Transcrição e Tradução do DNA, Ciclo Celular e Oncogenese

Prévia do material em texto

Transcrição: DNA - RNA
Para início da transcrição são necessários Enhancers, Elementos de controlo próximos, Promotores.
O processo de transcrição não ocorre sempre exatamente da mesma forma. Em primeiro, ocorre o 5’ Capping e depois as proteínas vão se justapondo, e os processos vão ocorrendo à medida que o mRNA se livra da RNA polimerase e com a existência de proteínas.
5’ Capping de RNA
- Modificação química do primeiro nucleótido a ser transcrito, por uma RNA Polimerase II. Há ligação trifosfato 5’-5’ entre o nucleótido e uma guanina (na orientação inversa 3’-5’).
- A ligação da guanina terminal 5’ é catalisada pela enzima nuclear guanidil-transferase.
- Protege química e estruturalmente o RNA a ser formado de exonucleases (5’-3’), é sinal para elongação, aumenta a probabilidade de processamento, é sinal de exportação do núcleo e tradução.
Processamento
- Excisão de intrões (Splicing), regulação de exões e adição da cauda de poli-A – hidrólises, ataques estereoquímicos ou nucleofílicos. 
- Exão: sequência que se mantêm no transcrito maduro após maturação (e Splicing se ocorrer); 
- O mRNA nunca pode estar sem as extremidades 5’-Cap e 3´-Poli-A pois estas evitam a formação de estruturas secundárias que impedem o complexo de processamento de aceder à sequência, além de proteger contra a ação de RNAses e outras exonucleases.
hnRNP – Ribonucleoproteínas que evitam a formação de estruturas secundárias, direcionam o RNA para os poros nucleares, auxiliam o transporte, e ajudam na associação a moléculas essenciais para o processamento, direcionamento, transporte, e shuttle entre núcleo e citoplasma.
- Antes da saída do núcleo, é preciso saber se a molécula de RNA tem atividade no citoplasma e um controlo de qualidade. Caso saia um RNA “incorreto” ele é enviado de novo para o núcleo.
- Ligam-se ao RNA através de ligações eletrostáticas fortes, ou possuem pequenas sequências que se ligam por complementaridade a sequências específicas no RNA.
Terminador 
- Sequência no DNA onde seligam proteínas que indicam que aquele é o local de corte, e provocam a separação da RNA Polimerase da molécula. As proteínas que se ligam ao Terminador vão: desfosforilar o CTD, provocar o disassembling da maquinaria de transcrição, e chamar as proteínas que reconhecem o sinal de Poli-A
DNA	5’	3’Proteínas
Sequência Terminador
Sinal de Poli-adenilação - AAUAA
mRNA 5’	3’Poli-A Polimerase
Poli-A Binding Proteins
Poli-Adenilação
- Quando o fator CPSF da Polimerase reconhece o sinal de Poli-Adenilação, e o fator CstF reconhece uma região rica em GU, os fatores mais a jusante, CFII e CFI clivam o RNA. Na extremidade 3’-OH formada, liga-se a Poli-A Polimerase.
CPSF	- Clivage and polyadenilation specific factor
	- Contem subunidades que se ligam directamente ao motivo AAUAAA e ao CstF
CstF	- Cleavage simulatory factor
	- Contem um elemento que reconhece a sequência rica em GU a jusante
CFI e CFII	– cleavage factor
	- endonucleases responsáveis pela clivagem da sequência em excesso
PAP	– poly (A) polymerase
	- Sintetiza a cauda de poly A
	- Tem um actividade catalítica não específica, mas quando combinada com outros
componentes, a reacção de síntese torna-se específica para mRNAs que contêm a
sequência AAUAAA.
- A PAP só adiciona um sequência relativamente curta de A (aproximadamente 10
resíduos).
- Depois é a PAPB II que se liga à cauda oligo(A) e promove a extensão da cauda polyA até à sua extensão total de aproximadamente 200 resíduos. 
- Quanto maior a cauda de Poli-A, maior o tempo de vida do mRNA no citosol e por isso, maior probabilidade de ser traduzido e mais vezes (p.ex. housekeeping gene). 
- À cauda de Poli-A podem se ligar proteínas (PBP) que estabilizam a molécula e dificultam a ação de exonucleases. A poli-adenilação é um fenómeno com fase nucleotídica e outra citosólica.
A partir do transcrito inicial, pode-se obter mRNAs com diferentes locais de para poli-adenilação. Esses locais são mais fortes dependendo do tecido, do estado do ciclo de vida, do momento regulatório e da função dos genes encontrados em cada zona (os outros sinais poderão estar ocupados com proteínas). 
P.ex. No tecido X, os sinais 1 e 3 podem estar ocupados com proteínas, então o mRNA será cortado no local 2, produzindo um mRNA maduro que possui os exões rosa e verde.1
3
2
No tecido Y, em que é necessário o gene amarelo, o sinal 3 estaria disponível.
Sem o 5’-Cap o transcrito teria um 5’ livre que é o alvo preferencial das RNAses – Essencial para transporte de saída do núcleo, sinalizar o exão justaposto e correto Splicing
Poli-Adenilação ocorre no núcleo e posteriormente pode haver prolongamento no citosol 
Splicing
É possível identificar alguns mecanismos de Splicing:
- Em eucariontes superiores os intrões são removidos dos pré-mRNAs nucleares por sistemas que reconhecem apenas pequenas sequências consensus conservadas em todos os limites exão-intrão e dentro dos intrões – |GU...AG|. Esta região requer um grande complexo de Splicing, que forma um arranjo de proteínas e ribonucleoproteínas que formam o spliceossoma. Este mecanismo de Splicing envolve transesterificações, e os centros catalíticos tanto podem ser RNA como proteínas.
- Certos RNA têm a capacidade de auto-excisar os seus intrões. O mecanismo também assenta em reações de transesterificações onde apenas o RNA é o agente catalítico.
Sequências consensos – Não há grande homologia ou complementaridade entre as duas terminações de um intrão; contudo, as junções têm pequenas sequências consenso bem conservadas.
Para ocorrer Splicing é necessário: Molécula de RNA com pelo menos 2 exões, que flanqueiam 1 intrão, 5’-Cap e 3’-Poli-A (dão força ao Splicing 5’ e 3’ respetivamente)
- Exão: sequência que se mantêm no transcrito maduro após maturação (e Splicing se ocorrer); 
- Intrão: sequência que é cisada do pré-RNA durante o splicing; delimitado a 5’ por GU e a 3’ por AG há conservação destas sequências, e são requeridas para que se dê o splicing – consensus no mecanismo de splicing. 
Splicing Sites e Branching Site
- Na posição 6 a partir do 3’-AG existe uma Adenina (A) – A-pos6
(Purina numa zona rica em pirimidinas; possui mais grupos reativos)
- Na posição limite a montante do intrão existe uma guanina (G) 
- O grupo -OH dessa adenina provoca um ataque nucleofílico ao grupo fosfato na extremidade exão-intrão com guanidina (5’). Há libertação do intrão, e formam-se uma extremidade 3’-OH livre no exão (a 5’ do intrão) que irá competir pela ligação ao grupo 5’-OPO do exão a jusante, unindo os exões 
· O local de corte 5’ chama-se donor site; o local de corte 3’ chama-se acceptor site
- Para que não haja corte no meio do intrão, as sequências GU que não limitam o intrão estão associadas a proteínas que não permitem a ligação com a A-pos6
- A conformação permite que os cortes se realizem nos nucleótidos corretos
- Processo com gasto energético e muito rápido
Splicing Alternativo
- A Adenina que realiza o ataque não é a A-pos6
- Se a A-pos6 estiver ocupada (impedida com proteínas) outra Adenina a jusante (no interior do exão-3’) pode realizar o ataque. Em circunstâncias normais, o splicing ocorre entre locais dentro do mesmo intrão.
- A conformação do RNA influência a acessibilidade dos locais de splicing. Porém, pode haver diferentes conformações, levando a diferentes ordens de remoção dos intrões. Uma molécula mais longa tem mais opções de conformação, logo há mais possibilidades de diferentes ordens de splicing.
