farmácia - imunologia 20 - ensaios imunológicos

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C A P Í T U L O 2 0 
ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
INTRODUÇÃO 
Os ensaios imunológicos foram e têm sido os principais responsáveis pelo conhecimento que 
se tem do sistema imune. Além deste aspecto relacionado ao conhecimento científico básico, estes 
ensaios são importantes, na clínica, para a detecção de infecções, de doenças auto-imunes e de estados 
de imunodeficiência. Os ensaios imunológicos podem ser utilizados não só para detectar a produção de 
anticorpos bem como para detectar a presença de antígenos, diferenciar o estágio de uma doença de 
acordo com a classe de Ig produzida, selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes, 
avaliar o prognóstico da doença, da eficácia de um tipo de terapia, dentre outros. 
Nos últimos anos, houve uma grande evolução no sentido de que com a técnica de anticorpos 
monoclonais (produzidos por um único clone celular) podem ser obtidos anticorpos altamente 
purificados e específicos, tais como os anticorpos anti-CD4 e anti-CD8, que identificam 
respectivamente linfócitos T auxiliares e citotóxicos. Além dos anticorpos, os antígenos também são 
produzidos por meio de técnicas de síntese proteíca e de recombinação, propiciando que antígenos 
purificados possam ser utilizados nas técnicas de ELISA, por exemplo. 
Os ensaios imunológicos podem ser realizados por meio de técnicas não quantitativas, 
visualizadas por meio de reações de precipitação e aglutinação ou podem ser quantitativas, com 
utilização de marcadores enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase, citometria de fluxo) ou radioisótopos 
(Radioimunoensaio). 
Os testes de precipitação e aglutinação têm menor sensibilidade que os imunoenzimáticos, 
porque os complexos Antígeno-Anticorpo para serem visualizados devem apresentar um tamanho 
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adequado (ver abaixo). Os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis 
(proteínas, glicoproteínas) enquanto que os de aglutinação para a detecção de antígenos particulados 
(hemácias, bactérias, células diversas). 
ENSAIOS DE PRECIPITAÇÃO 
O ensaio de precipitação é utilizado para detectar os anticorpos produzidos contra antígenos 
solúveis em concentrações entre 20 e 2 mg/ml. Para que a reação de precipitação seja visível deve haver 
uma relação de equivalência entre as concentrações do antígeno e do anticorpo. Em caso de excesso de 
antígeno ou de anticorpo ocorre uma redução na formação do precipitado. Quando as concentrações de 
antígeno e anticorpo são equivalentes, formam-se complexos de tamanho que permite a sua 
visualização; nestas concentrações encontra-se a zona de equivalência (Figura 1A). Quando o plasma ou 
soro a ser analisado apresenta uma alta concentração de anticorpos, estes se associam aos antígenos, 
formando pequenos complexos, não visualizados por precipitação; nesta concentração de anticorpos 
ocorre o efeito de pró-zona (Figura 1B). Quando o anticorpo está pouco concentrado em relação ao 
antígeno, também são formados pequenos complexos e ocorre o efeito denominado de pós-zona (Figura 1C). 
Título do anticorpo 
Quando os ensaios não são quantitativos, a produção de anticorpos contra um determinado 
antígeno pode ser correlacionada às diluições dos soros utilizadas para a realização do teste. Nestes 
ensaios, as partículas antigênicas são misturadas com diferentes diluições do soro do paciente e 
considera-se como resultado de produção de anticorpos a maior diluição em que ocorre a visualização 
(precipitação ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. A esta diluição dá-se o nome de título do 
anticorpo. Por exemplo, suponhamos que vamos estudar a produção de anticorpos contra espécies de 
Leishmania, que causam calazar, em uma população de área endêmica, no Brasil. É comum ser 
observada aglutinação de formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na 
maioria das pessoas porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, 
Plasmodium, Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que 
apresentam reação cruzada com Leishmania donovani. Por outro lado, o soro de pacientes infectados, 
que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6.400 (título). Como pode 
ser observado, neste exemplo, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica 
é de 1:600 enquanto que nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes. 
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274 
Figura 1 – Reação de Precipitação: A. Ponto de Equivalência, B. Efeito de Pró-zona e C. Efeito de Pós-zona 
Ac1 
Ac2 
Ag 
Ac1 
Ac2 
 Ac1 
 Ac2 
A. 
B. 
C. 
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275 
1. Teste do anel ou ring test 
Um dos testes mais rápidos e simples, utilizado em laboratórios de pesquisa, é o teste do anel 
ou ring test. Utiliza-se este teste quando o objetivo é saber se um animal está produzindo anticorpos 
contra um determinado antígeno solúvel, durante o processo de imunização. Suponhamos que estamos 
imunizando um coelho com Igs isoladas do soro de camundongos. Depois de algumas semanas, 
podemos colher o soro do coelho e colocá-lo cuidadosamente num tubo de vidro e sobre este uma 
solução do antígeno, no caso as Igs de camundongo (Figura 2B). Quando o animal produziu anticorpos 
específicos contra o antígeno, após alguns minutos, surge na interface entre as duas soluções, quando é 
atingida a equivalência, um precipitado, visível a olho nu,. Pode-se utilizar como controle negativo, o 
soro do animal colhido antes da imunização; neste caso, não haverá a formação da linha de precipitação 
na interface entre o soro e o antígeno (Figura 2A). 
Figura 2 – Ensaio do Anel A. Reação Negativa: soro antes da imunização, B. Reação Positiva: soro pós-imunização 
2. Imunodifusão 
A técnica de imunodifusão é realizada em meio semi-sólido, geralmente o ágar ou agarose, que 
permite uma difusão mais homogênea que em meio líquido, mas que tem o inconveniente de demorar 
entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitação. A difusão dos imunoprecipitados no gel 
depende do tamanho destes; quando são grandes ficam maior que o diâmetro dos poros, o que impede a 
sua difusão. A imunodifusão pode ser simples ou dupla; é simples, quando ou o antígeno ou o anticorpo 
é fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, até ocorrer precipitação; é dupla, 
quando os dois componentes migram um em direção ao outro. 
Ag1 
Soro 
Ag1 
Soro 
Linha de precipitação 
A. B. 
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276 
A imunodifusão dupla pode ser realizada numa lâmina de microscópio revestida de ágar, 
contendo orifícios onde são colocadas concentrações de Ag e Ac (Figura 3). Quando o Ag e os 
anticorpos específicos encontram-se, em concentrações correspondentes à zona de equivalência, são 
formados complexos precipitantes. 
Figura 3 – Imunodifusão dupla 
Na figura 3, observa-se que o antígeno X precipitou próximo ao orifício, onde ele foi 
depositado, enquanto que os antígenos Y e Z, precipitaram na região média entre os orifícios onde 
foram depositados o antígeno e o anticorpo. O fenômeno observado com o antígeno X, pode ter várias 
explicações: o antígeno pode estar em baixas concentrações e a zona de equivalência, ocorreu próximo 
ao orifício onde foi depositado ou o PM ou a carga do antígeno interferiu na sua capacidade de 
migração. 
3. Imunodifusão dupla, segundo Ouchterlony 
O método de imunodifusão, segundo Ouchterlony, é utilizado quando se deseja identificar um 
antígeno comparando-o a outros já conhecidos. Nas lâminas ou placas de Petri, revestidas de ágar, são 
feitos orifícios adjacentes: em um destesorifícios é colocado o soro e nos outros, o antígeno de origem 
conhecida e aquele a ser identificado (Figura 4). Nesta figura, observa-se que existem três padrões de 
resultado conforme a relação estrutural entre o antígeno conhecido (padrão) e o que se quer analisar. 
Quando o antígeno conhecido (HSA – Albumina Sérica Humana) é similar ao analisado (Antígeno A), 
os anticorpos e os antígenos migram, formando uma linha de precipitação contínua, na concentração 
correspondente à zona de equivalência (Figura 4A). Quando os antígenos são semelhantes mas não 
idênticos, é formado um esporão; na figura 4B, por exemplo, os anticorpos reconhecem o antígeno 
padrão (HSA) e o A2 (BSA – Albumina Sérica Bovina), que são similares; no entanto, o esporão 
Ag X Ags Y e Z Antisoro 
Lâmina revestida de agar 
Migração no agar 
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277 
corresponde aos determinantes antigênicos, reconhecidos pelos anticorpos anti-HSA, presentes apenas 
no HSA. Quando os anticorpos reconhecem os dois antígenos mas estes são distintos (HSA e HGG – 
Gamaglobulina Humana), são observadas duas linhas que se cruzam, formando dois esporões, o que 
demonstra que determinantes antigênicos diferentes presentes nestes antígenos são reconhecidos pelos 
anticorpos (Figura 4C). A presença de mais de uma linha de precipitação significa que os anticorpos 
estão reconhecendo outros componentes e que a solução antigênica não está purificada. 
Este é um método semi-quantitativo, de baixa sensibilidade, ainda utilizado para caracterizar 
antígenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imune. Uma das limitações deste 
teste é o tempo (18-24 horas) requerido para a obtenção dos resultados, além de detectar apenas reações 
Ag-Ac nas quais há formação de precipitados. Atualmente, este teste tem sido substituído por ensaios 
imunoenzimáticos. 
Figura 4 – Imunodifusão de Ouchterlony 
4. Imunodifusão radial simples 
A imunodifusão radial simples, introduzida por Mancini, em 1965, além de ser uma técnica de 
fácil realização e de baixo custo, é quantitativa. É realizada em placas ou lâminas revestidas de ágar, no 
qual é incorporado um antisoro específico para a molécula a ser quantificada (Figura 5B). No gel de 
ágar são feitos orifícios onde são depositadas pelo menos três concentrações conhecidas da molécula 
estudada (solução padrão) e as amostras de concentração desconhecida. Estas moléculas difundem-se no 
ágar e quando reagem com o anticorpo, na concentração correspondente à zona de equivalência, forma-
HSA 
Soro anti-HSA 
esporão 
Soro anti-HSA Soro anti-HSA e anti-HGG 
Ag A HSA Ag A2 HSA Ag B 
Resultado: Ag A = HSA 
Identidade Total 
Ag A2 = BSA 
Identidade parcial 
Ag B = HGG 
Não identidade 
A. B. C. 
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se a linha de precipitação, o que ocorre entre 48-72 horas. O diâmetro do halo que se forma ao redor do 
orifício onde foram depositadas as amostras corresponde à concentração da molécula, de acordo com a 
curva padrão obtida (Figura 5A). Para a obtenção da curva padrão são utilizadas concentrações 
conhecidas da solução padrão e após reação com os anticorpos presentes no ágar, os halos são medidos. 
Por exemplo, se quisermos dosar as concentrações de IgM do soro de pacientes; para a obtenção da 
curva padrão deve-se ter uma solução contendo IgM purificada de concentração conhecida. 
Esta técnica é utilizada para quantificar IgG, IgM e IgA e moléculas do sistema Complemento. 
Figura 5 – Imunodifusão radial simples A. Curva padrão, B. Placa com concentrações do Ag e da solução padrão 
0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
concentração do Ag (mg/ml)
di
âm
et
ro
 d
o 
an
el
 (m
m
)
 
