta (com comprimento de onda mais longo). Quando os precursores são marcados radioativamente, 
geralmente possuem 32P ou 35S incorporados no α-fosfato de um dos quatro nucleotídeos. Esse fosfato 
é retido no produto de DNA, que pode ser detectado pela exposição da amostra de interesse a um filme 
de raios X ou por fotomultiplicadores, que emitem luz em resposta à excitação pelas partículas β emitidas 
a partir dos isótopos 32P ou 35S.
156
Unidade II
A)
Fragmento de restrição de DNA duplex
Desnaturação e anelamento
com mistura de hexanucleotídeos
Adição de DNA-polimerase e 
nucleotídeos marcados com 12P
A DNA-polimerase incorpora nucleotídeos com 12P, 
resultando em uma população de moléculas de DNA 
radiomarcadas que contém sequências de ambas as fitas
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
B)
O
O
O
O
P O
O-
O-
O
P O
O-
O
P O
OH H
O-
N N
Espaçador
H
OH
H O O
Esta região permanece
disponível para
pareamento de
base com A
H
OH
OH
O
N
N
O
Nucleosídeo trifosfato 
modificado
Digoxigenina
Figura 91 – Métodos para marcar moléculas de DNA in vitro. A enzima DNA polimerase purificada pode incorporar nucleotídeos 
radiomarcados conforme sintetiza novas moléculas de DNA. Assim, as versões radiomarcadas de qualquer sequência de DNA 
podem ser preparadas no laboratório (A). O método anterior também é utilizado para produzir moléculas de DNA não radioativas 
que carregam um marcador químico específico que pode ser detectado com um anticorpo apropriado. A base no nucleosídeo 
trifosfato mostrado é análoga à da timina, na qual o grupo metila no T foi substituído por uma sequência espaçadora ligada 
ao esteroide digoxigenina de plantas. Um anticorpo antidigoxigenina ligado a um marcador visível como um corante 
fluorescente é, então, usado para visualizar o DNA. Outros marcadores químicos, como a biotina, podem ser ligados a 
nucleotídeos e utilizados do mesmo modo. O único requisito é que os nucleotídeos modificados formem pares de 
base de forma apropriada e pareçam “normais” para a DNA-polimerase (B)
5.6 Southern blot, northern blotting e western blot
Segmentos de DNA e RNA separados por eletroforese podem ser identificados por sondas de 
hibridização. A identificação da abundância ou do tamanho de uma molécula de DNA ou RNA específica 
dentro de muitas outras moléculas similares muitas vezes é desejável. Em situações em que se deseja 
comparar a expressão de mRNA em dois tipos celulares diferentes, por exemplo, métodos de marcação 
que localizam ácidos nucléicos específicos depois que eles tiverem sido separados por eletroforese 
podem ser extremamente úteis.
Imaginando que o genoma de levedura foi clivado com a enzima de restrição EcoRI e que o tamanho 
do fragmento que contêm um determinado gene de interesse precisa ser conhecido, quando corados 
com brometo de etídeo, os milhares de fragmentos de DNA gerados pela clivagem do genoma de 
levedura são tão numerosos que não podem ser resolvidos em bandas visíveis e separadas, e formam 
um padrão que se assemelha a um arraste, centralizado em torno de 4 kb. A técnica de hibridização de 
southern blotting permite a identificação, dentro desse arraste, do tamanho do fragmento específico 
que contém o gene de interesse.
157
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
Gel Membrana de 
transferência 
(blot)
 
Figura 92 – Southern blot. Fragmentos de DNA gerados pela digestão de uma molécula de DNA por uma enzima de restrição são 
submetidos à corrida em um gel de agarose. Uma vez corados, observa-se um padrão de fragmentos. Quando transferidos para uma 
membrana e sondados com um fragmento de DNA homólogo a apenas uma sequência na molécula digerida, observa-se uma única 
banda, correspondente à posição do fragmento contendo a sequência no gel
A técnica tem esse nome em homenagem ao seu inventor, Edward Southern. Inicialmente o DNA 
clivado é separado por eletroforese em gel e os fragmentos de DNA de dupla fita são desnaturados 
sob a ação de uma solução alcalina. É realizada a transferência dos fragmentos para uma membrana 
positivamente carregada. Os ácidos nucléicos aderem a essa membrana em posições equivalentes às que 
eles assumiram no gel após a eletroforese, criando uma impressão ou “carimbo”(blot) do gel. A membrana, 
então, é incubada com uma mistura de fragmentos de DNA não específicos para saturar todos os sítios 
de ligação remanescentes, diminuindo a probabilidade da sonda se ligar inespecificamente à membrana.
Sob condições de concentração salina e temperatura próximas às condições de desnaturação e 
renaturação dos ácidos nucléicos, a membrana é incubado com a sonda de DNA contendo uma sequência 
complementar a uma sequência interna ao gene de interesse. Geralmente, a sonda de DNA está presente 
em excesso na solução, comparado ao alvo imobilizado na membrana, o que favorece a hibridização 
frente ao reanelamento do DNA desnaturado. Diferentes tipos de métodos, que sejam sensíveis à luz ou 
aos elétrons emitidos pelo DNA marcado podem ser utilizados no processo de revelação da membrana. 
Se uma sonda de DNA radiomarcada é usada, por exemplo, a membrana é exposta a um filme de raios X 
e é produzida uma autorradiografia, na qual o padrão de exposição do filme corresponde à posição dos 
híbridos na membrana.
Para identificar um mRNA específico em uma população de RNAs, é possível fazer um procedimento 
semelhante ao Southern blot, denominado hibridização de northern blot. Moléculas de mRNA devem 
ser purificadas a partir de amostras de células ou tecidos. Nesse caso, não há a necessidade de digestão 
com enzimas uma vez que os mRNAs são relativamente curtos (geralmente menores que 5 kb). Após a 
extração devem ser fracionadas de acordo com seus tamanhos por eletroforese em gel. As moléculas de 
RNA presentes no gel de acrilamida são transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou de náilon 
para eu sejam acessadas pelas sondas de DNA. A membrana então é incubada com a sonda marcada. Nesse 
caso, os híbridos são formados pelo pareamento de bases entre fitas complementares de RNA e DNA).
158
Unidade II
A hibridização de northern blotting pode ser utilizada para determinar a quantidade de um mRNA 
em particular presente em uma amostra, refletindo o nível de expressão do gene que codifica o mRNA em 
questão. Dessa forma, essa metodologia pode ser utilizada, por exemplo, para investigar quanto de um 
determinado tipo específico de mRNA está presente em uma célula tratada com um indutor do gene 
em questão, comparada a uma célula não induzida. A hibridização de northern blotting também pode 
ser realizada com o objetivo de comparar os níveis relativos de um dado mRNA (e, consequentemente, 
os níveis de expressão do gene em questão) em diferentes tecidos de um organismo. 