Isto implica que nem todos os intrões são removidos, assim como nem todos os exões chegam ao RNA maduro
Os exões azul e laranja são mais fortes – a força é avaliada pela frequência com que ocorrem
Podemos ter uma mesma célula a produzir transcritos com diferentes combinações de exões e intrões – depende do tempo no ciclo de vida, idade, gênero, etc.
O splicing é independente da transcrição ou modificação do RNA (ocorre sem as reações de capping nem poli-adenilação). Contudo, estes eventos normalmente ocorrem de uma forma coordenada, e a eficiência do splicing pode ser influenciadapor outros eventos de processamento.
snRNA 
- Pequenos RNAs, ricos em uridina, que podem ser encontradas dentro do núcleo (eucariontes). São transcritos pela RNA polimerase II ou III. Associados a proteínas específicas que formam os complexos snRNP (pequenas ribonucleoproteínas nucleares)
- Envolvidos no splicing de RNA, a regulação de fatores de transcrição ou RNA polimerase II, e manutenção do telómero. 
Spliceossoma
Contém proteínas e RNAs (em adição ao próprio pré-mRNA). 
- Ribonucleoproteínas (RNP)– Os RNAs ganham a conformação de pequenas moléculas, que existem como pequenas ribonucleoproteínas (snRNP).	Associam-se ao intrão por complementaridade de bases logo que o fragmento sai da RNA-polimerase. 
-Ajudam na torção do RNA que facilita o splicing
- Impedem algumas regiões.
- Existem 5 snRNAs envolvidos no splicing: U1, U2, U4, U5e U6 (são denominados de acordo com o snRNP presente. Cada snRNP contém um único snRNA e algumas proteínas (<20). Todos os componentes de splicing são montados e asseguram-se que os locais de splicing estão disponíveis antes de alguma alteração irreversível seja feita ao RNA.
- O spliceossoma depende de interações RNA-RNA, proteína-RNA e proteína-proteína.
Processo de Splicing
1. Reconhecimento das sequências consensus do local de splicing 5’, do local de branch e das suas pirimidinas adjacentes.
· Reconhecimento das sequências consensus envolve RNAs e proteínas. Alguns snRNAs têm sequências complementares às sequências consensus.
2. Forma-se um complexo contendo todos os componentes de splicing - Spliceossoma.
3. Ocorrem as reações de clivagem e ligação que alteram a estrutura do RNA.
· Uma adenina, 6 nucleótidos a montante do limite 3’ do intrão, forma uma ligação com a guanina a 5’ do intrão. Ao se ligarem, há um corte no local 5’, separando o exão-5’ (esquerda) da molécula intrão-exão da direita. O exão da esquerda fica na forma de molécula linear. A molécula intrão-exão da direita forma um laço, com a extremidade 5’ gerada ligada à A-pos6 - local de branch
· O intrão é libertado em forma de laço quando ocorre uma clivagem no local 3’, aquando o exão à sua direita se liga ao exão à sua esquerda (os dois fenómenos ocorrem como uma transferência coordenada).
4. O complexo desagrega-se ou é reorganizado para outras reações de splicing.
Início de Splicing
O primeiro complexo formado durante o splicing é o E (early presplicing)
- Contém: a snRNP U1, o fator de splicing U2AF, e proteínas da família SR (que incluem um importante grupo de fatores e reguladores de splicing).
- A U1 inicia o splicing ao unir-se ao local de splicing 5’ em interação RNA-RNA. As proteínas SR conectam U2AF com o U1.
- O complexo E pode formar-se através de mais que um caminho!
· Intron Definition: reação mais direta, que se baseia no reconhecimento de ambos os locais de splicing, sem que seja necessária qualquer sequência fora do intrão. Neste caso, a ligação da snRNP U1 ao local de splicing 5’ é necessário para que a U2AF se ligue a uma faixa de pirimidinas entre o local de branch e o local de splicing 3’, tornando possível que as extremidades 5’ e 3’ do intrão se juntem neste complexo.
· Exon Definition: pode ser utilizada quando os intrões são muito longos e os locais de splicing são fracos. O local 5’ é reconhecido pelo snRNA U1, tal como na via normal. Contudo, o local 3’ é reconhecido como parte de um complexo de que se forma ao longo do exão seguinte, em que o próximo local de splicing 5’ também é ligado ao snRNA U1. Este U1 é ligado ao U2AF na faixa de pirimidinas por proteínas SR. O que marca este caminho é que são necessárias sequências jusante do intrão (local de splicing 5’ do exão seguinte).
Quando o snRNA U2 se liga ao local de branch (tem sequências complementares ao mesmo), o complexo E é convertido em complexo A. Se o complexo E se tiver formado por Exon Definition, quando o snRNA se liga ao local de branch, há um rearranjo em que o correto local de splicing 5’ substitui o local 5’ a jusante no complexo.
Formação do Spliceossoma:
Após a formação do complexo E, os outros snRNPs e fatores envolvidos no splicing associam-se ao complexo numa ordem definida.
- Complexo E é convertido em complexo A, com a ligação do snRNA U2 ao local de branch.
- Forma-se o complexo B1 quando um trímero (contendo os snRNPs U4, U5, U6) se liga ao complexo A (que já continha os snRNPs U1 e U2). Desta forma, este complexo é reclassificado como spliceossoma, pois contem todos os componentes necessários para que ocorra o splicing.
- O spliceossoma passa por uma série de complexos à medida que o splicing ocorre. É convertido em complexo B2 com a libertação do snRNP U1. Esta dissociação é importante para permitir que outros componentes se sobreponham ao local de splicing 5’, principalmente a snRNP U6.
- A reação catalítica é desencadeada quando a U4 se dissocia da U6; isto requer o gasto de ATP. Quando a U4 se dissocia, a região da U6 que é libertada torna-se livre para formar outra estrutura. A primeira parte desta emparelha com a U2; a segunda parte forma um hairpin intramolecular.
Complexos Alternativos de Splicing
A dependência do tipo de spliceossoma é também influenciada por sequências nos intrões, de modo que há alguns intrões com junções AU-AC que sofrem splicing com um spliceossoma do tipo U2, enquanto intrões com junção GU-AG sofrem splicing com spliceossoma do tipo U12. Os intrões dependentes de U12 são definidos por longas sequências consensus nas junções de splicing, mas usualmente incluem as mesmas junções GU-AG.
Os dois tipos de intrões coexistem em grande variedade nos genomas, e em alguns casos são encontrados no mesmo gene. Os intrões dependentes de U12 tendem a ser flanqueados por intrões dependentes de U2.
Exportação do mRNA
Após ser sintetizado e processado, o mRNA é exportado do núcleo para o citoplasma sob a forma de complexo ribonucleoproteico.
Os intrões talvez consigam prever a exportação do mRNA por estarem associados aos complexos de splicing. O spliceossoma pode também fornecer o ponto inicial de contacto para o complexo de exportação.
O complexo EJC (exon junction complex) é inicialmente montado devido a uma interação com um dos fatores de splicing. Depois do splicing, o EJC mantém-se ligado ao mRNA imediatamente a montante da junção exão-exão. 
O complexo EJC inclui um grupo de proteínas, denominadas família REF (o membro melhor caracterizado denomina-se Aly). As proteínas REF interatuam com proteínas transportadoras (normalmente denominadas “TAP/Mex”), que são diretamente responsáveis pela interação com o poro nuclear, e fazem com que o RNA seja exportado pelos poros nucleares.
Se os intrões forem eliminados de um gene, o seu produto de RNA é exportado muito mais lentamente para o citoplasma. Isto sugere que os intrões devem fornecer um sinal para a ligação dos componentes de exportação.
Classes de Intrões
Os intrões em genes codificantes de proteínas podem ser divididos em três classes gerais.
Intrões dos pré-mRNAs nucleares - possuem os dinucleótidos GU…AG nas extremidades 5’ e 3’, e o local de branch/faixa de pirimidinas perto da extremidade 3’. Estes não apresentam características comuns de estrutura secundária.