5. Imunoeletroforese 
A imunoeletroforese é um método qualitativo que combina as técnicas de eletroforese e 
imunodifusão. A associação das duas técnicas permite que um maior número de componentes 
antigênicos de um líquido biológico (soro, urina) sejam identificados; no caso do soro, mais de 30 
componentes são identificados pela imunoeletroferese enquanto que na eletroforese entre 5 e 6 o são. 
É realizada também em lâminas ou placas de vidro recobertas de ágar, onde são feitos orifícios 
e canaletas para a colocação dos reagentes. Na primeira etapa, que geralmente dura entre 60-90 
minutos, a solução antigênica é colocada num orifício do ágar e a lâmina é submetida à eletroforese. 
Nesta fase, os componentes antigênicos são separados de acordo com as suas cargas elétricas. Vários 
fatores dos componentes antigênicos (além da carga elétrica, o tamanho, a forma e a concentração), do 
A. 
Gel contendo anticorpo 
Diluições do Ag 
Concentrações do padrão 
B. 
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solvente (a força iônica e o pH), do meio (temperatura e viscosidade do ágar) e do campo elétrico 
podem interferir na migração. Na Figura 6A, está representada a separação de proteínas séricas de uma 
pessoa normal e de uma que apresenta mieloma de IgG. Na segunda etapa, é cortada uma canaleta no 
ágar submetido a eletroferese, onde é depositado o antisoro (Figura 6B). Quando os anticorpos 
associam-se aos componentes antigênicos separados pela eletroforese, formam-se linhas de precipitação 
(Figura 6C). A difusão e a formação das linhas de precipitação ocorre num período entre 18-24 horas. 
Na Figura 6C, o soro de coelho anti-proteínas séricas humana reconhece as moléculas de albumina, do 
sistema complemento, as classes de imunoglobulinas, dentre outras não mostradas. 
Quando a produção de algumas destas moléculas está alterada, sendo produzidas em 
concentrações abaixo (imunodeficiências, doenças auto-imunes) ou acima (tumores de plasmócitos, tal 
como os mielomas) do normal, esta alteração pode ser detectada qualitativamente, como observado na Figura 6C. 
Este método é eficiente para detectar qualquer substância solúvel imunogênica, sendo 
adequado para a caracterização de proteínas e detecção de alterações estruturais e nas concentrações. 
Nos laboratórios de análises clínicas, é utilizado para o diagnóstico de gamopatias monoclonais tais 
como o mieloma múltiplo e a macroglobulinemia. 
ENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO 
A reação de aglutinação ocorre quando um antígeno particulado associa-se com o anticorpo 
específico. É uma reação de rápida visualização e que ocorre em duas etapas: 
! a primeira etapa consiste na associação dos anticorpos aos determinantes antigênicos. 
! a segunda etapa, ocorre em decorrência das colisões entre as partículas, o que resulta na 
dissociação dos anticorpos e a associação a partículas vizinhas. Desta forma forma-se a 
malha de interações visíveis a olho nu (Figura 7). 
O ensaio de aglutinação pode ser realizado com partículas que apresentam determinantes 
antigênicos naturais, tais como as hemácias, bactérias (aglutinação direta) ou pode ser realizado com 
partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita) adsorvidas com antígenos na sua superfície 
(aglutinação passiva ou indireta). 
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Figura 6 – Imunoeletroforese A. Separação do antígeno por eletroforese: Lâmina vista de cima na cuba de 
eletroforese. B. Adição do Anticorpo na canaleta C. Difusão e precipitação 
 - + 
Ag-soro humano 
Ag-soro de paciente com 
mieloma de IgG 
Tampão Papel de filtro 
Eletrodo 
A. 
Antisoro - soro de coelho anti- 
proteínas séricas humana 
IgG IgA IgM C3 Albumina 
B. 
IgG 
IgA IgM 
C3 Albumina 
C. 
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281 
Figura 7 – Aglutinação. A. Ausência de anticorpos, B. Presença de anticorpos 
Vários fatores podem interferir neste tipo de ensaio:o tipo de Ig (a IgM é 750 vezes mais 
eficiente que a IgG), o pH do meio (entre 6 e 8, é o ideal), enzimas, tempo e temperatura. Estes testes 
podem ser realizados em lâminas, placas ou tubos. 
Quando o soro tem altas concentrações de anticorpos pode ser observado o efeito de pró-zona, 
com resultados falso-negativos; para eliminar este efeito necessita-se diluir o soro. Na figura 8, por 
exemplo, nos poços C1 a C3 e C10 a C12 não houve aglutinação enquanto que nos poços de C4 a C9 
houve. Pode-se considerar que os anticorpos presentes nos poços de C1-C3, estão muito concentrados 
causando um efeito de pró-zona, entre C4 e C9, está ocorrendo a zona de equivalência e entre C10 e 
C12, os anticorpos estão muito diluídos, causando um efeito de pós-zona. 
A. B. 
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Figura 8 – Hemaglutinação em placa 
1. Aglutinação direta 
Na reação de aglutinação direta as partículas antigênicas (bactérias, hemácias, fungos, 
protozoários) podem estar na forma íntegra ou fragmentada. As reações de aglutinação direta que 
utilizam as hemácias podem identificar os tipos sanguíneos humano ABO e Rh (Figura 9). No caso da 
identificação do sistema ABO, as hemácias da pessoa são colocadas para incubar com anticorpos anti-A 
ou anti-B, em lâminas. Se a aglutinação ocorrer quando a incubação é feita com anti-A ou anti-B, as 
células serão respectivamente, A ou B; se a aglutinação ocorrer com os dois anticorpos em questão as 
hemácias serão do tipo AB e caso não ocorra aglutinação, o tipo sanguíneo será O. 
Além das hemácias, bactérias podem ser aglutinadas por anticorpos específicos, como no caso 
do teste para detecção de Salmonella (teste de Widal) e para o dianóstico da brucelose (teste de Wright). 
Testes de aglutinação para identificar infecção com Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma e 
Leptospira também são realizados. 
1: 512 
1: 64 
1: 256 
1: 128 
1: 16 
1: 128 
ausência 
1: 4096 
aglutinação Ausência de aglutinação 
Diluição do Soro: 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 
A 
B 
C 
D 
E
F
G
H 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Título do Anticorpo 
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Figura 9 – Aglutinação direta na identificação dos antígenos do sistema ABO 
2. Aglutinação direta por anticorpos anti-Rh - Teste de Coombs direto e Teste de Coombs 
indireto 
A doença hemolítica do recém-nascido é uma patologia que se enquadra no grupo das 
hipersensibilidades do tipo II (Capítulo 12), na qual uma mulher Rh negativa é sensibilizada por 
hemácias Rh positivas do filho, durante o parto, e a partir deste contato, IgG anti-Rh é passada pela 
placenta, durante a gravidez, causando anemia hemolítica nos filhos Rh positivos. A presença de 
anticorpos anti-Rh na membrana das hemácias fetais pode ser detectada pelo Teste de Coombs direto 
(Figura 10A) enquanto que a de anticorpos anti-Rh no soro materno pode ser detectada pelo Teste de 
Coombs indireto (Figura 10B). 
No teste de Coombs direto, as hemácias fetais estão revestidas in vivo pelos anticorpos anti-Rh, 
no entanto, não aglutinam. A adição in vitro de soro anti-Ig humana proporciona a aglutinação (Figura 