Os princípios das hibridizações de southern blotting e northern blotting também são utilizados nas 
análises por microarranjos. Um microarranjo é construído pela ligação de várias centenas a milhares de 
sequências de DNA conhecidas a uma superfície sólida. Cada sequência é derivada de um gene diferente 
do organismo em estudo, essas sequências fixas conhecidas e não marcadas são chamadas de “sondas”. 
Por outro lado, as sequências alvo são compostas por cDNAs marcados amplificados, gerados a partir 
do RNA total de uma célula ou tecido. A intensidade do sinal de hibridização a cada espécie de DNA no 
arranjo é uma medida do nível de expressão do gene em questão.
As proteínas são, obviamente, bastante diferentes do DNA e do RNA, dessa forma, para identificá-las 
quando separadas por eletroforese é necessário o uso de anticorpos. O procedimento pelo qual uma única 
proteína é visualizada entre milhares de outras proteínas, análogo em conceito às hibridizações de Southern 
blotting e Northern blot, é conhecido como Western blotting ou immunoblotting.
As proteínas separadas por eletroforese são transferidas e ligadas a uma membrana. Os sítios de 
ligação não específicos remanescentes são bloqueados por incubação com uma solução de proteínas 
não relacionadas às que estão sendo estudadas (geralmente, usa-se albumina). A membrana é, então, 
incubada com uma solução que contém um anticorpo produzido contra uma determinada proteína de 
interesse. Por fim, uma enzima cromogênica artificialmente ligada ao anticorpo (ou a um anticorpo 
secundário que se liga ao primeiro anticorpo) é utilizada para visualizar o anticorpo ligado à membrana. 
Os experimentos de southern, northern e immunoblotting têm em comum a utilização de reagentes 
seletivos para a visualização de moléculas particulares em misturas complexas.
Membrana de transferência
Figura 93 – Immunoblotting. Após sua separação por eletroforese, as proteínas são transferidas para uma membrana (novamente 
pelo uso de campo elétrico) de maneira que mantêm a mesma posição relativa ocupada no gel. Após o bloqueio não específico 
de sítios de ligação para proteínas, é adicionado anticorpo que se liga à proteína de interesse. O local de ligação do anticorpo é 
detectado usando-se uma enzima ligada que é capaz de gerar luz quando age sobre seu substrato
159
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
6 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS À PESQUISA E 
AO DIAGNÓSTICO
6.1 Técnicas de biologia molecular aplicadas ao diagnóstico 
clínico‑laboratorial de doenças infecto‑parasitárias, malignas e genéticas
As técnicas de biologia molecular concentram-se na obtenção, identificação e caracterização 
do material genético de um organismo. Esse organismo pode ser paciente ou de um agente 
infeccioso que esteja lhe causando uma infecção ou doença. Dessa forma, a biologia molecular 
contemporânea tem contribuído para identificação de agentes infecciosos, mutações específicas 
que levam a proteínas com funções prejudicadas ou predisposição a doenças oncológicas, 
estabelecer prognóstico de doenças ou elencar o melhor tratamento a ser seguido especificamente 
para um paciente. 
6.1.1 Doenças infecto-parasitárias
As técnicas de biologia molecular podem ser utilizadas para detectar patógenos invasores em 
estágios bastante iniciais da infecção. Mesmo com poucas cópias de uma bactéria invasora ou de um 
genoma viral presentes em uma amostra de um paciente, utilizando sequências curtas complementares 
a um segmento do genoma exógeno como iniciadores e a reação em cadeia da polimerase, é possível 
fazer a detecção do agente infeccioso. 
A detecção, a identificação e a determinação da suscetibilidade a medicamentos são primordiais 
nos laboratórios de microbiologia clínica. O tempo para identificação e a realização de testes de 
resistência/suscetibilidade a medicamentos dos patógenos, em especial bactérias, é de pelo menos 
24h a 72h, porém, na maioria dos casos, é necessário iniciar a antibioticoterapia do paciente de forma 
empírica até a liberação do laudo laboratorial.
As técnicas de biologia molecular são alternativas importantes aos métodos clássicos utilizados 
hoje, uma vez que essas técnicas são realizadas facilmente, têm baixo custo e proporcionam 
identificação do patógeno de maneira mais rápida. Além disso, têm importância fundamental 
para aqueles microrganismos de crescimento lento em cultura e não cultiváveis. Considerando 
as metodologias moleculares mais amplamente utilizadas nos laboratórios clínicos, destacam-se 
a PCR e a PCR em tempo real (qPCR). O quadro seguinte sumariza as aplicações clínicas da PCR 
e suas variações nas áreas de bacteriologia e virologia clínica e micologia médica das principais 
doenças infecciosas.
160
Unidade II
Quadro 7 – Principais microrganismos identificados por métodos 
moleculares em uso no diagnóstico de doenças infecciosas
Áreas Microrganismos
Virologia
Vírus da herpes simples, citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), vírus da 
varicela-zóster, herpesvírus humano tipos 6, 7, 8
Vírus respiratórios (vírus influenza, vírus parainfluenza, adenovírus, rinovírus) 
SARS-CoV, vírus da influenza aviária 
Vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C 
(HCV), vírus do papiloma humano (HPV), rotavírus, norovírus, adenovírus entérico
Bacteriologia
C. trachomatis, N. gonorrhoeae, B. pertussis, M. tuberculosis, nontuberculous 
mycobacteria, T. whipplei, B. henselae, genitalmycoplasmata, C. burnettii, 
M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella spp., N. meningitidis, S. pneumonia 
Micologia Pneumocystis jiroveci, Candida spp., Aspergillus spp.
Fonte: Lipay (2015).
As ferramentas de biologia molecular permitem rápido diagnóstico de infecções causadas por 
bactérias, evitando a espera de dias a semanas para o crescimento dos microrganismos em meios 
de cultura. No caso de dificuldade de crescimento do organismo e/ou da introdução de terapia 
antimicrobiana antes da coleta da amostra clínica essas metodologias também são de grande valia, uma 
vez que a cultura será negativa. A presença do DNA bacteriano na amostra do paciente, verificada após 
amplificação de sequências específicas da bactéria, é evidência de infecção.
Sequências específicas de DNA codificando a região 16S de RNA ribossômico (rRNA) ou a região 
intergênica de 16S a 23S do rRNA, regiões que contêm informação para identificar gênero e espécie 
de bactérias, são utilizadas para a amplificação. Os genes que codificam o rRNA são altamente 
conservados e apresentam alto número de cópias dependendo do gênero, tornando-se ótimos alvos 
para a amplificação e identificação bacteriana. Em alguns gêneros, não é possível fazer a discriminação 
da espécie a partir do rRNA. Nesse caso, podem ser utilizados outros genes como por exemplo o gene 
que codifica as proteínas de choque térmico (heat shock proteins).
