práticas análises clínicas

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Práticas integradas em análises clínicas II
Curso de Pós-graduação em Análises Clinicas
Prof.ª Msc. Camila Amato Montalbano
Doutoranda do PPGDIP-UFMS
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-MEIOS DE CULTURA
-SEMEDURA
-COLORAÇÕES
Microbiologia
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Os meios comerciais devem ser hidratados; 
Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio;
Frasco;
Hidratar em pequena quantidade;
Depois deve-se acrescentar o restante da água;
Levar o meio para fundir  aquecer;
Preparação e distribuição de meios de cultura
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Usar sempre luvas térmicas;
Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC;
Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas;
Distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;
Distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias  estéreis;
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor;
Preparação e distribuição de meios de cultura
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ÁGAR SANGUE
Base rica;
Ótimas condições de crescimento;
Formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus spp;
FUNÇÃO
Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos (requerem nutrientes específicos para crescerem);
Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp;
Meios para crescimento e isolamento
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ÁGAR NUTRIENTE
Meio simples, de fácil preparação e barato;
FUNÇÃO
Várias aplicações  análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras;
Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente;
Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos;
Meios de cultura - manutenção
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É usado para testes de susceptibilidade antimicrobiana (antibiograma). Também é usado para isolar e cultivar Neisseria e Moraxella.
Fórmula comum (w/v):
30,0% infusão de carne
1,75% caseína hidrolisada
0,15% amido
1,7% ágar
Ágar Muller Hilton
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Cuidados: 
Técnicas assépticas; 
Ambiente estéril – próximo à chama (bico de Bunsen); 
Alças devem ser flambadas antes e depois do uso; 
Tubos, quando abertos, devem ser flambados antes e depois do uso. 
TÉCNICAS DE SEMEIO 
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Semeio por esgotamento
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Técnicas de coloração 
Ziehl Neelsen
Coloração de Gram 
Permitem revelar a forma, a dimensão e os componentes das células bacterianas, bem como, os aspetos bioquímicos da sua estrutura.
 Permitem observar células bacterianas em microscopia de campo claro.
 Como o índice de refração do protoplasma bacteriano difere muito pouco do meio circundante, é difícil o exame direto de preparações não coradas, a não ser que se utilizem técnicas especiais de iluminação.
Técnicas de coloração 
 Preparação do esfregaço
 Fixação do esfregaço
 Coloração
 Observação ao microscópio
Preparação e fixação do esfregaço
As lâminas devem ser lavadas com uma mistura de álcool-éter (1:1) previamente.
Esterelizar lâminas no fogo do bico de bunsen
Colocar uma gota de solução salina
 Coletar material cultivado no meio de cultura na placa de Petri (com swab ou alça)
Passar o material na lâmina em movimentos circulares junto com a gota de solução salina
 Deixar secar
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http://www.apsnet.org/education/IntroPlantPath/PathogenGroups/bacteria/text/fig12.htm
Coloração de Gram
Gram +
Gram -
Coloração diferencial
Distingue bactérias Gram + de bactérias Gram-
Indispensável na identificação bacteriana
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Bactérias Gram+ e Gram-
Composição diferente da parede celular
Gram+: Parede homogénea e espessa, formada essencialmente por peptidoglucano, baixa percentagem de lipoproteínas.
Gram-: Parede fina, camada de peptidoglucano fina, camada externa complexa, formada por lipoproteínas e polissacarídeos
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Coloração de Gram
Violeta de cristal
1 minuto
Lugol (iodo)
1 minuto
Álcool
30-60 segundos
Safranina
30-60 segundos
dH2O
dH2O
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Vídeo:
Coloração de Gram - Professora Andrea
https://www.youtube.com/watch?v=H3CfSpoUQzo
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Ziehl Neelsen
É uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram, sendo usada em bactérias que não são bem coradas com esta técnica, como os bacilos da Hanseníase e da tuberculose, as bactérias dos gêneros Nocardia e Mycobacterium, entre outros. 
Nocardia e Mycobacterium-BAAR (bactérias álcool-ácido-resistentes). Fazem resistência ao corante de Gram por terem alto teor de lipídios na parede celular. Uma vez coradas, fazem resistência à serem descoradas.
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Coloração de Ziehl-Neeseln- Protocolo
Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança;
Cobrir a lâmina com fucsina fenicada (o mordente é o ácido fénico);
Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver);
Aguardar 5 a 8 minutos;
Lavar com água corrente;
Cobrir a lâmina com álcool-ácido 3% até descorar totalmente o esfregaço;
Lavar com água corrente;
Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 minuto;
Lavar com água corrente;
Secar;
Observar.
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A fucsina fenicada, atuando a quente, vai corar todas as células bacterianas e outras estruturas presentes no esfregaço de vermelho (o calor vai derreter os lípidos de membrana, tornando-a permeável). O ácido diluído em álcool aplicados vão descorar todas as bactérias exceto as ácido-álcool resistentes, que permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas após coloração e contraste, com azul de metileno, encontraremos as bactérias:
Ácido-álcool resistentes: coradas de vermelho.
Não ácido-álcool resistentes: coradas de azul.