10A). No teste de Coombs indireto, hemácias Rh positivas são incubadas com o soro da paciente (mãe 
Rh negativa sensibilizada), no entanto, a aglutinação também é visualizada pela incubação de anti-Ig 
humana (Figura 10B). 
Anti-A Anti-B Anti-A Anti-B 
+ + + 
- - - 
-
+ 
B 
A 
AB 
O 
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284 
Figura 10 – Teste de Coombs. A. Teste direto, B. Teste indireto 
3. Hemaglutinação e aglutinação passiva 
Os testes de aglutinação passiva podem ser realizados com hemácias (hemaglutinação) ou com 
partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita). As hemácias são utilizadas, nos ensaios de aglutinação, 
por apresentarem uma superfície rica em moléculas, o que propicia a adsorção de vários tipos de 
antígenos. As hemácias mais utilizadas para esta finalidade, pela facilidade de obtenção, são as de 
carneiro e as humanas, que podem ser fixadas em formaldeído, permitindo que sejam estocadas por um tempo maior. 
Antígenos polissacarídicos geralmente conseguem adsorver de forma passiva na superfície das 
hemácias enquanto que os antígenos proteícos associam-se a hemácias taninizadas (pré-tratadas com 
ácido tânico). O teste de hemaglutinação para antígenos proteícos é mais sensível que os ensaios de 
precipitação, podendo detectar anticorpos em concentrações de até 0,01 µg/ml. Anticorpos contra 
Hemácias fetais Rh+ sensibilizadas in vivo 
com anti-Rh 
+ anti-Ig humana 
Aglutinação 
A. 
Hemácias Rh+ 
+ 
Soro de mulher Rh- 
sensibilizada com 
hemácias Rh+ 
Hemácias Rh+ e 
anti-Rh materno Aglutinação 
+ anti-Ig humana 
B. 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
285 
antígenos de Trypanosoma, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii entre outros podem ser detectados 
por meio desta técnica (Figura 11). 
A aglutinação passiva com partículas de látex é mais aplicada na detecção do Fator 
Reumatóide (FR), que é uma Ig (geralmente IgM), que reconhece a porção Fc da IgG, presente em 
algumas doenças auto-imunes reumáticas (Capítulo 15). Além da IgM, o FR pode ser uma IgG ou IgA 
que reconhece não só a porção Fc da IgG como também da IgA, da IgM ou da IgE. Neste teste a IgG é 
passivamente adsorvida às partículas de látex e quando o plasma contendo FR é incubado com estas, 
ocorre aglutinação. 
Figura 11 – Aglutinação passiva 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Teste de inibição da aglutinação passiva 
O teste de inibição da Aglutinação ou Hemaglutinação Passiva é um ensaio competitivo 
sensível para a detecção de concentrações entre 0,1-10 µg/ml de antígenos solúveis, haptenos ou 
anticorpos. Este teste consiste na incubação do líquido corporal do paciente (plasma, urina) com 
anticorpos específicos para o antígeno que se quer detectar e posterior incubação com hemácias 
adsorvidas com o mesmo antígeno. Na figura 12, queremos detectar a presença do hormônio 
Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG), presente na urina de mulheres grávidas. Quando a mulher 
está gravida e a urina é incubada com anticorpos anti-HCG, formam-se complexos HCG-anti-HCG que 
impedem a aglutinação de partículas de látex adsorvidas com HCG (Figura 12A). A urina da mulher 
normal como não contém HCG, propicia que os anticorpos anti-HCG associem-se ao látex adsorvido 
com o HCG, tornando a aglutinação possível (Figura 12B). 
Hemácea ou látex Ags:Toxoplasma gondii 
Plasmodium falciparum 
+ soro do paciente 
Hemaglutinação 
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Figura 12 – Inibição da aglutinação passiva. A. Mulher grávida, B. mulher não grávida 
5. Aglutinação passiva reversa 
Enquanto que na Aglutinação Passiva, as partículas são revestidas de antígenos, na 
Aglutinação Passiva Reversa, as partículas são revestidas de anticorpos. Para a realização do teste, as 
partículas revestidas com anticorpos adsorvidos são incubadas com o plasma, a urina ou o líquido 
encelaforraquidiano do paciente. Quando existem antígenos nestes líquidos que são reconhecidos pelos 
anticorpos adsorvidos nas partículas, estas aglutinam. É um teste geralmente utilizado em fases da 
infecção em que a concentração dos anticorpos é baixa e pode-se detectar a presença do agente 
infeccioso. Na Figura 13, as partículas estão revestidas de anticorpos contra o vírus da Hepatite; quando 
estas partículas são colocadas em contato com plasma contendo os vírus, estas aglutinam.Este ensaio é utilizado para detectar também alfa-fetoproteína e hemoglobina, além de diversos 
microorganismos (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophyllus influenzae, 
Mycobacterium tuberculosis). A sensibilidade deste ensaio é alta, detectando, por exemplo, entre 0,3-
0,6 ng/ml de polissacarídeo grupo-específico solúvel de H. influenzae. 
Urina - HCG solúvel 
+ 
Anti-HCG Partículas de látex+HCG Inibição da aglutinação 
A. 
 + 
Anti-HCG Partículas de látex+HCG Aglutinação 
B. 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
287 
Figura 13 – Inibição da aglutinação passiva reversa 
ENSAIOS DE IMUNO - MARCAÇÃO 
1. Imunofluorescência e imunoperoxidase 
A imunofluorescência, assim como a imunoperoxidase, são técnicas, realizadas em lâminas de 
microscópio, que permitem a detecção e localização de antígenos ou anticorpos em células ou tecidos. 
O que diferencia a imunofluorescência da imunoperoxidase, é que na primeira os anticorpos para a 
detecção do antígeno são marcados com moléculas que emitem luz fluorescente (fluoresceína, 
rodamina) enquanto que na segunda, os anticorpos são marcados com uma enzima (peroxidase, 
fosfatase alcalina). 
A técnica de imunofluorescência é de uso mais limitado que a imunoperoxidase, porque 
necessita de uma infraestrutura mais complexa: microscópio de fluorescência e uma sala escura para 
visualização da emissão da luz fluorescente. Além disso, os resultados precisam ser rapidamente 
analisados, porque a fluorescência vai sendo reduzida gradativamente, e é uma técnica que não pode ser 
adaptada à microscopia eletrônica. As vantagens da imunoperoxidase é que as lâminas submetidas à 
análise podem ser guardadas por vários anos, os resultados podem ser observados em qualquer 
microscópio óptico e a marcação enzimática pode ser adaptada às técnicas de microscopia eletrônica. 
Estas técnicas podem ser utilizadas para detectar microorganismos presentes em células e 
tecidos, auto-anticorpos ou moléculas do sistema Complemento, depositadas nos tecidos, 
Látex + Anti - vírus 
da hepatite 
Partículas virais presentes 
no soro 
+ 
Aglutinação 
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imunoglobulinas presentes nas células, antígenos tumorais, identificação de células por meio da 
detecção de moléculas específicas de cada população, dentre outras. 
A imunofluorescência e a imunoperoxidase podem ser de dois tipos: 
! Direta ou 
! Indireta. 
1.1 Imunofluorescência e imunoperoxidase direta 
Nas técnicas diretas, o antígeno tecidual é reconhecido por um anticorpo marcado com uma 
molécula fluorescente (imunofluorescência) ou uma enzima (imunoperoxidase). Por exemplo, se 