Um exemplo de aplicação das técnicas moleculares na bacteriologia é a identificação de bactérias 
responsáveis por pneumonias e infecções pulmonares intersticiais. É de fundamental importância 
a detecção do agente etiológico bacteriano responsável pelo quadro clínico para a adequada 
antibioticoterapia no tratamento da pneumonia, uma vez que essa enfermidade pode ser fatal. Existe 
uma grande diversidade de agentes etiológicos causadores da doença, por isso, o diagnóstico precoce 
e a identificação correta são fundamentais para o rápido e adequado estabelecimento da conduta 
clínica. O Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é responsável por 30 a 70% dos casos, porém 
esse microrganismo faz naturalmente parte da microbiota do trato respiratório humano. Por sua vez, 
bactérias como Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae e Legionella estão relacionadas 
com aproximadamente 48% dos casos de pneumonia. É praticamente impossível a identificação do 
agente etiológico com base apenas nos sintomas clínicos, o diagnóstico laboratorial rápido e específico 
é muito útil para o rápido diagnóstico, permitindo a introdução de adequada antibioticoterapia logo no 
161
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
início da infecção. Testes comerciais já bem padronizados quanto a sensibilidade e especificidade foram 
desenvolvidos. Entre os testes comercialmente disponíveis, os mais comuns utilizam a estratégia de PCR 
em tempo real.
O diagnóstico de infecções virais, até o fim da década de 1980, consistia no isolamento do vírus 
em cultura de células e sorologia. A biologia molecular melhorou imensamente o diagnóstico no campo 
da virologia médica. A carga viral pode ser acompanhada no controle de pacientes cronicamente 
infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), da hepatite B (HBV), da hepatite C (HCV) e 
citomegalovírus (CMV) além da possibilidade de realização de ensaios de detecção de resistência a 
antivirais ou subtipagem.
Partícula de HIV rara no 
plasma da pessoa infectada
Extração 
de RNA
Plasma
RNA
Remoção das células 
por centrifugação
Eletroforese 
em gel
Amostra de 
sangue da 
pessoa infectada
Transcrição 
reversa e 
amplificação 
por PCR do 
cDNA de HIV
Controle, utilizando 
sangue de uma pessoa 
não infectada
Figura 94 – Detecção do genoma viral utilizando a técnica de PCR – a PCR é um método extraordinariamente sensível para 
detectar quantidades-traço de vírus em uma amostra de sangue ou tecido, sem a necessidade de purificar o vírus. Para o 
HIV, o vírus que causa Aids, o genoma é uma molécula de RNA de fita simples, como ilustrado aqui. Além do HIV, muitos 
outros vírus que infectam os humanos atualmente são detectados dessa forma
A síndrome de imunodeficiência adquirida (Aids do inglês: acquired imune deficiency syndrome) foi 
descrita pela primeira vez em 1981. Desde então, a Aids se tornou uma epidemia ao redor do mundo 
promovendo milhões de mortes. As manifestações clínicas da doença resultam principalmente da 
falência do sistema imunológico, tornando o indivíduo mais suscetível a infecções oportunistas por 
agentes como vírus, bactérias, fungos e protozoários e ao câncer. A Aids é causada pelo vírus HIV, que 
pertence à família Retroviridae, gênero dos Lentivirus. O linfócito TCD4+ é a principal célula alvo do HIV. 
A quantificação do RNA do vírus HIV-1 é o marcador laboratorial mais adequado para avaliar a progressão 
da doença, indicar o início da terapia e determinar a eficácia dos antirretrovirais. O número de partículas 
virais presente em uma determinada amostra de um indivíduo infectado é conhecido como carga viral, 
ela reflete a quantidade de partículas que estão sendo produzidas e lançadas na circulação sanguínea. 
A carga viral é mais elevada durante a infecção primária e mais baixa na fase assintomática. Existe uma 
relação direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com que a infecção progride. Com base 
nessas quantificações, sabe-se que níveis altos de RNA plasmáticos estão associados à queda rápida na 
população de linfócitos TCD4+ e à progressão mais rápida para Aids.
Em humanos, isolados virais são agrupados em um dos dois tipos: HIV-1 e HIV-2, além disso, o HIV-1 
pode, ainda, ser dividido em subtipos. A extensa variabilidade genética do HIV-1 é decorrente da grande 
incidência de erros atribuídos à função da enzima viral transcriptase reversa, que resulta em mutações. 
As regiões mais conservadas do HIV-1 são utilizadas para desenvolver ensaios para a determinação 
162
Unidade II
qualitativa da carga de HIV, e mutações são usadas como alvos de ensaio para o monitoramento de 
pacientes resistentes a medicamentos. Apesar de ser capaz de monitorar a infecção pelo HIV em uma 
fase muito precoce, o que ajuda a diminuir substancialmente o período de janela de 2 a 6 meses para 
2 a 7 dias, o diagnóstico molecular não é recomendado oficialmente como padrão-ouro no diagnóstico 
clínico da infecção pelo HIV. Tal fato ocorre em virtude de possíveis falsos-positivos em ensaios de 
PCR. Existe uma grande variabilidade de ensaios para detectar e quantificar o RNA do HIV-1. As regiões 
relativamente conservadas dos genes gag de codificação do genoma do HIV e pol são escolhidas como 
os alvos em uma variedade de métodos e kits comerciais. Os testes incluem PCR/RT-PCR, bDNA e 
Nasba (nucleic acid sequence-based amplification). A principal diferença entre eles é a exigência de 
equipamentos específicos de análise em vez de sua sensibilidade ou especificidade. Portanto, os recursos 
das várias configurações permanecem como fator determinante para a escolha do método molecular 
para a detecção do HIV. 
Os vírus causadores das hepatites determinam um amplo espectro de apresentações clínicas, 
de portador assintomático ou hepatite aguda ou crônica, até cirrose e carcinoma hepatocelular. 
O esclarecimento do agente etiológico específico é fundamental no diagnóstico da hepatite, uma vez 
que as consequências dessas infecções são diversas, dependendo do tipo de vírus. As melhorias nas 
técnicas baseadas em biologia molecular produziram ferramentas muito valiosas para a confirmação 
diagnóstica da infecção viral e no seguimento dos pacientes com formas crônicas, assim como na 
avaliação terapêutica daqueles pacientes submetidos a tratamento. 