Intrões do grupo I e do grupo II	- encontram-se em organelos e bactérias (o grupo I pode ser encontrado no núcleo de eucariontes inferiores).
- São classificados de acordo com a sua organização interna; cada um pode ser enrolado numa estrutura secundária típica. Assim, conseguem ter a habilidade de se excisar a si mesmos do RNA onde se encontram autosplicing.
- Os intrões do grupo II têm a capacidade de realizar um autosplicing, formando também uma estrutura de laço:
· Este grupo de intrões excisa-se a ele mesmo do RNA num evento de autocatálise.
· As junções de splicing e o mecanismo de splicing deste grupo são semelhantes ao splicing de intrões nucleares.
· Este grupo de intrões dobra-se numa estrutura secundária que consegue gerar um local
Os intrões excisam-se devido a duas transesterificações sucessivas:
· Na primeira reação, o local de junção exão-intrão5’ é atacada por um grupo hidroxilo livre.
· Na segunda reação, o 3’-OH livre que se encontra no final do exão clivado, ataca o local da junção exão-intrão 3’.
Existem semelhanças entre a estrutura nos intrões nucleares e dos intrões tipo II.
· A combinação da U6 com a U2 e da U2 com o local de branch faz com que se forme uma estrutura semelhante à estrutura dos intrões do tipo II.
· Talvez as funções das snRNPs tenham evoluído de um sistema autocatalítico.
Splicing Cis e Trans
Tanto em termos de mecanismo como evolucionários, o splicing tem sido visto como uma reação intramolecular, correspondendo essencialmente a uma deleção controlada das sequências dos intrões ao nível do RNA.
Em termos genéticos, o splicing ocorre apenas em Cis (apenas sequências na mesma molécula de RNA podem ser juntos no splicing). Assim, deverá haver um reconhecimento por parte dos spliceossoma dos locais de splicing 3’ e 5’ de diferentes RNAs quando estes se encontram nas proximidades.
Não se pode dizer que o splicing Trans não ocorre entre pré-mRNAs transcritos do mesmo gene, mas sabe-se que deverá ser extremamente raro.
O trans-splicing ocorre in vivo em situações especiais. Ocorre em tripanossomas (protozoários) e em vermes onde uma pequena sequência (SL RNA) sofre splicing na extremidade 5’ de muitos precursores de mRNAs.
Terminação da Transcrição
As extremidades 3’ dos RNAs podem ser geradas de duas formas.
- Algumas RNA polimerases terminam a transcrição numa sequência definida no DNA (terminador).
- Outros RNAs polimerases não têm um evento discreto de terminação, mas continuam para além do local correspondente à extremidade 3’, que depois é gerada pela clivagem do RNA por uma endonuclease.
As RNA polimerase I e III têm eventos de terminações discretos (como a RNA polimerase bacteriana).
- A RNA polimerase I termina a transcrição quando reconhece uma sequência terminadora de 18-bp. (transcreve o rRNA)
- A RNA polimerase III termina a transcrição quando reconhece uma sequência de poly(U)4 contidas numa zona rica em sequência G-C. (transcreve RNA funcionais tais como tRNA, alguns snRNA, e 5SrRNA.)
- Não é claro se a RNA polimerase II procede ao evento de terminação nalgum local específico. É possível que essa terminação seja vagamente específica.
A extremidade 3’ do mRNA é gerada por clivagem seguida de poli-adenilação; a poli-adenilação é necessária para a maturação dos mRNAs a partir do RNA nuclear.
A RNA polimerase transcreve até depois do local correspondente à extremidade 3’, e depois sequências no RNA são reconhecidas como alvo para um corte por uma endonuclease, seguido de poli-adenilação.
A clivagem e a poli-adenilação são realizadas na presença de um único complexo proteico que contem um fator específico, uma endonuclease e uma poli(A) polimerase.
A poli-adenilação protege o mRNA da degradação pela extremidade 3’.
A extremidade 5’ já está protegida nesta altura pela “cap”
A extremidade 5’ que fica desprotegida quando se dá a clivagem faz com que, indiretamente, acabe a transcrição: a velocidade de degradação do RNA é superior à velocidade de transcrição por parte da RNA polimerase. Assim, quando essa degradação alcança a RNA polimerase faz com que haja o desmantelamento da mesma, parando a transcrição.
Uma característica comum dos mRNAs de eucariontes superiores (mas não de leveduras) é a presença da sequência altamente conservada AAUAAA na região 11-30 nucleótidos a montante do local de adição de poly(A).
A sequência AAUAAA é o sinal para que ocorra a clivagem, gerando assim a extremidade 3’ de um qualquer mRNA que é em seguida poliadenilado. O fator específico e a endonuclease clivam o RNA a jusante da sequência AAUAAA. O fator específico e a poli(A) polimerase acrescentam 200 Adeninas sucessivas à extremidade 3’
Gerar a estrutura 3’ terminal apropriada requer uma endonuclease (compreendendo os componentes CFI e CFII) para clivar o RNA; poli(A) polimerase (PAP) para sintetizar a cauda de poliadeninas; e um componente específico (CPSF) que reconheça a sequência AAUAAA e dirija outras atividades.
O fator específico (CPSF) é necessário tanto na clivagem como na poli-adenilação.
Reação De Poli-Adenilação
2 etapas
1. Um oligoresíduo de ~10 Adeninas é adicionado à extremidade 3’. Esta primeira reação depende inteiramente da sequência AAUAAA, e a polimerase poli(A) é direcionada com o auxílio do fator específico (CPSF).
2. O oligo de Adeninas é acrescentado até se ter ~200 Adeninas. Essa reação depende de outro fator de estimulação que reconhece a cauda de oligo(A) e direciona a polimerase poli(A) de forma a que ela estenda a extremidade 3’ com Adeninas.
Outra das modificações que ocorre no mRNA é a adição de uma cap 5’:
- Uma cap 5’ é formada ao se adicionar uma Guanina à extremidade 5’ do transcrito por uma ligação 5’-5’. Um a três grupos metil é adicionado à base ou à ribose da nova Guanina terminal por uma Guaniltransferase.
Controlo pós-transcrição
Existência de repressores e enhancers relativamente ao spliceossoma. 
RNA editing
Alterações na informação codificada pelo DNA ocorre em algumas circunstâncias excecionais, especialmente na produção de novas sequências codificantes de imunoglobulinas em mamíferos e aves. Estas mudanças ocorrem especificamente em células somáticas (linfócitos B) nas quais as imunoglobulinas são sintetizadas. A nova informação é gerada no DNA de um individuo durante o processo de reconstrução do gene de uma imunoglobulina; a informação codificada no DNA é alterada por mutações somáticas. A informação no DNA continua a ser fielmente transcrita em RNA.
- Processo em que a informação é alterada ao nível do mRNA. Isto é revelado por situações em que a coding sequence num RNA difere da sequência do DNA do qual foi transcrito.
A edição de RNA pode mudar a informação contida na mensagem de RNA:
· Altera a sequência nucleotídica dos transcritos de RNA e por consequência as mensagens codificadas que eles carregam.
· Pode haver alterações de grelha de leitura e da própria sequência.
· Algumas das edições são: “A-to-I” e “C-to-U” 
Mais de metade dos resíduos de mRNA consistem em uridinas que não são codificadas no gene. A comparação entre o DNA genómico e o mRNA mostra que nenhum trecho com mais do que 7 nucleótidos está representado no mRNA sem alteração; e extensões de uridina até 7 bases de comprimento estão inseridos.
O que fornece a informação para a inserção específica de uridinas?
Um RNA Guia (guide RNA) contem uma sequência que é complementar ao mRNA corretamente editado.
O RNA guia é complementar ao mRNA numa distância significante incluindo e circundando a região editada. O emparelhamento entre o RNA guia e o RNA pré-editado deixa espaços onde resíduos de A não emparelhados no RNA guia não vão encontrar complementaridade no RNA pré-editado. O RNA guia providencia o template que permite que os resíduos U ausentes sejam inseridos nessas posições. Quando a reação é completada, o RNA guia separa-se do mRNA, que se torna disponível para a tradução.