quisermos identificar simultaneamente por imunofluorescência, células CD4+ e CD8+ presentes no 
sangue ou no linfonodo de um paciente (Figura 14); neste caso, as células serão colhidas, aderidas em 
lâmina de microscópio, adequadamente fixadas e incubadas com anticorpos monoclonais (ver abaixo) 
anti-CD4 marcados com fluoresceína (emite luz verde) e anti-CD8 marcados com rodamina (emite luz 
vermelha). Após um tempo de incubação pré-estabelecido, as lâminas são lavadas para retirar os 
anticorpos que não se associaram e observadas ao microscópio de fluorescência. As células CD4+ 
apresentarão marcação de membrana em verde enquanto que as CD8+, marcação em vermelho. Se 
contarmos o número de células marcadas em verde e em vermelho, teremos, neste caso, a proporção de 
linfócitos Tauxiliares e Tcitotoxicos, respectivamente. 
No caso de utilizarmos a imunoperoxidase direta para identificar os linfócitos T e B, teremos 
que fazer duas lâminas, uma incubada com anti-CD4 e outra com anti-CD8, ambos marcados com 
Peroxidase; isto porque não é possível identificar pelas cores os padrões de marcação. Nesta técnica, 
depois da adição do anticorpo e posterior lavagem, deve-se incubar a lâmina com o substrato da enzima, 
no caso o Peróxido de Hidrogênio, e um doador de elétrons, tal como a diaminobenzidina (DAB). 
Durante a reação enzimática, esta substância sofre oxidação e polimeriza numa substância insolúvel, de 
cor castanha visível ao microscópio óptico. 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
289 
Figura 14 – Imunofluorescência direta para identificação das moléculas CD4 e CD8 
1.2 Imunofluorescência e imunoperoxidase indireta 
Na imunofluorescência ou na imunoperoxidase indireta, os antígenos teciduais ou celulares são 
detectados pela incubação com dois tipos de anticorpos: 
! O primeiro que reage diretamente com o antígeno, como o anticorpo monoclonal anti-CD4, 
que reconhece moléculas CD4 presentes na membrana de Linfócitos T auxiliares (Figura 15). 
! E o segundo, que reage com o primeiro anticorpo, sendo este marcado com o fluorocromo 
ou com a enzima. Suponhamos que o primeiro anticorpo (anti-CD4) tenha sido produzido 
em rato, ou seja, temos um anticorpo monoclonal de rato anti-CD4 humano. Neste caso, o 
segundo anticorpo deve ser um anticorpo produzido em outra espécie (carneiro, coelho, 
cavalo) que reaja com a Ig de rato. Caso o anticorpo monoclonal de rato anti-CD4, seja 
uma IgG, temos que ter um soro de carneiro (ou de cavalo, de coelho) anti-IgG de rato marcado 
com o fluorocromo ou a enzima. 
Lâmina apresentando células isoladas de 
linfonodo ou do sangue, em duplicata 
Anti-CD4 marcado com 
fluoresceína 
Anti-CD8 marcado com 
rodamina 
CD8 
Visualização ao microscópio de 
fluorescência 
CD4 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
290 
Figura 15 - Imunofluorescência indireta para identificação da molécula CD4 
A imunofluorescência e a imunoperoxidase indireta apresentam mais vantagens que a direta 
em vários aspectos. A primeira vantagem é que, nos laboratórios clínicos, se utilizássemos a técnica 
direta para identificar anticorpos anti-HIV ou outro microorganismo em pacientes, por exemplo, 
teríamos que marcar os anticorpos, de todos, com fluorocromo ou enzima e isto é impraticável. Outra 
vantagem é que o fato de utilizarmos dois anticorpos aumenta a sensibilidade da técnica e podemos 
utilizar menores concentrações do primeiro anticorpo, o que reduz os custos, principalmente quando 
estes são anticorpos monoclonais. 
A técnica de imunofluorescência é muito utilizada na pesquisa de Imunoglobulinas e moléculas 
do sistema Complemento, presentes nos rins e na pele em doenças auto-imunes. É utilizado também em 
casos de pesquisa de agentes infecciosos tais como: vírus respiratórios (influenza, para-influenza, 
adenovírus, vírus respiratório sincicial), vírus da família herpes (herpes simples, citomegalovírus), 
Treponema pallidum, Chlamydia, Legionella, Escherichia coli, estreptococcus beta hemolítico, dentre 
outros. Estes antígenos podem ser detectados em diferentes tipos de amostras: biópsias, urina, lavado 
broncoalveolar ou preparado de leucócitos. Os resultados podem ser analisados por meio da titulação do 
Soro de carneiro anti – IgG de rato 
marcado com fluoresceína 
IgG de camundongo Anti-CD4 
Primeiro Anticorpo Segundo Anticorpo marcado 
CD4 
Visualização ao microscópio de 
fluorescência 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
291 
soro; por exemplo, a detecção de IgM e IgG anti-Chlamydia pneumoniae em títulos maiores, 
respectivamente, que 1:32 e 1:2000 indica infecção ativa. 
2. Citometria de fluxo 
A citometria de fluxo permite, pelo uso de anticorpos monoclonais marcados com 
fluorocromos, quantificar células, expressando moléculas de diferenciação (CDs) ou outros antígenos, 
em amostras de células colhidas do sangue, de órgãos linfóides, dentre outros tecidos. Apesar da 
semelhança com a imunofluorescência, a citometria de fluxo é uma técnica automatizada na qual se 
utilizaum aparelho denominado fluorímetro (Figura 16). 
As células são previamente incubadas com diferentes anticorpos monoclonais marcados com 
dois ou mais fluorocromos e a quantidade de fluorocromo associada a cada célula é medida passando as 
células isoladamente num fluorímetro. Neste aparelho, à medida que as células passam por uma cânula, 
um feixe de raio laser é incidido sobre elas, refletindo a luz emitida, o que permite que esta luz seja 
identificada num sistema computadorizado, e seja feita a quantificação da molécula expressa por cada 
célula. Por exemplo, se quisermos avaliar a produção de células CD4+ (LTa) e CD8+ (LTc) presentes 
no sangue periférico de pessoas normais e infectadas pelo HIV. As células brancas do sangue de cada 
paciente são isoladas, incubadas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 marcados, respectivamente, com 
fluoresceína (fluorocromo verde) e rodamina (fluorocromo vermelho), e colocadas num fluorímetro. 
Estas células, à medida que passam pela cânula do aparelho, vão sofrer a ação de um feixe de raio laser 
e a luz emitida (verde ou vermelha) será identificada e a informação enviada para um computador. Os 
resultados obtidos são expressos, em gráficos, pelo computador. Num dos possíveis tipos de gráfico, 
cada célula é visualizada num quadrante, no qual observa-se a distribuição das células que expressam 
um dos fluorocromos (fluoresceína – LT CD4+ ou rodamina – LT CD8+), as que são negativas (DN-
duplo negativas) ou positivas para os dois fluorocromos (Figura 16). 
3. Separador de células ativadas por fluorescência (FACS – Fluorescent Activated Cell Sorter) 
Este aparelho, FACS - mais sofisticado que o fluorímetro, permite que além de quantificadas, 
as células sejam separadas de acordo com a sua ligação com o anticorpo monoclonal marcado com o 
fluorocromo. A separação ocorre porque as células são carregadas eletricamente e passam por campos 
magnéticos, cuja força e direção variam de acordo com a intensidade do sinal fluorescente emitido (Figura 16). 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
292 
Figura 16 – Citometria de fluxo e FACS 
 