Os testes moleculares utilizados no diagnóstico das hepatites virais podem ser qualitativos – reação 
em cadeia da polimerase (PCR), transcrição mediada por amplificação (TMA) – ou quantitativos – DNA 
de cadeia ramificada (bDNA), PCR quantitativo e em tempo real. De acordo com a informação clínicaque se quer obter, a técnica a ser utilizada será escolhida – presença ou ausência do vírus, replicação 
viral, genótipo do vírus, pesquisa de mutações no genoma viral. 
A técnica de PCR também tem sido utilizada para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus 
(CMV). O CMV é constituído de DNA (240 kb) e pertence à família Herpesviridae. Atualmente, é a causa mais 
comum de doença e morte em pacientes imunossuprimidos, incluindo os receptores de transplantes de 
órgãos e de medula óssea, os pacientes com câncer, os portadores da Aids, os submetidos à quimioterapia 
e os que fazem uso de medicamentos imunossupressores. Os testes mais frequentemente utilizados para 
diagnosticar infecção por CMV são a detecção do antígeno (pp65), DNA ou mRNA. A presença do CMV 
no sangue, por qualquer método, não confirma a doença clínica. Desse modo, o desafio no diagnóstico 
do CMV está em distinguir os pacientes imunocomprometidos que desenvolveram a infecção pelo CMV 
daqueles nos quais a infecção não é clinicamente significativa. Atualmente tem se detectado o RNA 
mensageiro do CMV, que representa evidência de transcrição ativa do genoma viral. Portanto, os testes 
de carga viral por PCR quantitativo são aceitos como o padrão para monitorar o surgimento de infecção 
por CMV durante a imunossupressão e permitem terapia preventiva ao aparecimento da doença clínica, 
com alta sensibilidade quando comparado à cultura.
As infecções agudas do trato respiratório são, em sua maioria, de origem viral. Esses vírus ocorrem 
predominantemente no inverno e na primavera e são importantes causas de morbidade e mortalidade 
em parcelas específicas da população como idosos e imunocomprometidos. Os vírus respiratórios têm 
163
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
um período de incubação relativamente curto (1 a 14 dias), e a transmissão pode ser por contato direto 
com secreções contaminadas, inoculação do epitélio nasal e conjuntival ou por gotículas de aerossol.
O vírus específico muitas vezes não é identificado na prática clínica devido à falta de testes 
sensíveis e/ou da presença de agentes patogênicos ainda desconhecidos. O vírus influenza A e B, vírus 
parainfluenza tipos 1 (PIV1), PIV2 e PIV3, vírus sincicial respiratório (VSR), adenovírus e rinovírus são as 
principais causas de infecções agudas do trato respiratório em crianças e adultos. Além disso, devido 
a sobreposição das manifestações clínicas, é difícil distinguir o agente causador sem um diagnóstico 
laboratorial. O diagnóstico laboratorial das viroses respiratórias consiste basicamente no isolamento do 
vírus e em técnicas sorológicas (principalmente imunofluorescência direta – IFD) e de biologia molecular. 
São necessários cerca de 2 a 3 dias para detectar infecções virais respiratórias utilizando cultura de 
células. Dessa maneira, a utilização das técnicas moleculares em relação à tecnologia de cultura de vírus 
tem se mostrado mais vantajosa. 
Testes moleculares já foram desenvolvidos para todos os vírus respiratórios, incluindo os vírus 
tradicionais e emergentes. Entre os métodos moleculares utilizados na rotina de laboratórios clínicos 
para detecção de vírus respiratórios, destacam-se: PCR/RT-PCR, NASBA e loop-mediated isothermal 
amplification (LAMP). Além disso, a PCR multiplex representa abordagem diagnóstica mais recente para 
o laboratório clínico.
Quadro 8 – Características dos principais vírus causadores de infecção respiratória aguda
Vírus Família Material genético Tempo de incubação
Período de 
infecção Principais genes-alvo
Influenza Orthomyxoviridae RNA simples fita 1 a 4 dias 7 dias M, HA e NS-1
Parainfluenza (PIV) Paramyxoviridae RNA simples fita 1 a 7 dias 1 a 3 semanas HA-NA, P, L, pol e M 
RSV3 Paramyxoviridae RNA simples fita 2 a 8 dias
3 a 8 dias até 
3 a 4 semanas 
(em crianças)
N, F, L e pol1b
Adenovírus Adenoviridae DNA dupla fita 2 a 14 dias Dias-meses H e VA
Rinovírus Picornaviridae RNA simples fita 2 a 3 dias 7 a 10 dias 5’-NCR e VP
hMPV Paramyxoviridae RNA 2 a 3 dias Em média, 5 dias F, L, N, M e P
SARS-CoV Coronaviridae RNA simples fita 2 a 10 dias – pol1b, pol1a, pol, S e N
Bocavírus Parvoviridae DNA simples fita – – NP1, NS-1, VP-1 e VP-2
M: proteína de matriz. HA: hemaglutinina. NS-1: proteína não estrutural. HA-NA: gene da hemaglutinina-neuraminidase. P: 
gene da fosfoproteína. L: subunidade maior da polimerase. pol: gene da polimerase. N: proteína do nucleocapsídio. F: proteína 
de fusão. H: proteína hexon. VA: gene VA RNA. VP: proteína do capsídio viral. S: proteína Spike. NP-1: nucleoproteína. 
Fonte: Lipay (2015).
Os métodos moleculares não são frequentemente utilizados para diagnóstico de infecções causadas 
por eucariotos, entretanto, em algumas circunstâncias clínicas, eles podem ser uma ferramenta muito 
útil. O diagnóstico molecular pode beneficiar pacientes imunocomprometidos, que apresentam baixa 
produção de anticorpos. Além disso, o uso de métodos moleculares na identificação do patógeno torna 
164
Unidade II
desnecessária a coleta de amostras por procedimentos invasivos. As pneumonias e as meningites fúngicas 
são exemplos de doenças que podem ser diagnosticadas por tais métodos. O uso de técnicas moleculares 
também permite realizar a discriminação de espécies sem a necessidade de crescimento do isolado 
clínico no laboratório e da avaliação morfológica detalhada, a qual requer examinador experiente para a 
identificação. Apesar das vantagens, a aplicação de testes de diagnóstico molecular na micologia médica 
ainda é rara e poucos sistemas comerciais encontram-se disponíveis. Ainda, a grande maioria dos estudos 
tem focado principalmente nas micoses sistêmicas. O quadro a seguir apresenta um resumo dos principais 
fungos e das técnicas moleculares que foram testadas para o diagnóstico molecular dessas micoses. 