Transporte do RNA do núcleo para o citosol
Os mRNAs são sintetizados no núcleo, mas traduzidos no citoplasma de uma célula eucariota. Este passa para o citoplasma na forma de uma ribonucleoproteína que é transportada através dos poros nucleares. Uma vez no citosol este pode associar-se a ribossomas e ser traduzido.
Pensa-se que a maioria dos mRNAs serão traduzidos em localizações aleatórias, determinadas pelo seu ponto de entrada no citosol e a distância que se possam ter movido deste. Contudo, alguns mRNAs são traduzidos em locais específicos. Isso pode ser realizado por diferentes mecanismos:
· Um mRNA pode ser transportado especificamente para o local onde é traduzido.
· Pode ser universalmente distribuído, mas degradado em todos os locais à exceção do local da tradução.
· Podem ser livremente distribuídos, mas ficarem “presas” no local da tradução.
TRANSPORTE DE PROTEÍNAS
Para que sejam transportadas ao longo dos poros nucleares, uma proteína deve ter sinais especiais na sua sequência:
NLS (Nuclear Localization Signal) - motivo responsávelpor importar proteínas para o núcleo.
NES (Nuclear Export Signal) –sinal necessário e suficiente para as proteínas se moverem do núcleo para o citosol 
Uma proteína pode ter ambos os sinais, NLS e NES. Estes podem funcionar constitutivamente, ou a sua utilização ser regulada, por exemplo, pela sua associação com outras proteínas que escondem ou expõem as sequências relevantes.
Um carrier proteico (ou transportador) leva o substrato através do poro.
- O transportador deve então retornar através da membrana para participar outro ciclo.
- Os transportadores são classificados de acordo com a direção na qual transportam a carga.
· Importinas levam a carga (proteína com NLS) do citoplasma até ao núcleo.
· Exportinas pegam a carga (proteína com NES) no núcleo e libertam no citoplasma.
O fator que suporta a translocação das Importinas e Exportinas tem dois componentes ativos: a Ran (proteínas G monoméricas) e outro envolvido em direcionar a Ran para o poro nuclear.
A direção da importação nuclear é controlada pelo estado da Ran. Tipicamente Ran-GTP está no núcleo, Ran-GDP está no citosol. 
O complexo de exportação está estável na presença de Ran-GTP 
O complexo de importação é estável na presença de Ran-GDP.
UTR’S
Cada molécula de mRNA transporta o código genético para a síntese de um polipéptido específico durante o processo de tradução, além de informação extra como a frequência com que vai ser traduzido, quanto tempo vai sobreviver, e em que local da célula é que será traduzido. Estas informações são carregadas na forma de cis-elements do RNA e proteínas associadas. Muita dessa informação está localizada em partes da sequência do mRNA que não estão diretamente envolvidas na codificação da proteína.
Depois da transcrição ocorre o processamento do RNA. O capping na extremidade 5’ e a adição da cauda de poly(A) na extremidade 3’ têm sobretudo três funções:
· Providencia estabilidade à molécula de mRNA, impedindo a sua degradação por exonucleases;
· Auxilia no transporte do mRNA do núcleo para o citoplasma;
· Induz a ligação do mRNA aos ribossomas para posterior tradução do mesmo.
A cauda de poly(A) está protegida pela Poly(A)-binding proteins (PABPs).
A molécula de mRNA, depois do capping e antes da cauda poly(A), é constituída por UTR’s (Untraslated Regions), que carregam a maioria da informação reguladora não codificante para a proteína.
- Formam estruturas secundárias e terciárias, por emparelhamento intramolecular, que regulam a tradução do mRNA (p.ex.: simples – loops; complexas - emparelhamento de nucleótidos em zonas distantes da molécula). Podem ser estabilizadas por proteínas, impedindo a tradução do mRNA e aumentando o seu tempo de vida.
No caso de ser necessária uma resposta rápida, existem mRNAs inativos no citosol, possível através de modificações nas 5’ e 3’ UTRs.
	- Quando a célula precisa de determinadas proteínas, as regiões UTR serão disponibilizadas e o mRNA será logo traduzido sem ter de passar pela fase de transcrição -> elementos de resposta rápida.
- Quando não é necessário, o mRNA é degradado.
- Estruturas secundárias na região 5’UTR impede o início da transcrição, na 3’UTR impede a degradação do mRNA.
Os RNAs mensageiros são moléculas relativamente instáveis, ao contrário do DNA.
- A ligação fosfodiéster que liga os ribonucleótidos é de certa forma mais fraca que aquela que liga os desoxirribonucleótidos, devido à presença do grupo hidroxilo 2’ na ribose;
– A principal razão é a ação das enzimas que degradam os RNA celulares - Ribonucleases.
As ribonucleases clivam a ligação fosfodiéster que liga os ribonucleótidos do RNA; são moléculas muito diversas pois existem muitos domínios diferentes envolvidos na sua atividade
- Endoribonucleases – clivam uma molécula de RNA num local interno, e podem ter requisito (ou preferência) para determinada estrutura ou sequência;
- Exoribonucleases – removem nucleótidos de um extremo do RNA e têm a polaridade do ataque definida, seja 5’ para 3’ ou 3’ para 5’. Algumas são processivas (vão clivando vários nucleótidos) e outras são distributivas (catalisando a remoção de apenas um ou muito poucos nucleótidos antes de se desassociarem do substrato).
A maioria dos RNAs decai estocasticamente (como a decadência dos isótopos radioativos) e assim a estabilidade o mRNA é geralmente expressa como uma meia-vida.
O termo decadência do mRNA é muitas vezes sinónimo de degradação do mRNA.
A informação acerca da estabilidade do mRNA está codificada na sequência-cis e assim é característica de cada mRNA. A abundância de mRNAs específicos na célula é consequência dos rácios combinados da sua síntese (transcrição e processamento) e degradação.
A grande vantagem de um mRNA instável é o facto de isto permitir modificar rapidamente o output da tradução através da alteração do estado de síntese do RNA. Isto é, se o mRNA é tão facilmente degradável será porventura fácil determinar a quantidade de proteínas modificando a síntese do mRNA porque ele nunca terá uma duração muito elevada e assim não interferirá muito na produção de proteínas por ser muito duradouro.
Precisamente por serem instáveis desde o momento em que os pré-mRNAs são transcritos no núcleo até à sua destruição no citoplasma, os mRNAs eucarióticos encontram-se associados a um reportório variável de proteínas – complexos proteicos denominados RNPs (ribonucleoproteínas).
A maturação nuclear de um mRNA envolve uma série de proteínas com funções durante o processamento do pré-mRNA, no splicing e no controlo de qualidade do mRNA.
O mRNA maturo só é corretamente exportado do núcleo para o citoplasma quando está completamente processado e associado aos complexos proteicos corretos, incluindo TREX (Transcription export) – que medeia a associação do complexo que forma com o mRNA com os recetores do poro nuclear.
Enquanto muitas proteínas nucleares são removidas aquando da exportação do mRNA para fora do núcleo, outras permanecem ligadas pois têm papéis citoplasmáticos.
RNA-binding proteins (RBPs) são muitas e variadas – um conjunto de mRNAs que partilha um particular tipo destas enzimas é chamada do regulão de RNA.
O mRNA eucariótico está protegido da ação das exonucleases pelas suas terminações alteradas:
- A cap 7-metil guanosina que protege a extremidade 5’ do ataque destas enzimas;
- A cauda de poly (A) que, associada com uma série de proteínas, protege a extremidade 3’ de ataque.
Degradação do mRNA
A degradação da maior parte dos mRNAs eucariotas necessitam de um paço inicial de deadenilação - encurtamento da sua cauda de poly (A)
Existem duas vias principais de degradação:
1. Remoção da 5’-cap – A extremidade cap é normalmente resistente ao decapping durante a tradução ativa porque se encontra ligada a um proteína cap-binding citoplasmática (componente do factor de iniciação 4F) - As maquinarias da tradução e do decapping competem pela 5’ cap.
Como é que a deadenilação promove a ação da maquinaria de decapping e não a de tradução?