Meio 
de 
cultura 
Células marcadas com 
anticorpos monoclonais 
fluoresceína – anti-CD4 
rodamina – anti-CD8 
Fluorescência 
FLUOROCROMO 2 (F2) 
 F 
 L 
 U 
 O 
 R 
 O 
 C 
 R 
 O 
 M 
 O 
 
 1 
 
(F1) 
%DN
%F1+ 
%F2+
%F1/F2+
Campos 
eletromagnéticos 
Detector de comprimento 
de onda e analisador 
Raio Laser 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
293 
Estas células podem ser reutilizadas para outros ensaios porque são mantidas a integridade e a 
esterilidade da amostra. 
4. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA - Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay) e 
radioimunoensaios (RIA-Radio-Immuno Assay) 
Os ensaios imunoenzimáticos e os radioimunoensaios apresentam os mesmos princípios 
técnicos com a diferença que no primeiro, a revelação da reação é realizada com anticorpos marcados 
com enzima, como na imunoperoxidase, e no segundo, a revelação é realizada com anticorpos marcados 
com isótopos radioativos (geralmente 125I ou 131I). Pelos efeitos deletérios da radiação, os 
radioimunoensaios estão sendo substituídos pelos ensaios imunoenzimáticos. 
Estes métodos podem ser utilizados para a detecção de antígenos (hormônios, drogas, 
marcadores tumorais, alérgenos) e de anticorpos (contra bactérias, vírus, fungos e protozoários). A 
sensibilidade de detecção destes ensaios é na ordem de nanogramas (ng) ou picogramas (pg). 
Será dada ênfase aos ensaios de ELISA, e dentre as variações empregadas na realização deste, 
serão focalizados os do tipo indireto e de captura. O método indireto propicia a detecção de anticorpos 
na amostra enquanto que no de captura são detectados antígenos, que podem ser inclusive Imunoglobulinas. 
Estas técnicas são geralmente realizadas em placas de poliestireno de 96 poços, o que propicia 
a utilização de um maior número de amostras num único ensaio (Figura 17). 
No método indireto, as placas são pré-incubadas com os antígenos contra os quais se quer 
detectar a produção de anticorpos; atualmente compram-se placas contendo alguns tipos de antígenos já 
padronizados (Figura 17A). Depois da pré-incubação, as placas devem ser lavadas para retirar os 
antígenos não aderidos e incubadas com soluções proteícas (leite desnatado, gelatina, albumina sérica 
bovina, caseína) para bloquear os locais não ocupados pelos antígenos. Esta etapa é importante porque 
como estas placas apresentam capacidade de adsorver proteínas, os anticorpos ou outras moléculas 
presentes nos líquidos analisados podem se associar à placa e alterar os resultados. Após o bloqueio, as 
amostras de soro/plasma são incubadas, por períodos de tempo e temperatura padronizados (Figura 17B); 
em seguida, as placas são lavadas para retirar os anticorpos não específicos e incubadas com anticorpos 
específicos para o primeiro anticorpo, marcados com uma enzima (fosfatase alcalina, por exemplo) (Figura 17C). 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
294 
Figura 17 - ELISA 
Placa de 96 cavidades 
A. Sensibilização da placa com o Ag 
Lavagem 
B. Adição do primeiro anticorpo 
Lavagem 
C. Adição do anticorpo marcado com 
enzima (ELISA) ou radioisótopo (RIA) 
Lavagem 
D. ELISA - adição do 
substrato e cromógeno 
E. Reação enzimática - reação colorida – leitura da 
Densidade Óptica (DO) no espectrofotômetro 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
A 
 
B 
C 
D 
E 
F 
G 
H 
Curva padrão 
Amostras 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
 
A 
 
B 
C 
D 
 
E 
F 
G
H
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
295 
A revelação da reação antígeno-anticorpo é feita pela incubação com o substrato da enzima e 
com os doadores de hidrogênio, sendo os mais comumente utilizados o ácido 5-aminosalicílico 
(castanho), o 2,2’-diazino (3-etilbenzotiazolino–6- ácido sulfônico-ABTS) (verde) e a 
tetrametilbenzidina-TMB (azul) (Figura 17D). A intensidade da cor no final da reação é proporcional a 
concentração dos anticorpos presentes na amostra (Figura 17E); e por isso este ensaio é colorimétrico. 
A leitura da intensidade da cor é obtida em espectrofotômetros, adaptados à leitura de placas, e 
estes resultados são dados em Densidade Óptica (DO), a qual é proporcional à concentração de 
anticorpos na amostra. Além das amostras dos pacientes, estes ensaios devem utilizar como controle 
antico onhecida, de forma que se possa quantificar a concentração de 
antico - padrão). Tendo-se a curva - padrão onde se tem a correlação 
entre rpo com a DO, pode-se calcular a partir das DOs de soros dos 
pacie specíficos. Como exemplo, examinemos a Figura 18. 
igura 18 – Curva padrão 
 Curva Padrão 
1.5 
e as c
atravé
conce
dados
regres
dados
 
rpos específicos, de concentração c
rpos presentes nas amostras (curva
concentrações conhecidas do antico
ntes, a concentração de anticorpos e
F
Concentração 
(mg/ml) 
DO 
2 1 
1 0,694 
Concentração do Anticorpo (mg/ml) 
D
O
 (
x 
n 
m
) 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 
0.0 
0.5 
1.0 
 