Quadro 9 – Técnicas moleculares que foram testadas para 
o diagnóstico molecular das micoses
Gênero Amostra clínica Alvo
Aspergillus
BAL 18S rRNA, ITS, tRNA mitocondrial, citocromo b
Sangue 18S rRNA, 5.8 rRNA, 28S rRNA, fks, citocromo b
Tecido ITS, tRNA mitocondrial, 18S rRNA
Soro 5.8 rRNA, 28S rRNA, fks, rRNA mitocondrial
Plasma 18S rRNA, fks
Cultura atr, mdr
Candida
Tecido 18S rRNA
Sangue ITS2, 18S rRNA, ITS
Cultura ITS2, erg11, cdr, mdr, act, 5.8S rRNA
Lavado da cavidade oral 18S rRNA
Coccidioides Cultura Ag1/PRA
Histoplasma Cultura, BAL, medula óssea ITS
Paracoccidioides
Tecido ITS, 18S rRNA
Cultura 20 genes
Pneumocystis
Lavado broncoalveolar, aspirado 
nasofaríngeo SSU mitocondrial e LSU mitocondrial
Plasmídio Dhps
Lavado da cavidade oral, lavado 
bronqueoalveolar, escarro msg, 5S rRNA
BAL: lavado broncoalveolar. LSU: large subunit. SSU: small subunit. 
Fonte: Lipay (2015).
6.1.2 Doenças malignas
Testes moleculares também podem ajudar a entender a agressividade de um tumor específico 
e escolher de forma mais efetiva tratamentos como hormonioterapia ou quimioterapia para um 
determinado paciente. Além disso, a identificação do perfil genético do câncer pode ainda nos 
permitir detectar mutações que através de tratamentos específicos podem ser inativadas e produzir, 
assim, respostas tumorais. O fenótipo neoplásico é definido pelo acúmulo de mutações e alterações 
epigenéticas que podem afetar modelos transcricionais e funções proteicas. Esses efeitos conferem 
165
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
vantagens competitivas para a célula, levando ao fenótipo maligno. Dessa forma, a análise global 
transcricional é uma importante ferramenta para revelar alguns desses mecanismos moleculares 
que levam à malignidade. Duas tecnologias têm sido bastante utilizadas atualmente para estudar o 
transcriptoma neoplásico: a análise seriada da expressão gênica (SAGE) e o microarray. 
A proposta de usar microarray para o diagnóstico de neoplasias foi inicialmente sugerida por 
Khan et al. (1998), estudando uma amostra de rabdomiosarcoma alveolar, reforçada pelo estudo de 
Golub et al. (1999), que distinguiram a leucemia mieloide agudada leucemia linfocítica aguda pelo 
perfil de expressão gênica.
Atualmente, abordagens baseadas em microarray têm sido imensamente usadas para diversas 
propostas na pesquisa oncológica. Uma de suas principais aplicações é a identificação de clusters 
de genes associados com o desenvolvimento de um tipo de câncer em particular. Diferentes estudos 
baseados no perfil de expressão de genes em amostras tumorais têm revelado a grande heterogeneidade 
transcricional do câncer e têm permitido a classificação de novas subclasses clínicas e biológicas 
importantes da doença (PEREZ-DIEZ; MORGUN; SHULZHENKO, 2007).
Dessa forma, as vantagens dessa técnica têm sido demonstradas em estudos realizados em uma 
extensa variedade de neoplasias, incluindo câncer de pulmão, estômago, próstata, mama, ovário, fígado, 
pâncreas e câncer de cabeça e pescoço.
 Observação
Apesar de a tecnologia de microarray representar uma ótima oportunidade 
para a pesquisa clínica, algumas questões significativas precisam ser 
consideradas. Além do limite de acesso e custo, há também a falta de padrões 
rigorosos para coleta dos dados, análise e validação. O rápido processamento 
para manter a integridade do RNA é crucial, pois dados falsos podem ser 
gerados a partir de RNA degradado. Dessa forma, após a retirada cirúrgica, as 
amostras devem ser imediatamente mantidas em temperatura extremamente 
baixa (-80 ºC), para evitar a degradação do RNA.
Outra técnica de biologia molecular que pode ser aplicada para estudo de neoplasias é a 
imuno-histoquímica. Essa técnica permite a localização de proteínas específicas no tecido sob investigação, 
por explorar o princípio de ligação antígeno-anticorpo. Embora seja atualmente uma técnica amplamente 
usada para o diagnóstico diferencial de neoplasias, ainda há necessidade de maior padronização nos 
procedimentos, para que os resultados sejam mais reprodutíveis em diferentes laboratórios. A técnica de 
tissue array tem um enorme potencial para facilitar a transferência dos achados da pesquisa básica para 
a prática clínica (HEWITT, 2009). Essa técnica permite a análise do perfil de expressão de proteínas em 
espécimes determinando seu potencial clínico. A técnica de PCR em tempo real tem recentemente alcançado 
um nível de sensibilidade, confiabilidade e praticidade que suporta seu uso como um bioinstrumento de 
rotina para quantificação de expressão gênica, sendo atualmente considerado o método mais apropriado 
para confirmar os dados gerados por microarray (PROVENZANO; MOCELLLIN, 2007).
166
Unidade II
6.1.3 Doenças genéticas
Os avanços na biologia molecular também permitiram o emprego de métodos mais sensíveis e 
rápidos na identificação de doenças genéticas. A análise molecular dessas doenças vem sendo cada vez 
mais necessária para a completa caracterização das alterações apresentadas por um indivíduo ou até 
mesmo essencial para um diagnóstico diferencial em muitos casos.
A utilização dessas ferramentas possibilita o diagnóstico precoce preciso de pacientes afetados, 
a detecção de portadores, a continuidade do tratamento e o planejamento terapêutico. Além disso, a 
correlação genótipo-fenótipo (correlação das alterações moleculares encontradas com os aspectos 
clínicos) pode contribuir para um melhor prognóstico e definição da estratégia do tratamento mais 
acertada em cada caso.
6.2 Detecção de agentes patogênicos no ambiente e em alimentos
6.2.1 Conceitos gerais
Um agente patogênico, também conhecido como agente etiológico, é um organismo capaz de causar 
doenças em outros organismos. Muitos agentes patogênicos presentes no ambiente e nos alimentos 
são capazes de causar doenças nos seres humanos. Alguns exemplos são: bactérias, protozoários, 
fungos, helmintos e alguns artrópodes. Esses organismos são caracterizados de acordo com algumas 
características como (ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE, 2010):
• Infectividade: capacidade do agente patogênico de penetrar e multiplicar-se dentro de um 
hospedeiro, se ocasionar infecção o agente é denominado agente infeccioso – exemplo: vírus da 
gripe (alta) x fungos (baixa).
• Patogenicidade: capacidade de um agente infeccioso de produzir sintomas de maior ou menor 
proporção em pessoas infectadas – exemplo: vírus do sarampo (alta) x vírus da poliomielite (baixa).