- A tradução envolve uma interação física entre o complexo PAPB na extremidade 3’ do mRNA e o complexo eIF4F na extremidade 5’ – a libertação do PAPB devido à deanilação destabiliza a interação entre este e o eIF4F e assim entre o eIF4F e a estrutura cap, deixando mais exposta.
O que contribui para a ampla gama de tempos de meia-vida nos mRNAs de uma mesma célula?
- Existe no próprio mRNA elementos-cis que afetam a sua estabilidade – a localização mais comum para estes elementos é em 3’UTR, ainda que existe noutras localizações.
2. Destabilizing Elements (DE’s) – A sua introdução num mRNA estável acelera a degradação desse mRNA, mas a sua remoção não o estabiliza (um mRNA individual deve ter mais que um). A presença de DEs não garante um pequeno tempo de meia vida de um mRNA, em todas as condições, pois há outros elementos da sequência do mRNA que podem alterar a sua eficiência.
a. ARE (Au-Rich Elements) – tipo de DEs encontrados em 3’UTRs de alguns mRNAs de mamíferos. São heterogéneos. Um tipo consiste na sequência pentamérica AUUUA (presente uma ou mais vezes repetidas);	Outrotipo consiste numa predominâncias de sequências ricas em U.
Um grande número de proteínas que se ligam a esta sequência interagem com um ou mais componentes da maquinaria de degradação. Incluindo o exossoma, deadenilases e a enzima de decapping.
- O exossoma pode ligar-se diretamente aos AREs.
- Os AREs de alguns mRNAs aceleram o passo de deadenilação da degradação (mas nem todos têm este papel); recrutamento da CCR4.NOT deadenilase.
- Podem ainda facilitar a ligação do mRNA a corpos de processamento.
Stabilizing Elements (SE’s) – têm sido identificadas a partir de mRNAs estranhamente estáveis.
· Três mRNAs estudados em mamíferos têm sequências estabilizadoras ricas em pirimidinas (C e U) na extremidade 3’; as proteínas ligadas a este elemento no mRNA da globina interagem com a PABP, o que sugere que podem funcionar como protetor da degradação das caudas de poly(A).
· Em alguns casos, um mRNA pode ser estabilizado ao inibir as suas DE’s. Por exemplo, algumas ARE-binding proteins atuam prevenindo que as ARE destabilizem o mRNA, provavelmente bloqueando o local de ligação das ARE.
- Um exemplo da estabilização regulada do mRNA ocorre no mRNA das transferrinas de mamíferos.
Este é estabilizado quando a 3’UTR do IRE (Iron-Response element), que consiste numa série de estruturas em stem-loop, se encontra ligada a uma proteína específica. A afinidade da IRE-binding protein (IRE-BP) para a IRE é alterada pela ligação do Ferro: exibe baixa afinidade quando o local de ligação ao ferro está cheio, e alta afinidade quanto este não está. 
A ferritina é uma proteína que se liga ao ferro e sequestra o excesso de ferro celular. Quando a concentração de ferro na célula é baixa, são necessárias mais transferritinas para importar ferro da corrente sanguínea, e nestas condições o mRNA da transferrina é estabilizado.
A IRE-BP estabiliza o mRNA da transferritina ao inibir a função das sequências desestabilizadoras na vizinhança. Curiosamente, a mesma IRE-BP liga-se ao IRE no mRNA da ferritina e regula esse mRNA de forma distinta. A IRE-BP liga-se aos stem-loops do IRE na UTR-5’ da ferritina quando a concentração de ferro é baixa, e bloqueia a interação do complexo de ligação ao cap com o mRNA da ferritina. Assim, a tradução do mRNA da ferritina é prevenida quando os níveis de ferro na célula são baixos – nestas condições, o mRNA da transferritina é estabilizado e traduzido.
Muitos elementos cis do mRNA, onde as proteínas se poderiam ligar, podem sofrer uma série de alterações, incluindo:
· Fosforilações Que podem ser responsáveis por alterações na taxa de degradação do mRNA induzidas por sinais celulares.
· Metilações
· Isomerizações
Mecanismos de controlo citoplasmático – controlo da poli-adenilação citoplasmática
- CPE (cytoplasmic polyadenilation element) - sequência encontrada na 3’UTR de alguns mRNAs (p.ex. durante o desenvolvimento embrionário). A ligação de uma CPE-binding protein a esta região promove a extensão da cauda de poly(A) e em geral ativa o mRNA para a tradução.
- A sequência AAUAAA é também necessária para a poli-adenilação citoplasmática.
- A degradação do mRNA pode estar associada à regulação génica ou ao controlo de qualidade dos mesmos.
Controlo De Qualidade
Todos os RNAs sintetizados são submetidos a um conjunto de passos de processamento após serem transcritos.
Enquanto os erros no DNA podem ser reparados por sistemas de reparação, erros detetados no RNA implicam destruição do RNA defetivo. Os mecanismos de RNA surveillance existem quer no núcleo quer no citoplasma e lidam com diferentes tipos de problemas.
Esta vigia do RNA envolve dois tipos de atividades:
- Identificar e marcar o RNA aberrante;
- Destruir esse mesmo RNA.
No núcleo
O pré-mRNA aberrante é destruído no exossoma nuclear (semelhante ao exossoma citoplasmático, no entanto interage com cofatores proteicos diferentes). O exossoma remove nucleótidos dos RNA alvo através de uma atividade exonuclear de 3’ para 5’.
· Rat1p – exonuclease 5’-3’ responsável pela degradação do pré-mRNA nuclear; causa a terminação da transcrição pela RNA polimerase II.
No citoplasma
Alguns tipos de defeito no mRNA podem ser detetados somente durante a tradução. Os mecanismos de vigilância detetam 3 tipos de defeitos no mRNA que afetam a fidelidade da transcrição e marcam os mRNA defeituosos para terminação da tradução e destruição.
· Nonsense-mediated Decay (NMD) – tem como alvo mRNAs que contenham codões de terminação prematuros (PTC), gerados por mutações nonsense.
- Genes sem mutações podem originar transcritos aberrantes com PTC por erros da RNA polimerase ou por splicing incompleto, incorreto ou alternativo. Se a sua tradução ocorresse, daria origem a polipéptidos com o C-terminal incompleto, que são considerados particularmente tóxicos para a célula.
- O reconhecimento de mRNAs com PCT requere a tradução e um conjunto de fatores proteicos conservados. Estes incluem três proteínas Upf (atuam primeiro); a ligação deste fator marca o mRNA para destruição - os mRNAs são degradados 3’ 5’ ou 5’ 3’.
Como é que os PCTs são distinguidos dos codões de terminação normais?
- Nos mamíferos um PCT é diferenciado pela presença de uma splice junction, marcada por um EJC (exon junction complex) a jusante do codão de terminação prematuro.
- Após o splicing, um complexo de proteínas (EJC) liga-se aproximadamente 24 nucleótidos a jusante da fronteira exão-exão. Antes da tradução, os EJC são removidos. Se existir um EJC 50-55 nt depois do codão STOP, esse codão STOP é prematuro e ocorre NMD. 
· Non-stop Decay (NSD) – tem como alvo mRNAs que não têm um codão de terminação; essa falha na terminação resulta na tradução da cauda de poly (A).
- Estes transcritos podem ser originados por uma terminação prematura da transcrição ou por uma poli-adenilação prematura no núcleo.
- A marcação dos substratos non-stop envolve um conjunto de fatores denominados proteínas SKI. O ribossoma liberta-se do mRNA por ação deste fatores, que simultaneamente recrutam para degradação o exossoma (3’ 5’) e o decapping (5’ 3’).
· No-go Decay (NGD) – tem como alvo mRNAs com ribossomas parados numa região codificante; essa paragem, transitória ou prolongada, pode ser causada por características naturais de alguns mRNAs, incluindo estruturas secundárias fortes ou codões pouco frequentes (tRNAs correspondentes existem em baixa abundância).
- Marcar o mRNA envolve o recrutamento de duas proteínas – Dom34 e hbs1. A degradação do mRNA inicia com um corte endonucleólitico e a digestão dos fragmentos pelo exossoma e Xrn1.