Na Figura 18, temos na tabela as concentrações de um anticorpo padrão (entre 2 e 0,25mg/ml) 
orrespondentes DOs; estes resultados propiciam que se tenha uma curva - padrão, a partir da qual, 
s da análise de regressão linear (por exemplo, Programa GraphPad Prism), pode-se calcular as 
ntrações x e y, cujas DOs são conhecidas. Na curva - padrão, a linha azul foi obtida a partir dos 
 de DOs e a concentração de anticorpos e a linha vermelha corresponde ao resultado da análise de 
são linear, que nos dá a segurançade que existe realmente uma correlação linear entre os dois 
. A análise de regressão linear proporciona um índice de correlação entre os dados, o qual deve ser 
0,5 0,347 
0,25 0,168 
X 0,894 
Y 0,325 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
296 
o mais próximo possível de 1,0, o que indica uma boa correlação entre os dados analisados. No caso da 
Figura 18, o índice de correlação da curva foi de 0,99071, o que nos indica que existe uma correlação 
linear entre a DO e as concentrações de anticorpos. A partir da equação obtida, tem-se que os valores 
desconhecidos X e Y correspondem às concentrações de anticorpos de 1,73 e 0,503 mg/ml, respectivamente. 
No método de captura (ou ELISA sanduíche), anticorpos específicos são aderidos à placa e a 
amostra contendo a molécula a ser reconhecida (hormônio, citocina, droga, Imunoglobulina, antígenos 
tumorais ou alérgenos) é colocada. Após os procedimentos normais de incubação e de lavagem, a placa 
é incubada com um soro policlonal marcado com enzima, que reconhece o antígeno associado ao 
anticorpo aderido à placa. Esta técnica é chamada de sanduíche porque o antígeno fica entre dois 
anticorpos, o aderido à placa e o anticorpo marcado com a enzima. Neste tipo de técnica quando o 
anticorpo aderido à placa é monoclonal deve-se ter o cuidado do segundo anticorpo marcado ser 
policlonal ou um monoclonal que reconheça um epítopo diferente do reconhecido pelo primeiro 
anticorpo. 
5. Western Blotting 
O termo blotting significa, em biologia molecular, transferir macromoléculas de um meio 
semi-sólido como o gel de poliacrilamida para um papel de filtro. A primeira técnica deste tipo descrita 
foi o Southern Blotting, na qual são transferidas moléculas de DNA; este nome foi dado à técnica por 
causa do sobrenome do cientista que a descreveu – E.M.Southern. Como uma brincadeira, a técnica 
descrita para a transferência de RNA foi denominada Northern Blotting e para proteínas, Western 
Blotting. A técnica de Western Blotting permite que peptídeos antigênicos sejam separados, por Peso 
Molecular (entre 5.000 e 250.000 daltons), e reconhecidos por anticorpos específicos. Vários antígenos, 
principalmente os patógenos, já são conhecidos em termos moleculares e apresentam um padrão 
característico de peptídeos e portanto, pode-se identificar, com alto grau de precisão, se um indivíduo 
apresenta uma infecção com um determinado tipo de patógeno. 
Na técnica de Western Blotting, peptídeos oriundos de um antígeno, por exemplo, dos HIV são 
separados por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo um detergente aniônico - o SDS (dodecil 
sulfato de sódio) (Figura 19). O SDS associa-se às regiões hidrofóbicas das proteínas conferindo-lhes 
cargas negativas, o que propicia a migração na eletroforese de acordo com o PM. Após a eletroforese, 
os peptídeos separados são transferidos por capilaridade (blotting) ou por corrente elétrica (eletroforese) 
para um papel de nitrocelulose. O papel de nitrocelulose apresenta a partir deste procedimento uma 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
297 
cópia dos antígenos que foram separados no gel e durante esta passagem do gel para o papel, o SDS é 
deslocado das proteínas e os determinantes antigênicos nativos são re-expostos. Na etapa seguinte, o 
papel contendo os peptídeos isolados é incubado com o soro dos pacientes em análise. Após lavagem, 
para a retirada dos anticorpos não associados, as fitas são incubadas com um soro anti-Ig humana 
marcado com uma enzima, com o substrato e o cromógeno. Quando o paciente apresenta anticorpos 
contra os peptídeos isolados, após a revelação pelo cromógeno, aparecem bandas (manchas) nos locais 
onde os anticorpos específicos se associaram. Além da revelação enzimática, podem ser utilizados 
anticorpos marcados com radioisótopos e assim o papel é submetido a autoradiografia (revelação com 
emulsão fotográfica), para que sejam visualizadas as bandas. 
Na figura 19, temos três padrões de resultado: 
! No papel de nitrocelulose referente ao paciente 1 estão presentes bandas nos locais 
correspondentes às proteínas de PM 120, 64, 55, 41, 33, 24 e 18 kD, demonstrando que 
apresenta anticorpos que reconhecem todos os componentes do HIV (Capítulo 19). 
! O papel de nitrocelulose referente ao paciente 2 não apresenta bandas o que significa que 
este não apresenta anticorpos específicos contra os peptídeos presentes na fita. 
! O papel de nitrocelulose referente ao paciente 3 apresenta banda apenas no local 
correspondente à p24, o que pode sugerir, que ele tenha uma infecção por um outro 
retrovírus, com peptídeos similares ao do HIV ou outro tipo de microorganismo que 
apresenta uma proteína de 24 kD. 
TÉCNICAS DE CULTURA CELULAR 
1. Cultura de células e ensaios de proliferação 
A grande maioria dos conhecimentos relativos à ativação celular, indução de citocinas, 
moléculas co-estimulatórias e outras tem sido obtidos com células cultivadas in vitro. Vários destes 
mecanismos têm sido, nos últimos anos, comprovados em sofisticados modelos in vivo utilizando 
animais nocauteados (nos quais genes foram inativados) e transgênicos (nos quais genes foram implantados). 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
298 
Figura 19 – Western Blotting A. Gel de separação, B. Tanque de Blotting (transferência para papel de nitrocelulose), 
C. Incubação com soro de paciente, Ig marcada e substrato, D. Visualização dos resultados 
 
A2 A3 
Soro dos pacientes 
A1 
Lavagem 
A1 A2 A3 
+anti-Ig humana 
marcada com enzima + 
substrato + cromógeno 
Polo - 
Polo + 
Amostras –Ags 
do HIV 
Peptídeos 
separados 
A A A
Papel de filtro 
Membrana de nitrocelulose 
Gel com peptídeos separados 
Papel de filtro Solução tampão 
A1 A2 A3 
 
120 
64 
55 
41 
33 
24 
18 
 
Interpretação dos resultados: 
 