• Virulência: capacidade de um agente infeccioso produzir casos graves e fatais – exemplo: vírus 
do ebola (alta) x vírus do resfriado comum (baixa).
É difícil estimar a incidência das doenças de origem alimentar. O centro americano de controle 
e prevenção de doenças (CDC, do inglês Centre for Disease Prevention and Control) estimou 128 mil 
hospitalizações e 3 mil mortes devido a contaminação de água e alimentos no ano de 2011 
(VIDIC et al., 2019). 
A detecção dos agentes patogênicos é de extrema importância na área da saúde. No caso dos 
alimentos, a detecção desses agentes antes do consumo previne as doenças de origem alimentar. No 
caso do ambiente, é possível realizar a descontaminação ou prevenir a circulação de pessoas até que o 
ambiente esteja seguro. Diversas técnicas de biologia molecular são utilizadas para detectar a presença 
de agentes patogênicos e elas serão abordadas em seguida. 
167
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
6.2.2 Os agentes patogênicos nos alimentos e no ambiente
As doenças de origem alimentar são causadas por alimentos que parecem normais, muitas vezes têm 
odor e sabor normal de forma que o consumidor está inconsciente acerca dos potenciais problemas com 
os alimentos. Dessa forma, é difícil muitas vezes identificar o alimento responsável pelas toxinfecções 
ocorridas e dificilmente o consumidor se lembra de quais alimentos poderiam estar inadequados em 
suas últimas refeições. As doenças de origem alimentar são causadas por diversos microrganismos, 
e o período de incubação e de duração da doença varia de acordo como tipo de microrganismo e a 
quantidade ingerida.
Quadro 10 – Origem e incidência de patógenos alimentares 
Alimento/incidência (%) Patógeno
Frango cru e peru crus (45-64) C. jejuni
Frango (40-100), carne suína (3-20), ovos (0,1) e 
moluscos (16) crus Salmonella spp.
Frango (73), carne suína (13-33) e carnes (16) cruas S. aureus
Carne suína e frangos crus (39-45) C. perfringens
Carne moída crua (43-63), carne cozida (22) B. cereus
Carne vermelha (75), carne moída (95) L. monocytogenes
Carne suína crua (48-49) Y. enterocolitica, vírus da hepatite A, tênia
Leite (48-49) Y. enterocolitica
Leite pasteurizado (2-35), leite em pó (15-75), creme 
(5-11), sorvete (20-35) B. cereus
Frutos do mar (33-46) Vibrio spp.
Adaptado de: Forsythe (2013).
Existem dois grupos causadores das doenças transmitidas por alimentos: 1) grupo dos organismos 
infecciosos: Salmonella, Campylobacter e E. coli patogênicos; e 2) grupo dos intoxicantes: Bacillus 
cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum. 
O grupo dos infecciosos compreende os microrganismos que são capazes de se multiplicarem no 
trato intestinal humano, enquanto o dos intoxicantes é formado por aqueles que produzem toxinas, 
tanto nos alimentos quanto durante sua passagem pelo trato intestinal. Essa divisão em grupos é muito 
útil, pois torna possível o reconhecimento das rotas das doenças alimentares. Um indicador relativo 
da infectividade de um patógeno de origem alimentar é a dose infecciosa, alguns patógenos entéricos 
como salmonela spp. e B. cereus têm dose infecciosa acima de 104 organismos, já em outros como, Sh. 
dysenteriae, a dose infecciosa é acima de 10.
Os métodos de detecção são muito importantes, pois eles indicam não só a presença ou ausência dos 
patógenos nos alimentos, mas também são capazes de identificar a quantidade de organismos presentes. 
Um dos primeiros métodos utilizados era a análise microbiológica, que normalmente era empregada 
na avaliação do produto final que poderia ou não ser liberado. Os lotes que apresentavam resultados 
168
Unidade II
negativos eram liberados para distribuição, já os que tinham resultadospositivos eram reprocessados ou 
descartados. Essa abordagem foi capaz de reduzir a quantidade de produtos contaminados no mercado, 
porém não preveniu o uso de produtos contaminados na produção e não a tornou mais eficiente. 
Atualmente, o objetivo não é somente a segurança do produto final mas sim eliminar os patógenos 
alimentares desde os ingredientes, utilizando um sistema de análise de perigos e pontos críticos de 
controle (APPCC). 
Preparo das amostras
Contagem microbiológica
Homogeneização Diluição seriada Contagem de colônias
16h - 24h
Detecção de patógenos
Meio de enriquecimento Meio seletivo
16h - 24h 16h - 48h 3h - 6h 3h - 6h
Meio de isolamento
Confirmação por 
teste biológicos
Figura 95 – Exemplo de uso de técnicas microbiológicas para detecção dos patógenos 
 Saiba mais
A Análise dos Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), do inglês 
hazard analysis and critical points (HACCP), consiste na identificação 
de perigos e da probabilidade da sua ocorrência em todas as etapas da 
produção, por meio da definição de medidas de controle. Esse sistema teve 
origem devido à necessidade de fornecimento de alimentos seguros aos 
astronautas da NASA. O sistema foi desenvolvido em 1960 pela empresa 
norte americana Pillsbury e, a partir de 1971, passou a ser utilizado pela 
indústria alimentícia. 
Para saber mais sobre esse sistema, leia:
PGP CONSULTORIA E ASSESSORIA. Análise dos Perigos e Pontos Críticos 
de Controle – APPCC. [s.d.]. Disponível em: http://plataforma.redesan.ufrgs.
br/biblioteca/pdf_bib.php?COD_ARQUIVO=2491. Acesso em: 7 maio 2020.
169
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
A análise microbiológica consiste na homogeneização da amostra e cultivo do microrganismo 
em placas de ágar seguido por identificação bioquímica. Esse método é baseado no crescimento do 
microrganismo em meio de enriquecimento, seguido de isolamento e identificação. Embora a análise 
microbiológica seja ainda utilizada em diversos protocolos oficiais de microbiologia, essa técnica possui 
muitos entraves como a demora para obtenção dos resultados, o uso de grande quantidade de materiais 
e meio de cultura, além da necessidade de pessoas treinadas. A escolha do teste depende do tipo de 
organismo. Por exemplo, para detecção de Campylobacter spp. são utilizados métodos microbiológicos, 
no entanto esse método não é capaz de detectar E. coli O157. Cerca de 68,5 milhões de testes para 
detecção de Salmonella são realizados todo ano, ainda que o prazo para liberação dos resultados demore 
vários dias. Dessa forma, existe a necessidade do desenvolvimento de testes mais rápidos. 
Novos métodos de detecção são frequentemente anunciados, mas para que eles sejam aceitos pela 
indústria, devem ser velozes, exatos e serem fáceis de usar. Em geral, os métodos para detecção de 
microrganismos são divididos em cultivo convencional de células e processos mais rápidos, baseados em 
métodos imunológicos e moleculares. 