Tradução: RNA-Proteína
A iniciação da tradução, no citoplasma eucariota, assemelha-se ao processo que ocorre em bactérias, mas a ordem dos eventos é diferente e o número de fatores acessórios é maior. Nos eucariontes, a subunidade pequena do ribossoma reconhece a extremidade 5’ do mRNA e depois move-se para o local de iniciação, onde a esta se junta a subunidade maior.
A primeira característica a ser reconhecida num mRNA eucariota é o cap metilado que marca a extremidade 5’
- Os mRNAs cujo cap tenha sido removido, não são traduzidos eficientemente in vivo.
Nem sempre o local de iniciação está livre, pois muitas vezes a acessibilidade é comprometida por estruturas secundárias. O reconhecimento do mRNA requer um grande conjunto de fatores adicionais, alguns capazes de remover qualquer estrutura secundária no mRNA.
A iniciação da tradução nos eucariotas utiliza um AUG como codão de iniciação; o tRNA iniciador (Met-tRNAi) é de um tipo distinto, mas a metionina não está formilhada (como nos procariontes). É importante que a metionina correspondente ao AUG seja modificada para ser carregada na zona peptidil do ribossoma! 
As células eucariotas têm bastantes fatores de iniciação (o “e” no nome está associado à sua origem eucariota).
Estes fatores atuam em todos os estados do processo, incluindo:
· Formar um complexo de iniciação com a extremidade 5’ do mRNA;
· Formar um complexo com o Met-tRNAi;
· Ligar o complexo fator-mRNA com o complexo fator-Met-tRNAi;
· Permitir que o ribossoma verifiquedesde a extremidade 5’ até ao primeiro AUG;
· Detetar a ligação do tRNA iniciador ao AUG no local de iniciação;
· Mediar a ligação da subunidade maior.
Complexo de Iniciação à Tradução
Inicialmente forma-se o complexo de pré-iniciação 43S através da ligação da eIF2, Met-tRNAi, eIF3, eIFI, e eIFIA à subunidade 40S do ribossoma.
	- Independente da presença de mRNA. A eIF3 é necessária para manter a subunidade 40S dissociada. eIFI e eIFIA aumenta a atividade de dissociação de eIF3.
O complexo Cap binding é formado pela eIF4A, eIF4B, eIF4E, e eIF4G que se ligam à extremidade 5’ do mRNA. Este complexo associa-se com a extremidade 3’ através da eIF4G, que vai interagir com a PABP (polyA-binding protein).
O complexo 43S liga os fatores de iniciação à extremidade 5’, e procura pelo codão de iniciação, formando o complexo 48S nesse local.
A interação entre o cap 5’ e a cauda Poly(A) dos mRNA, pela associação de proteínas específicas (complexo elF4F), promove uma dobra no mRNA que estimula o início da tradução. A interação PABP/eIF4G no mRNA promove o recrutamento do complexo 43S.
A subunidade eIF2 é o fator chave na ligação Met-tRNAi. É uma proteína heterotrímerica que se ativa quando ligada a GTP. O produto é chamado de complexo ternário (eIF2, GTP e Met-tRNAi). Este complexo é regulado por GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor), que transforma GDP em GTP, para depois este último ser hidrolisado pela eIF2 (GTPase).
Controlo de Qualidade
O ribossoma verifica se não há nenhum problema como:
· Formação de estruturas secundárias/terciárias que não foram resolvidas;
· Proteínas que não se desligaram durante o splicing, normalmente nos locais de junção exão-exão, na cauda Poly(A) ou no cap.
- Requer ATP, que é hidrolisado pelos fatores de transcrição. Se estiver tudo correto para o início da tradução, o complexo 43S para no códão de iniciação, onde o tRNA iniciador emparelha com AUG, formando um complexo estável, 48S.
REGULAÇÃO POR INTERFERÊNCIA DE RNA
Em muitos casos, transcritos antisense participam na regulação de genes.
RNA interferência (iRNA) - segunda via de regulação génica e estrutura da cromatina dependente de RNA. Em interações intermoleculares, um RNA regulador reconhece o seu alvo pelo princípio de base do emparelhamento por complementaridade de bases.
- Quase sempre um RNA mensageiro que regula a expressão génica de mRNAs. Consiste num mecanismo molecular, conservado, que faz uso de fragmentos de dsRNA para a identificação de mRNAs para eliminação. Este mecanismo reprime a expressão génica, geralmente (mas não sempre) ao nível da tradução. Alguns afetam também a iniciação da transcrição ligando-se ao promotor do gene.
Constituído essencialmente por dois tipos de pequenos RNAs:
· Pequenos RNAs ou microRNAs (miRNAs) – com aproximadamente 22 bases, são reguladores da expressão genética encontrados na maioria, se não em todos, os eucariotas.
Metade é codificada por intrões de genes codificantes, a outra metade a partir de grandes RNAs não codificantes (ncRNAs) e existem ainda alguns que podem ser originados a partir de pseudogenes – supostamente regiões tipo gene que se pensava que não possuíam qualquer função.
Cada miRNA pode possuir centenas de mRNAs alvo e um dado mRNA pode ser alvo de múltiplos miRNAs.
Small Inteference RNA (siRNA) - um miRNA que evita a expressão génica – há sempre a destruição
- É tipicamente produzido durante infeções virais e assim ocorre naturalmente em:
· Transposões
· Vírus (dsRNA)
· Transcrição bidirecional de sequências repetitivas
· Genes
Formação de iRNA
Estes RNAs têm múltiplas origens e múltiplos mecanismos de síntese e processamento, mas a maioria é produzido como um percursor maior de RNAs que é processado e clivado para o tamanho correto.
Em organismos simples há silenciamento de transposões, DNA viral, etc., realizada pela RNA Polimerase. -> Poderá haver iRNAs em todos os organismos.
miRNA
Os miRNAs que são usados em iRNA são produzidos como grande transcritos primários de RNA, chamados de pri-miRNA que são self-complementary e podem automaticamente “dobrar-se” num estrutura em hairpin de dupla cadeia, geralmente com um emparelhamento imperfeito entre as bases.
Este pri-miRNA é processado através de uma reação com dois passos: 
1. Redução do pri-miRNA a pré-miRNA, que também possui uma estrutura em hairpin, com um grupo fosfato na extremidade 5’. É catalisado pela Drosha, uma endonuclease no núcleo.
2. Após a exportação do núcleo para o citoplasma, há conversão de pré-miRNA em miRNA. Catalisado pela endonuclease Dicer (também membro da família Rnase III). Esta produz pequenos segmentos de aproximadamente 22bp de dsRNA, que possuem uma extremidade 3’ de 2 nucleótidos em ssRNA (onde é geralmente adicionado um grupo metilo para estabilidade).
Estes pequenos fragmentos dsRNA são “carregados” num complexo chamado RISC (RNA-induced silencing complex), constituindo por proteínas da família Argonauta, que são essenciais para o processamento final em molécula de ssRNA por eliminação da cadeia “passageira”. Posteriormente o RISC (geralmente) guia e liberta o miRNA à 3’UTR do mRNA alvo; de acordo com o nível de complementaridade com o mRNA ocorre a destruição ou o silenciamento da tradução.
siRNA
Possuem uma origem diferente. São “entregues” através de infeções virais, que tipicamente transcrevem ambas as cadeias do seu genoma para produzir dsRNAs completares. São também originados a partir de transposões e são utilizados para os silenciar.
1. dsRNA de grandes dimensões (originados a partir do genoma do vírus) são processados pela Dicer em moléculas similares ao ds-miRNA.
2. Essas moléculas similares são “carregadas” na RISC; siRNAS utilizam uma família diferente de proteínas Argonautas e, assim, um RISC diferente.
3. O RNA alvo destes é marcado para destruição – silenciamento.
Assim, pode dizer-se que siRNA derivam do miRNA. 
Os siRNAS têm a capacidade de se espalhar de célula para célula dentro do organismo.