A1- Paciente 1 –HIV+ 
A2- Paciente 2 – negativo 
A3 – Paciente 3 – p24+ (outro Ag
que expressa p24, além do HIV). 
Padrão de PM (kDa) 
A. B. 
C. 
D. 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
299 
As células cultivadas in vitro podem ser obtidas do sangue periférico ou de órgãos linfóides 
primários (medula óssea e timo) e secundários (linfonodos e baço). As culturas também podem ser 
feitas com linhagens obtidas de células tumorais que foram isoladas de seres humanos ou animais; estas 
linhagens podem ser de macrófagos, mastócitos, linfócitos ou outros tipos celulares; no entanto, estas 
células apesar de serem homogêneas apresentam alterações patológicas que podem interferir nos 
mecanismos em estudo. Desta forma, resultados obtidos com células de linhagens tumorais devem ser 
corroborados por resultados obtidos com células de padrão normal. 
As células isoladas do sangue (geralmente as principais células obtidas em seres humanos pela 
facilidade de coleta) ou de órgãos linfóides (geralmente, de animais de experimentação, na maioria dos 
casos, de camundongos) são colocadas em placas estéreis de plástico, em meios de cultura com 
suplementos importantes para a sua sobrevivência (Figura 20). 
Nestas placas, as células são submetidas a estímulos inespecíficos ou específicos. Os estímulos 
inespecíficos que ativam os linfócitos de forma policlonal, ou seja, independentemente de sua 
especificidade, são denominados mitógenos. Alguns mitógenos induzem a proliferação de linfócitos T 
enquanto que outros, a de linfócitos B. A concanavalina A (ConA), lectina isolada do feijão da espécie 
Canavalia ensiformis, induz a proliferação de linfócitos T de camundongos, enquanto que a 
Fitohemaglutinina (PMA), isolada do feijão da espécie Phaseolus vulgaris, induz a de linfócitos T 
humanos (Figura 20). O Lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) obtidode Salmonella ou de Escherichia 
coli ativa de forma policlonal os linfócitos B de camundongos, além de ativar os macrófagos, induzindo 
a produção de citocinas pró-inflamatórias e os produtos tóxicos de oxigênio e nitrogênio. 
Estes mitógenos geralmente são utilizados para avaliar o estado funcional celular porque pela 
sua capacidade de associação a açúcares da membrana celular, ativam entre 30 e 60% das células. Por 
outro lado, a ativação específica dos linfócitos nem sempre induz proliferação mensurável porque o 
percentual de células específicas para um determinado antígeno é muito pequeno (entre 0,2 e 0,01%). 
A utilização de antígenos na ativação celular in vitro é mais eficiente quando as células são 
oriunda+++++++s de animais ativados in vivo com altas doses do antígeno, o que propicia um aumento 
do número de células específicas. Em seres humanos, com exceção de alguns casos patológicos, é mais 
difícil ativar as células com antígenos isolados. No entanto, quando pessoas são vacinadas, suas células 
podem ser cultivadas na presença de antígenos da vacina para serem estudados os tipos de resposta 
induzidos: proliferação dos linfócitos, produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias. 
Como por exemplo: se quisermos estudar o tipo de resposta que uma vacina contra a leishmaniose está 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
300 
induzindo, teremos que isolar os leucócitos do sangue periférico das pessoas vacinadas e não vacinadas 
residentes no local região e cultivá-las com antígenos de Leishmania presentes na vacina e avaliarmos a 
resposta proliferativa e a secreção de citocinas, dentre outras possibilidades. 
Figura 20 – Cultura de células e ensaio de proliferação 
2. Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais 
Quando inoculamos um antígeno em um animal e coletamos o seu sangue, no plasma são 
encontrados os anticorpos específicos contra os determinantes antigênicos deste antígeno. Este plasma é 
um antisoro policlonal porque os anticorpos ali presentes são oriundos de vários clones de linfócitos B 
específicos para cada um dos determinantes antigênicos. Por exemplo, se inocularmos linfócitos T 
 1 2 3 4 5 6 
A 
 
B 
 
C 
 
D 
Sem estímulo 
+ PMA 
Coleta de sangue 
periférico 
Separação dos 
linfócitos do sangue 
Hemácias, plaquetas, granulócitos 
Linfócitos/monócitos 
Plasma 
Proliferação 
celular 
Citocinas 
(ELISA) 
Placa estéril de 24 poços 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
301 
humanos num camundongo, ocorrerá ativação de linfócitos T e B específicos contra as principais 
moléculas presentes na superfície da célula humana inoculada (Figura 21) e teremos, ao coletar o 
plasma dos camundongos, um conjunto de anticorpos que reconhecem estes determinantes antigênicos. 
No entanto, para se obter estes anticorpos específicos contra os determinantes antigênicos de 
forma isolada podemos utilizar a técnica de anticorpos monoclonais, desenvolvida em 1975, por Köhler 
e Milstein. Nesta técnica, o animal inoculado com o antígeno, no nosso caso os linfócitos T humanos, 
terá o seu baço ou linfonodo coletado e os linfócitos B isolados são fundidos com células de mieloma 
(um tumor de linfócitos B, não produtor de anticorpos), pelo uso de uma substância denominada 
Polietilenoglicol (PEG). Estas células são cultivadas em meios seletivos, que propiciam que apenas as 
células fundidas (hibridomas) sobrevivam. Os hibridomas obtidos da fusão de linfócitos B e das células 
do mieloma são células que apresentam a capacidade de secretar anticorpos e sobreviver 
indefinidamente em cultura, o que não ocorre com os plasmócitos. As células do hibridoma são diluídas 
em placas de plástico estéril de forma que em cada poço seja inserida uma única célula (ensaio de 
diluição limitante). Quando a célula prolifera, ela secreta anticorpos mono-específicos, ou seja, os 
anticorpos monoclonais, oriundos de um único clone. Foi exatamente desta forma que foram 
descobertas as moléculas (CDs) presentes na membrana dos linfócitos T, B, macrófagos, NK e outras. 
TÉCNICAS DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE ANIMAIS 
1. Camundongos transgênicos 
Os camundongos transgênicos são aqueles nos quais foram introduzidos no genoma, durante a 
fase embrionária, novos genes pré-existentes ou não (seqüências clonadas e denominadas transgenes). A 
primeira etapa na criação de um camundongo transgênico é a indução de superovulação em um 
camundongo fêmea, pelo inóculo de Hormônio Folículo Estimulante e Gonadotrofina Coriônica. Após a 
indução da ovulação, o camundongo fêmea é acasalado e o oócito fertilizado removido e a seqüência do 
gene injetado no pró-núcleo masculino. Estes oócitos fertilizados são inoculados no útero de fêmeas 
pseudo-grávidas. Das centenas de cópias de genes injetadas no pró-núcleo, cerca de 25% são integradas 
no genoma e originam os camundongos transgênicos. Estes camundongos transgênicos geralmente são 
heterozigotos e devem ser endocruzados para originar a linhagem homozigota. 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
302 
Figura 21 – Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais 
Da2 Da4 
Da3 
Da1 
Ag - Linfócitos T humano Inóculo em camundongos 
Coleta de sangue 
Coleta do baço 
Antisoro policlonal 
Células do baço Células de mieloma 
Fusão 
Hibridomas 
Separação dos clones de 
linfócitos B 
 1 2 3 4 5 6 
A 
 
B 
 
C 
 
D 
Coleta do sobrenadante 
das culturas 
Anticorpos monoclonais 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
303 
Estes camundongos são importantes nos estudos das atividades da grande variedade de moléculas que o 
organismo produz. Por exemplo: se o gene da IL-4 foi clonado e queremos observar o efeito desta 
citocina na infecção contra a Leishmania, podemos criar um camundongo que expresse em excesso a 
IL-4 (transgênico para IL-4) e após a infecção, acompanhar comparativamente em relação ao 
camundongo normal da mesma linhagem, o desenvolvimento da lesão, o número de parasitas na lesão e 
nos órgãos linfóides, a indução de outras citocinas e a resposta imune nestas condições. 
2. Camundongos nocauteados (knock out) 
A técnica de nocaute gênico permite que genes mutados in vitro e inseridos, durante o 
desenvolvimento embrionário no blastocisto, originem camundongos deficientes na produção da 
molécula induzida pelo gene. Assim como foram utilizadas, nos primórdios da Imunologia, as técnicas 
de timectomia, bursectomia, esplenectomia para serem estudadas as funções destes órgãos, hoje se pode 
mutar qualquer gene, impedindo que ele seja expresso de forma adequada. Várias funções das citocinas, 
de moléculas co-estimulátorias têm sido estudadas, em diferentes modelos experimentais, por meio desta técnica. 
Para que seja produzido um camundongo nocauteado, a primeira etapa consiste na clonagem 
do gene e da sua modificação in vitro. Estas modificações são obtidas pela inserção de dois genes (Figura 22): 
! O da resistência a neomicina. Este gene insere-se em regiões intragênicas, modificando a 
sua expressão, ou seja mutando o gene (Figura 22A); além disso, atua como marcador da 
célula mutante, porque esta se torna resistente a neomicina, quando cultivada em meio 
contendo este antibiótico (Figura 22C3). 
! O da timidina quinase (tk), do vírus herpes. Este gene não é expresso quando a célula sofre 
recombinação homóloga, ou seja, quando ocorre a troca do gene normal pelo mutado. 
Como a célula mutante não expressa o gene tk, esta não é sensível ao ganciclovir, agente 
anti-viral (Figura 22C3). Por outro lado, as células que apresentam inserção aleatória do 
gene, continuam expressando o gene tk e sãosensíveis ao ganciclovir (Figura 22C2). 
Após a mutação, estes genes são inseridos num vetor e introduzidos em células embrionárias 
primordiais (ES – Embryonic Stem Cells) de camundongo (linhagem 1). Estas células são capazes de 
originar qualquer tipo de tecido (Figura 22B). 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
304 
Figura 22 – Clonagem do gene e inserção em células in vitro. A. Clonagem do gene (IL-4, por exemplo) e mutação do 
gene in vitro (inserção do gene da resistência à neomicina (neo) e o gene timidina quinase –tk- do vírus herpes), B 
Inserção in vitro do gene mutado em células tronco embrionárias (transfecção), C.Tipos de inserção:1. ausência de 
inserção, 2. Inserção ao acaso e 3. Inserção por recombinação homóloga 
Gene da IL-4 neo Tk 
Gene excisado 
Cultivo em 
Neomicina e 
ganciclovir 
Morte 
Morte 
Sobrevivência 
Proliferação 
Céls.Tronco 
Cromossomos 
(linhagem 1) 
A. 
B. 
C. 1. 2. 3. 
CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS 
 