 Lembrete
Sensibilidade: é a capacidade do método em detectar o maior número 
de resultados positivos, se a amostra estiver contaminada. 
Especificidade: é a capacidade do método de não detectar o organismo-alvo 
na amostra negativa analisada, se o organismo realmente estiver ausente.
Exatidão: indica a proximidade do valor real (do valor, em geral, aceito 
como referência), está o valor medido. 
Precisão: indica o quão próximas as medidas repetidas estão umas 
das outras.
Uma das principais preocupações atuais é a contaminação da água. Diversos testes foram 
desenvolvidos para verificar a segurança das águas, muitos deles também são usados em alimentos. Os 
testes visam à detecção dos chamados organismos indicadores específicos que são classificados como 
organismos presentes em fezes humanas em quantidade substancial, de maneira que sua detecção 
seja indicativa de que resíduos humanos estão sendo introduzidos na água. Os organismos indicadores 
também devem ser capazes de sobreviver na água tão bem quanto os organismos patogênicos. Os testes 
de detecção desses organismos devem ser simples e de fácil reprodutibilidade. 
Um indicador comum bastante utilizado são as bactérias coliformes. Os coliformes são bactérias 
aeróbias ou anaeróbias facultativas, gram-negativas, morfologia de bastonetes, que não formam 
endósporos, fermentadoras de lactose. A bactéria coliforme predominante é a E. coli, que habita o 
intestino humano.
170
Unidade II
Os métodos mais comuns utilizados ainda são os testes de cultura microbiológica em meio 
contendo lactose e testes enzimáticos para detecção de beta-galactosidase. No entanto esses testes 
levam tempo e são menos específicos. Estudos recentes mostram que a PCR é um método sensível 
para a detecção dos coliformes. Na reação são utilizados primers específicos para o gene LacZ que 
codifica a enzima β-D-galactosidase e LamB, que codifica a proteína transportadora de maltose 
(ISFAHANI, 2017). 
 Saiba mais
Um elegante estudo sobre a PCR dos genes LacZ e LamB para 
identificação de cloriformes pode ser encontrado em: 
ISFAHANI, B. N. et al. Evaluation of Polymerase Chain Reaction 
for Detecting Coliform Bacteria in Drinking Water Sources. Advanced 
Biomedical Research, v. 6, p. 130, 2017.
6.2.3 Molecular
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o método de biologia molecular mais utilizado na 
análise de alimentos. A PCR baseia-se na análise do DNA, tem alta precisão e não sofre interferência 
das variações de proteínas, fato que ocorre com os métodos imunológicos que analisam proteínas de 
superfície celular. Alguns microrganismos como a Salmonella e Campylobacter não são cultiváveis; 
os métodos de cultivo em meios de cultura podem levar a resultados negativos falsos e muitas 
vezes falham em detectar o patógeno. Já os métodos moleculares baseados na PCR contornam 
esses entraves. A PCR clássica fornece um resultado qualitativo, enquanto a PCR em tempo real ou 
PCR quantitativa (qPCR, do inglês quantitative PCR) é capaz de quantificar o número de células 
de microrganismos em uma dada amostra. Contudo, a detecção em geral ocorre após a demorada 
etapa de enriquecimento para aumentar as células a cerca de 104 e para eliminar os riscos de 
detectar o DNA de bactérias mortas. Alguns protocolos contornam esse entrave adicionando um 
corante que é impermeável para a membrana celular, dessa forma o corante só se ligará ao DNA 
extracelular, prevenindo então, a amplificação do material genético proveniente de microrganismos 
mortos na reação de PCR. 
 Lembrete
A utilização da PCR permite que uma determinada região do genoma de 
qualquer organismo possa ser amplificada e multiplicada em milhões de cópias.
171
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
Amplificação/corrida 
em gel de agarose
Extração de DNAMeio de 
enriquecimento
Alimentos
Figura 96 – Exemplo de fluxograma para a análise de microrganismos por PCR
Algumas reações de PCR multiplex foram desenvolvidas para analisar simultaneamente Salmonella spp., 
Listeria monocytogenes, e Escherichia coli O157:H7 em amostras de carne. Esse método permitiu a 
detecção de 103 UFC (Unidades formadoras de colônias)/mL para cada patógeno em menos de 30h 
(KAWASAKI et al., 2005).
Uma técnica bastante realizada é a PCR do RNA ribossomal (RNAr) bacteriano 16S seguido de 
sequenciamento. O RNAr16S é altamente específico de cada tipo de bactéria e por isso a amplificação 
do gene RNAr 16S é uma importante ferramenta para a identificação de patógenos. O método envolve 
a amplificação do gene RNAr 16S e posterior sequenciamento, após a obtenção dos resultados, eles 
são comparados a sequências presentes na base de dados, sendo assim possível identificar o patógeno. 
Esse é um método rápido e importante na identificação de bactérias que são de difícil crescimento 
no laboratório. 
A técnica de PCR também é utilizada na detecção de fungos, um painel de PCR multiplex foi desenhado 
para identificação de 21 espécies de fungos do tipo Candida spp., Trichosporon spp., Rhodotorula spp., 
Cryptococcusspp., e Geotrichum spp. 
Também existem alguns kits de qPCR multiplex que permitem a análise de diversos patógenos em 
uma mesma reação. Por exemplo, a pesquisa das bactérias Salmonella, Shigella e L. monocytogenes 
em amostras de frutos do mar, carne e produtos pronto para comer. O limite de detecção do kit é de 
3-22 unidades formadoras de colônias/25 g de amostra. A PCR também tem sido utilizada na detecção 
de genes que codificam toxinas, por exemplo, no caso da gastroenterite causada por Clostridium 
perfringens. A enterotoxina é codificada pelo gene cpe e dessa forma a detecção dessa toxina é realizada 
através da PCR para o gene cpe. 
Um passo limitante das técnicas de PCR é a extração do material genético dos patógenos presentes 
no alimento. Normalmente são utilizadas soluções de lise contendo KOH, Na2EDTA e Triton que permitem 
uma rápida e eficiente extração do DNA. Existem outros métodos baseados na ureia/dodecil sulfato de 
sódio (SDS, do inglês sodium dodecyl sulfate)/proteinase K, fenol/clorofórmio e sal que mostraram-se 
igualmente eficientes na extração de DNA de alimentos. 
172
Unidade II
Um grande entrave é a obtenção do DNA em quantidade e qualidade aceitáveis para a PCR. 
