A segunda etapa, com uso do mordente lugol, também chamado de iodo. Pois ele apenas é responsável pela maior fixação do cristal violeta. Sendo as outras etapas indispensáveis.
Essas células são envoltas por uma camada formada por peptidoglicanos que pode ser mais espessa ou mais fina. Quando queremos visualizar as bactérias no microscópio, é realizado um processo chamado de coloração de Gram. Desse método surge uma classificação para as bactérias que as distinguem em gram-positivas e gram-negativas.
Acontece que durante a coloração é utilizado um cristal violeta como corante e algumas bactérias retêm esse corante devido à uma camada de peptidoglicanos mais espessa. Essas bactérias são, então, chamadas de gram-positivas. Já outras, as gram-negativas, não retêm esse cristal e ficam com uma cor vermelha devido ao processo de descoloração com safranina devido apresentarem uma camada mais fina. Como forma de facilitar a visualização ao microscópio, existe uma etapa que utiliza iodo para intensificar a coloração violeta. Porém, essa etapa não é obrigatória.
Portanto, a etapa que utiliza iodo pode ser omitida.
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