305 
Estes genes introduzidos podem apresentar três destinos diferentes na célula: ausência de inserção, 
inserção aleatória e inserção por recombinação homóloga. Desta forma, apenas uma pequena população 
das células apresenta o gene inserido de forma correta, ou seja, os que apresentaram recombinação 
homóloga; para que ocorra seleção destas células, elas são cultivadas em meio contendo neomicina e 
ganciclovir, como acima referido. 
O resultado desta cultura em meio contendo neomicina e ganciclovir é o seguinte: 
! As células que não tiveram o gene inserido, são sensíveis a neomicina e morrem (Figura 22C1). 
! As células que apresentam inserção aleatória, não perdem o gene da tk e são sensíveis ao 
ganciclovir e morrem (Figura 22C2). 
! As células que sofreram recombinação homóloga do gene mutado apresentam resistência a 
neomicina e por não expressarem a tk são resistentes ao ganciclovir e sobrevivem (Figura 22C3). 
Na próxima etapa, estas células sobreviventes são inseridas in vitro em blastocisto de 
camundongo fêmea de cor de pelagem diferente (linhagem 2) daquela da qual foram coletadas as 
células embrionárias (linhagem 1) (Figura 23A). Após a introdução das células no blastocisto, este é 
inserido em camundongos fêmea na qual foi induzida a gravidez hormonal. O blastocisto desenvolve-se 
e origina uma prole formada por camundongos quiméricos, ou seja, apresentando características das 
duas linhagens. A utilização de camundongos de pelagens diferentes é importante para a identificação 
dos camundongos quiméricos que herdaram os genes mutantes: estes apresentam um padrão mesclado 
de cor de pelagem. Por exemplo, as células embrionárias (linhagem 1) podem ser oriundas de 
camundongos de pelagem marrom enquanto que o blastocisto de fêmeas de pelagem negra (linhagem 2). 
Os camundongos quiméricos apresentam a cor negra mesclada com faixas marrons e são heterozigotos 
para o gene mutado. Estes camundongos quiméricos são cruzados com camundongos normais, para que 
seja obtida uma linhagem homozigota para o gene mutante (Figura 23B). 
FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
306 
Figura 23 – Obtenção de camundongos nocauteados A. Inóculo das Células Tronco Embrionárias de camundongo 
marrom em blastocisto de fêmeas pretas B. cruzamento dos camundongos quiméricos 
Blastocisto Células tronco Reimplante do blastocisto em 
fêmea pseudo-grávida 
Filhote quimérico 
Cromossomos (linhagem 2) 
Cromossomo com 
gene mutado 
Cromossomos 
normais 
Cromossomo mutado 
A. 
B. 
	ENSAIOS IMUNOLÓGICOS
	INTRODUÇÃO
	ENSAIOS DE PRECIPITAÇÃO
	Título do anticorpo
	Figura 1 – Reação de Precipitação: A. Ponto de Equivalência, B. Efeito de Pró-zona e C. Efeito de Pós-zona
	1. Teste do anel ou ring test
	Figura 2 – Ensaio do Anel A. Reação Negativa: soro antes da imunização, B. Reação Positiva: soro pós-imunização
	2. Imunodifusão
	Figura 3 – Imunodifusão dupla
	3. Imunodifusão dupla, segundo Ouchterlony
	Figura 4 – Imunodifusão de Ouchterlony
	4. Imunodifusão radial simples
	Figura 5 – Imunodifusão radial simples A. Curva padrão, B. Placa com concentrações do Ag e da solução padrão
	5. Imunoeletroforese
	ENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
	Figura 6 – Imunoeletroforese A. Separação do antígeno por eletroforese: Lâmina vista de cima na cuba de eletroforese. B. Adição do Anticorpo na canaleta C. Difusão e precipitação
	Figura 7 – Aglutinação. A. Ausência de anticorpos, B. Presença de anticorpos
	Figura 8 – Hemaglutinação em placa
	1. Aglutinação direta
	Figura 9 – Aglutinação direta na identificação dos antígenos do sistema ABO
	2. Aglutinação direta por anticorpos anti-Rh - Teste de Coombs direto e Teste de Coombs indireto
	Figura 10 – Teste de Coombs. A. Teste direto, B. Teste indireto
	3. Hemaglutinação e aglutinação passiva
	Figura 11 – Aglutinação passiva
	4. Teste de inibição da aglutinação passiva
	Figura 12 – Inibição da aglutinação passiva. A. Mulher grávida, B. mulher não grávida
	5. Aglutinação passiva reversa
	Figura 13 – Inibição da aglutinação passiva reversa
	ENSAIOS DE IMUNO - MARCAÇÃO
	1. Imunofluorescência e imunoperoxidase
	1.1 Imunofluorescência e imunoperoxidase direta
	Figura 14 – Imunofluorescência direta para identificação das moléculas CD4 e CD8
	1.2 Imunofluorescência e imunoperoxidase indireta
	Figura 15 - Imunofluorescência indireta para identificação da molécula CD4
	2. Citometria de fluxo
	3. Separador de células ativadas por fluorescência (FACS – Fluorescent Activated Cell Sorter)
	Figura 16 – Citometria de fluxo e FACS
	4. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA - Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay) e radioimunoensaios (RIA-Radio-Immuno Assay)
	Figura 17 - ELISA
	Figura 18 – Curva padrão
	5. Western Blotting
	TÉCNICAS DE CULTURA CELULAR
	1. Cultura de células e ensaios de proliferação
	Figura 19 – Western Blotting A. Gel de separação, B. Tanque de Blotting (transferência para papel de nitrocelulose), C. Incubação com soro de paciente, Ig marcada e substrato, D. Visualização dos resultados
	Figura 20 – Cultura de células e ensaio de proliferação
	2. Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais
	TÉCNICAS DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE ANIMAIS
	1. Camundongos transgênicos
	Figura 21 – Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais
	2. Camundongos nocauteados (knock out)
	Figura 22 – Clonagem do gene e inserção em células in vitro. A. Clonagem do gene (IL-4, por exemplo) e mutação do gene in vitro (inserção do gene da resistência à neomicina (neo) e o gene timidina quinase –tk- do vírus herpes), B Inserção in vitro do gen
	Figura 23 – Obtenção de camundongos nocauteados A. Inóculo das Células Tronco Embrionárias de camundongo marrom em blastocisto de fêmeas pretas B. cruzamento dos camundongos quiméricos