Funcionamento do iRNA
Quando um iRNA se liga ao mRNA, vai desencadear um de dois mecanismos (geralmente):
· Degradação do mRNA (porque não é suposto a célula ter dsRNA);
· Silenciamento (para a tradução desse mRNA); depois, pode levar na mesma à degradação.
A escolha entre eles é primeiramente determinada pelo nível de emparelhamento de bases entre o miRNA/siRNA e o mRNA.
· Quanto maior o grau de emparelhamento, mais provável é que o mRNA alvo seja degradado.
· O RISC usa o miRNA como guia para fazer o scan dos RNAs, procurando pequenos locais de homologia - estas regiões são geralmente encontras em zonas ricas em AU na 3’UTR dos mRNAs. Um único mRNA pode possuir locais alvos múltiplos e dessa forma responder a diferente miRNAs sob diferentes condições.
· O local mais importante de ligação é a sequência semente – entre 2 e 8 nucleótidos na extremidade 5’ do miRNA.
Silenciamento de siRNA e miRNA – RNA-RNA pairing
RdDM (RNA-directed DNA methylation)
iRNA mediated heterochromatin formationQuatro exceções ao mecanismo de interferência de RNA
DNA elimination
Meiotic silecnig
RdDM
O dsRNA tem como alvo regiões que serão de novo metiladas e que dependem de RNA para esse mesmo efeito.
Os iRNAs cobrem o cromossoma indicando que este tem de ser silenciado.
iRNA mediated heterochromatin formation
A partir do dsRNA é originado o siRNA que promove a metilação na histona H3K9 o que provoca que provoca a heterocromatização dessa sequência de DNA. 
RDRP – RNA-dependent RNA polymerase
P.ex. inativação do cromossoma X – um conjunto de iRNA interferem na ativação da heterocromatina e no estado de metilação da cromatina, levando ao empacotamento e silenciamento do cromossoma.
Este é um exemplo de sistema de interferência em que o alvo é o DNA genómico. 
DNA Elimination
Deleções de frações de DNA modulados por iRNA. Formação de scnRNA (scanRNA) a a partir da DICER que é exportado para outas células e ocorre a eliminação de regiões de heterocromatina complementares. 
Meiotic Silencing
Moléculas de RNA silenciam partes do genoma durante a meiose.
Acontece em protozoários e outros– ciclo de vida haploide e diploide.
Nos protozoários há perda de material regulada por iRNA.
A RNA Polimerase II transcreve a grande maioria de RNAs de interferência. Estes RNAs são rapidamente processados, removendo os seus constituintes que sinalizam a presença de um mRNA - 5’cap e cauda Poly(A). 
Quando um miRNA hibrida com um mRNA, como forma um RNA de cadeia dupla, é um sinal para a célula que é necessário destrui-lo. 
Há iRNAs que silenciam outros iRNAs. miRNAs são libertados em vesículas, com toda a maquinaria necessária ao processamento do iRNA, para comunicar com outras células -> comunicação celular.
O pré-miRNA forma hairpins, sendo posteriormente clivado. Pode formar diferentes tipos de hairpins e, portanto, é processado de maneiras também diferentes -> vários miRNA (podem-se ligar a mais locais num só RNA, aumentando o silenciamento).
Quando o pré-miRNA sai para o citoplasma, é clivado por RNAses (DICER) formando um miRNA duplex (dsRNA). A cadeia sense é então destruída para poder hibridar com o mRNA de forma a silenciá-lo.
Aquando do processamento do mRNA, no splicing, o intrão pode ter um papel de iRNA -> mitrons. Neste caso, os intrões têm de sofrer debranching para poderem formar os hairpins.
Aparentemente, estas iRNA têm maior probabilidade de silenciarem as moléculas de mRNA que lhes deram origem.
Mecanismos de inibição da tradução
· Mecanismos de iniciação – miRNAs interferem num passo inicial da tradução antes da elongação
· Competição pela estrutura cap – as proteínas argonautas competem com eIF4E
· Inibição da ligação das subunidades ribossomais – As proteínas argonautas recrutam eIF6, que impede que a grande subunidade do ribossoma se ligue à pequena.
· Inibição da circularização do mRNA através de deanilação – as proteínas argonautas impedem a formação do closed-loop através de deanilação.
Mecanismos de pós-iniciação
· Inibição da elongação da tradução ou promovendo a dissociação prematura do ribossoma
· Co tradução e degradação proteica – este modelo propõe que a tradução não é inibida, mas as proteínas recém-formadas estão a ser degradadas simultaneamente com essa tradução
Mecanismos de Degradação do RNA
· MicroRNA mediated decay – os miRNAs desencadeiam a deanilação e subsequentemente o decapping do mRNA alvo.
O RNAi tornou-se uma técnica poderosa para remover a expressão de um determinado gene em invertebrados. Desta forma permite o estudo da expressão génica nestes mesmos organismos.
O local mais eficiente para se ligar o iRNA é nas UTR’s, pois são indispensáveis para a tradução. Contudo, é pouco específico, pois está presente em quase todos os mRNAs. Tem de haver (também) ligação em locais específicos.
Ciclo Celular
O período entre duas divisões mitóticas define o ciclo celular somático.
O tempo entre o fim de uma mitose e o início da seguinte é designado interfase.
O período da divisão, correspondente à mitose, é designado fase M.
- Para que ocorra divisão, a célula somática eucariótica tem de duplicar a sua massa, e dividir os seus componentes de igual modo pelas duas células filhas. A duplicação do tamanho é um processo contínuo, resultante da transcrição e tradução dos genes que codificam as proteínas constituintes de um fenótipo particular. Pelo contrário, a reprodução do genoma ocorre apenas durante um período específico da síntese do DNA. A mitose de células somáticas gera duas células filhas idênticas e diploides.
A interfase está dividida em vários períodos:
· Fase G1 – Síntese de RNAs e proteínas; não há replicação do DNA.
(O início da replicação marca a transição da fase G1 para a fase S)
· Fase S – O conteúdo total de DNA aumenta do valor diploide 2n para o valor total replicado An. É nesta fase que se verifica um aumento do tamanho do núcleo. A sua duração é determinada pelo tempo que é necessário para replicar todo o genoma.
· Fase G2 – Período desde o fim da fase S até à mitose. A célula tem dois conjuntos diploides de cromossomas. Geralmente, esta é a fase mais curta da interfase e compreende as preparações para a fase seguinte.
A síntese de RNA e proteínas ocorre continuamente, mas a síntese de DNA ocorre somente na fase discreta S – assim o núcleo aumenta de tamanho somente na fase S, quando as proteínas se acumulam para colmatar o aumento de DNA. A cromatina permanece uma massa compacta em que nenhuma mudança de estado é visível.
G0 – estado de noncycling – alguns tipos de células podem ser estimulados a deixar G0 e iniciar a divisão celular, outros não deixaram este estado
A mitose segrega um conjunto diplóide de cromossomas para cada célula filha. Cromossomas individuais começam a ser observados somente durante este período, quando o invólucro nuclear se dissolve e a célula se reorganiza. Virtualmente todas as atividades sintéticas da célula param durante a mitose.
· Prófase, Metáfase, Anáfase, Telófase e Citocinese (não faz parte da mitose, mas faz parte da divisão celular).
Exceções a este tipo de ciclo celular poderão ser resultantes da endoreplicação/endoreduplicação – duplicação do DNA (na fase S) sem que ocorra a mitose completa. Por outras palavras, replicação do genoma nuclear na ausência de divisão celular completa.
- Replicação do DNA sem que ocorra a formação do núcleo durante a telófase (iniciu ou não a mitose, mas não conclui) – existindo assim:
· Cromossomas politénicos (cromossomas gigantes) que se mantêm juntos (não se inicia a mitose sequer)
· Poliploidia de cromossomas individuais (não ocorre a mitose completa)
· Variantes intermédias entre estes dois estados
- Isto é células em que existem cromossomas >2n – células naturalmente poliplóides (hepatócitos maturos ou células mãe das plaquetas – trofoblastos ou megacariócitos – ocorreu 7 vezes a fazes S).