Normalmente a quantidade e qualidade do DNA extraído é baixa. Muitas vezes o tratamento químico e 
térmico do alimento resulta em fragmentação e quebra do material genético. Com a finalidade de melhorar 
a qualidade do DNA dos alimentos processados, utiliza-se o método CTAB (cetyltrimethylamonium 
bromide) modificado com a adição de vários sais, SDS, proteinase K ou mercaptoetanol para obter um 
DNA livre de reagentes que podem inibir a reação de PCR. Os procedimentos de extração têm um forte 
impacto no limite de detecção do qPCR. 
Muitas vezes é necessária a pré-concentração da amostra antes da realização da PCR, essa etapa pode 
ser realizada com anticorpos, aptameros ou proteínas derivadas de bacteriófago. A pré-concentração 
permite o enriquecimento e isolamento do patógeno antes da análise por PCR.
 Observação
Aptameros são moléculas compostas por DNA ou RNA fita simples, 
apresentam conformação tridimencional específica e possuem uma grande 
força e especificidade de ligação ao seu alvo.
O método de qPCR também utiliza primers universais para a região do gene RNAr 16S, esse ensaio 
é muito utilizado na detecção de Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e 
Pseudomonas aeruginosa. Os primers foram desenhados de acordo com o alinhamento da sequência do gene 
RNAr 16S, que mostrou duas regiões altamente conservadas em mais de 90% da sequência do RNAr. 
Os primers desenhados foram capazes de detectar menos de 100 copias de DNA genômico presentes 
nas amostras. O qPCR também é uma importante ferramenta na identificação de fungos como Candida spp. 
e Cryptococcus spp.
Recentemente foram desenvolvidos métodos portáteis de extração e dosagem de DNA de patógenos. 
Os sistemas de microfluídica com micro e nano partículas permitem a extração e detecção das amostras 
por qPCR no mesmo dispositivo. A figura seguinte mostra um exemplo de dispositivo que permite 
a avaliação de patógenos usando apenas pequena quantidade de amostra. O dispositivo permite a 
extração, quantificação e identificação do DNA do patógeno usando a amostra bruta. 
Figura 97 – Exemplo de dispositivo que permite a avaliação de 
patógenos utilizando pequena quantidade de amostra
173
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
 Saiba mais
Para saber mais sobre os sistemas de microfluídica e uso da PCR em 
tempo real para a análise de patógenos, acesse: 
www.magnomics.pt
Diversos métodos de detecção são utilizados: colorimétrico, fluorescência e luminescência. O 
colorimétrico é o mais utilizado devido ao baixo custo, à facilidade de integração com sistemas 
de microfluídica de papel e à possibilidade de detecção de diversas reações ao mesmo tempo. 
Após a adição da amostra, é possível verificar a reação através das alterações de cor, intensidade 
de brilho, reflexão da luz, essas alterações são captadas e quantificadas por detectores. O método 
de fluorescência também é muito utilizado devido à facilidade de se encontrar diversos tipos de 
fluoróforos e o dispositivo deve ser composto por um sistema que fará a excitação e outro que 
realizará a leitura da luz emitida. O método de quimioluminescência é baseado na quantificação 
da luz emitida a partir de uma reação química. A quimioluminescência é utilizada na detecção da 
enterotoxina B100 proveniente de Staphylococcus. 
Um outro método variante da PCR é RAPD-PCR (do inglês random amplification of polymorphic 
DNA PCR). Essa técnica baseia-se na amplificação randômica de um DNA polimórfico utilizando primers 
pequenos (8-12 nucleotídeos) com sequências arbitrárias que se ligam não especificamente ao DNA 
bacteriano. Cada tipo de bactéria terá um padrão de amplificação, dessa forma é possível identificar 
de acordo com o padrão após a eletroforese. Para a reação de RAPD-PCR, o DNA deve ser extraído 
da bactéria e posteriormente deve ser realizada a amplificação com os primers RAPD. Os produtos da 
PCR são submetidos à eletroforese em gel de agarose e isso gera um padrão de corrida específico. Esse 
método é uma alternativa viável para identificação molecular, especialmente quando envolve a análise 
de um grande número de amostras. 
Outra metodologia também empregada nesses casos é RFLP (restriction fragment length 
polymorphism), esse método será descrito com detalhes mais adiante. Ele baseia-se na 
identificação de bactérias de acordo com o padrão de bandas que aparecem após a digestão do 
produto da PCR com enzimas de restrição. Um limitante dessas metodologias, tanto RAPD-PCR 
como RFLP, é que caso duas bactérias tenham o mesmo padrão de bandas após a eletroforese, 
uma outra metodologia deverá ser utilizada para que seja possível a identificação. Uma variante 
da RFLP é a ARFLP (do inglês amplified fragment length polymorphism), nessa metodologia 
são utilizadas enzimas de restrição que fragmentam o DNA genômico e posteriormente esses 
fragmentos são ligados em adaptadores e amplificados, utilizando primers específicos para as 
regiões dos adaptadores. Após a amplificação, os fragmentos são avaliados por eletroforese em 
gel de agarose. Essa técnica foi utilizada na identificação de Pseudomonas aeruginosa em uma 
unidade de terapia intensiva.
174
Unidade II
 Saiba mais
Para saber mais sobre o uso da técnica de ARFLP na detecção de 
Pseudomonas aeruginosa, leia o artigo: 
BUKHOLM, G. et al. An outbreak of multidrug-resistant Pseudomonas 
aeruginosa associated with increased risk of patient death in an intensive 
care unit. Infect. Control Hosp. Epidemiol., v. 23, p. 441-446, 2002.
O pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) é um método também utilizado na identificação de 
bactérias. O PFGE é uma técnica de eletroforese com a finalidade de separar grandes fragmentos 
de DNA, por meio da reorientação do DNA em gel pela ação de campos elétricos alternados. Essa técnica 
é reconhecida como padrão ouro para identificação de linhagens bacterianas, fúngicas e de protozoários 
(MAGALHÃES et al., 2005). Para realização da técnica, as bactérias são adicionadas à agarose e o DNA 
genômico bacteriano é extraído com detergentes. Posteriormente esses pedaços de agarose contendo 
DNA genômico são digeridos com enzimas de restrição e submetidos à corrente elétrica e rotações 
alternadas em campo magnético, permitindo a movimentação dos fragmentos grandes de DNA. Dessa 
forma, ocorre a separação por tamanho e é possível a identificação de um padrão de bandas. Essa 
metodologia foi utilizada para identificação de 15 subtipos de Vibrio cholerae no ano de 2012 na Índia. 
 Saiba mais
Para saber mais sobre a PFGE, leia o artigo: 
MAGALHÃES, V. D. et al. Eletroforese em campo pulsante em bacteriologia – 
uma revisão técnica. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 64, n. 2, p. 155-161, 2005.
Uma das técnicas mais recentes é o sequenciamento do genoma total (WGS, do inglês