Resultado da bacterioscopia
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TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN 
https://www.youtube.com/watch?v=vYUr7c_BDZY
TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE ZIEHL NEELSEN
https://www.youtube.com/watch?v=PouIoydSiPM
Vídeos
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MÉTODO DA CENTRIFUGAÇÃO PARA OBSERVAÇÃO DE PARASITAS
PARASITOLOGIA
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Tipos de amostras 
Amostra recentemente colhida
Enviar rapidamente ao laboratório (2h)
		 ou
Manter amostra entre 2–8 °C (12h)
Amostra de fezes diarréicas
Não refrigerar
Exame em 30 minutos (pesquisa de trofozoítos)
Ovos e larvas - diluídos pelo volume maior de água
Amostra em conservantes (MIF)
Exame pode ser realizado até 30 dias após a coleta
Coleta da amostra
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Métodos com concentração por centrifugação
1- Coletar as fezes recém emitidas em líquido conservador de MIF. 
2- Homogeneizar bem. 
3- Coar a suspensão em gaze cirúrgica dobrada em quatro num copo descartável. 
4- Transferir 1 a 2 ml do filtrado para um tubo cônico com capacidade para 15ml. 
5- Acrescentar 4 a 5 ml de éter sulfúrico e agitar vigorosamente (desengordura a amostra fecal). 
Utilizado na rotina do EPF
Método de Blagg e cols. ou MIFc
Parasitologia Básica
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6- Centrifugar por um minuto a 1.500 rpm. 
7- Com auxílio de um bastão, descolar a camada de detritos gordurosos da parede do tubo. 
8- Inverter o tubo para desprezar o líquido e limpar as paredes com um bastão contendo algodão na extremidade. 
9- Acrescentar ao sedimento gotas de Lugol. 
10- Coletar 2 a 3 gotas do sedimento, cobrir com lamínula e examinar com as objetivas 10x e/ou 40x.
Métodos com concentração por centrifugação
Parasitologia Básica
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Método de Blagg e cols. ou MIFc
Parasitologia Básica
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SAF 
Acetato de sódio 1,5g 
Ácido acético 2,9ml. 
Formol 40% 4,0ml. 
Água destilada 92,5ml. 
Uso de solução conservante
Solução de Lugol (corante)
Iodo 2g 
Iodeto de potássio 4g 
Água destilada 100ml 
MIF 
Água destilada 250ml. 
Sol. mercuriocromo a 1:500 250ml. 
Formol 25ml. 
Glicerina 5ml.
Formol a 10% 
Formol comercial 10ml. 
Solução salina a 0,85% 90ml. 
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ATLAS DE PARASITOLOGIA
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ATLAS DE PARASITOLOGIA
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ATLAS DE PARASITOLOGIA
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ATLAS DE PARASITOLOGIA
Fator reumatoide
Waaler-Rose
IMUNOLOGIA
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Grupo de auto-anticorpos das classes IgG, IgM e IgA que tem em comum a capacidade de reagir com diferentes epítopos da porção Fc da molécula da imunoglobulina G (IgG) humana. 
Há pouco conhecimento dos mecanismos de ligação do FR aos auto-antígenos e de seu envolvimento no processo patológico típico da artrite reumatoide (AR)
 FR IgM serve como marcador precoce na AR, apoiando-se em dados que demonstram que o risco de desenvolvimento de AR aumenta de forma proporcional ao aumento da concentração de FR em indivíduos normais.
FR está presente em cerca de 50-90% dos casos de AR clássicos, alguns meses após o início da doença, e, desse percentual, 17% em média apresentam-se negativos nas fases mais precoces da doença. 
Fator reumatoide
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Fase ativa: concentrações mais elevadas, que começam a decair à medida que o paciente evolui para a remissão clínica, mantendo-se positivas em níveis baixos e estáveis e tornando a se elevar nos períodos de reativação da doença.
Fator reumatoide
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O Teste Waaler-Rose é um teste rápido de aglutinação para a determinação qualitativa, em placa, de Fator Reumatóide. Apresenta resultados que podem ser positivo, quando na presença do Fator, ou negativo, na ausência deste.
Waaler-Rose
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Os ensaios tradicionais para investigação do FR empregavam partículas de látex revestidas por imunoglobulina G humana (prova do látex) ou, na hemaglutinação indireta, hemácias de carneiro, revestidas por imunoglobulina de coelho (reação de Waller-Rose). A prova do látex era considerada mais sensível, e a reação de Waller- Rose, mais específica. Realizadas em conjunto, forneciam dados complementares.
Diferença entre os dois testes
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A reação de Waller-Rose é positiva em 80% das poliartrites reumatóides após dois anos de evolução.
No inicio da doença, a reação é frequentemente negativa: é necessário saber fazer o diagnóstico na ausência desse critério. Uma vez positiva, a reação de Waaler-Rose só se trorna negativa em caso de franca remissão, por isso inútil repetir o exame a intervalos regulares.
Em alguns casos (10% a 15%) a reação é positiva no liquido sinovial e negativa no soro.
Não existe relação entre o título da reação e a gravidade da doença.
A reação de Waaler-Rose é igualmente positiva em 25% a 30% de diversas patologias (lúpus eritematoso disseminado, esclerodermia sistémica, dermatomiosite), na Síndrome de Gougerot-Sjögren e na cirrose biliar primária, assim como em alguns casos de endocardites subagudas.
No idoso as reações positivas podem surgir fora de qualquer contexto patológico. Isto diz da sua pouca especificidade.
Valores Patológicos
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Obrigada!!!!
montalbano.c@hotmail.com
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