- Replicação do DNA onde ocorre mitose, mas não se verifica citocinese
· Resultam células polinucleadas – isto é, células com n núcleos (células embrionárias).
A progressão do Ciclo Celular depende de pontos de Controlo Discretos
A regulação do ciclo celular envolve:
- A deteção e reparação do material genético danificado
- A prevenção da divisão descontrolada.
Os eventos moleculares que controlam o ciclo celular são ordenados, direcionais e sequenciais, sendo assim impossível “reverter” o ciclo.
Existem essencialmente dois pontos de controlo nos quais a decisão de prosseguir ou não com outro ciclo celular pode ser tomada:
- Compromisso à replicação cromossomal – ocorre na fase G1 – este ponto é chamado em leveduras de START, e em animais de ponto de restrição – se as condições para passar este ponto forem satisfeitas, ocorre um pequeno lag e a célula entra em fase S.
Este é o maior momento de controlo do ciclo celular – já que quase todo o ciclo é controlado pela quantidade, qualidade e integridade do DNA. Para uma célula que prossegue ao longo de G1, o START ou ponto de restrição marca o ponto em que a célula faz a decisão (mais importante do ciclo) de prosseguir a divisão ou não. Variados parâmetros influenciam a capacidade de uma célula de tomar esta decisão:
· Resposta a estímulos externos (como por exemplo a disponibilidade de nutrientes).
· Avaliação se de facto a massa celular é suficiente para suportar a divisão celular.
- Compromisso à divisão mitótica – ocorre no final da fase G2 (é o ponto de controlo auxiliar) – o início desta fase é identificado pelo momento no qual a célula inicia a sua reorganização para a divisão – se a célula não se dividir neste ponto (não respeita as condições necessárias – não prossegue para mitose) pode ficar na mesma com o dobro (ou mais) da quantidade de cromossomas – como referido em alguns casos da endoreplicação.
Existem também os checkpoints que fazem o controlo da qualidade pós-processo, ou seja, verificam se este foi total e corretamente acabado para que a célula possa prosseguir no ciclo celular.
- Existem em pontos críticos do ciclo. Cada checkpoint representa um loop de controlo que faz com que a iniciação de um dado evento no ciclo celular dependa da realização com sucesso de um evento que tenha ocorrido previamente. Um checkpointfunciona através da atuação direta nos fatores que controlam a progressão do ciclo celular.
Checkpoints
Fase G1 – avaliar a presença ou não de danos no D NA.
Fase S
· Impedir a replicação de continuar no caso de existirem problemas com a integridade do DNA.
· Garantir que todo o DNA foi replicado.
Fase G2
· Avaliar a presença ou não de danos no DNA.
· Verificar se a replicação foi incompleta.
Mitose
· A célula não inicie a divisão a menos que todos os passos anteriores necessários a este ponto tenham ocorrido.
· Também são os checkpoints desta fase que confirmam se a mitose terá sido bem-sucedida antes que a célula prossiga pelo STAR e inicie novo ciclo celular.
Existe uma relação entre o ciclo celular e a base molecular para a regulação dos eventos cíclicos que controlam a transição entre as diversas fases.
Alguns destes eventos requerem a síntese de novas proteínas ou a degradação de outras já existentes, outros ocorrem através da ativação e desativação reversível de certos componentes pré-existentes, etc.
São necessárias pelo menos 3 atividades moleculares para que ocorra este controlo/transição entre as fases – todos eles são controlados por fosforilação:
· Durante a G1, a célula passa o START/ponto de restrição e assim inicia um ciclo de divisão. O evento chave é a fosforilação. As proteínas alvo desta fosforilação são chamadas RB.
- As RB não fosforiladas reprimem a transcrição de genes que são necessários para que o ciclo celular avance. Esta repressão acaba quando a RB é fosforilada.
· O período da fase S é marcado pela presença do ativador da fase S – que é uma proteína cinase.
· A mitose é depende da ativação de uma proteína pré-existente a Cinase da fase M, que possui duas subunidades.
O MPF foi inicialmente identificado como um fator que induz a fase G2 dos oócitos a entrar na meiose. Contudo, este mesmo fator é também responsável por induzir as células somáticas a entrar na mitose. O fator promotor de maturação e o fator promotor da fase M são ambos manifestações da cinase de fase M.
Esta cinase consegue fosforilar uma grande variedade de substratos proteicos: por fosforilação de proteínas alvo em pontos específicos do ciclo celular, o MPF controla a sua capacidade de funcionamento.
Subunidades da cinase de fase M:
· Cdc2 – subunidade catalítica que fosforila os resíduos de serina e treonina em proteínas alvo. Por si só é inativa, e só é ativada quando associada com uma ciclina que induz alterações na conformação da Cdc2durante a fase M. 
· Ciclina – subunidade regulatória que é necessária para a cinase funcionar com os substratos apropriados. Acumula-se durante a interfase é destruída na mitose. Existem dois tipos gerais de ciclinas mitóticas (A e B), pelo que pode haver cinases de fase M do tipo Cdc2-ciclina A ou Cdc2-ciclina B.
Os eventos que ativam a cinase de fase M em G2/M e a inativam em M identificam pontos cruciais no ciclo celular. Para que a cinase esteja ativa, os grupos fosfato têm de estar ausentes em determinadas posições, mas presentes noutras.
· Dois resíduos localizados dentro do local de ligação ao ATP da Cdc2 têm de ser desfosforilados para ativar a cinase.
· Os fosfatos estão localizados nos resíduos Thr-14 e Tyr-15
· A fosforilação na Thr-161 é necessária para a atividade da Cdc2 (este fosfato é adicionado em G2 e removido no fim da mitose).
· São removidos os Fosfatos em Thr-14 e Tyr-15 pela mesma fosfatase (especificidade dual).
A cinase da fase M é autocatalítica, pelo que a ativação de uma pequena porção da cinase é suficiente para ativar o resto.
A ciclina A e B possuem um pequeno motivo próximo do N-terminal que as torna um alvo para a proteólise que ocorre no proteossoma. 
O circuito regulatório do ciclo celular consiste numa série de cinases e fosfatases que respondem a sinais externos e checkpoints através da fosforilação e desfosforilação do membro seguinte do circuito. O seu objetivo será determinar a atividade da Cinase da fase M ou da cinase da fase S através do controlo do seu estado de fosforilação.
A transição entre os diversos pontos de regulação do ciclo celular toma a forma de ativação/desativação de cinases, que modificam os substratos que determinam o estado físico da célula. Os checkpoints podem retardar a transição de uma fase para a seguinte até que alguma condição intrínseca ou extrínseca seja satisfeita.
Um dos melhores substratos para a cinase de fase M é a histona H1.
- A histona H1 é fosforilada durante o ciclo celular, com dois grupos fosfato adicionados durante a fase S, e 4 grupos fosfato adicionados na mitose. A principal atividade de cinase da H1 da célula é providenciada pela cinase de fase M.
O ciclo celular animal é controlado por muitos complexos cdk-ciclina
- No controlo a progressão para a fase seguinte do mesmo é controlada por uma cinase que consiste numa subunidade catalítica e um parceiro regulador (ciclina).
Ciclinas
- Proteínas que acumulam continuamente ao longo do ciclo celular e são destruídas por proteólise durante a mitose.
· Ciclinas da fase G1 (ciclina D): a sua síntese é ativada quando os fatores de crescimento estimulam as células a reentrar no ciclo a partir do G0. Têm um tempo de vida curto, e os seus níveis decrescem rapidamente quando os fatores de crescimento são removidos. A perda de ciclinas D pode fazer com que a célula deixe o ciclo celular e vá para a fase G0.
· Ciclinas da fase S (ciclinas E e A): a atividade do complexo cdk2-ciclina E é necessária para entrar na fase S. A ciclina E tem papel único. A progressão da fase S requere a ação do complexo cdk2-ciclina A.
· Ciclinas da fase M – mitose (ciclinas B e A): A ciclina A é também necessária para se associar à Cdc2, permitindo a entrada na mitose.
Os níveis destas ciclinas da célula variam de acordo com a fase em que esta se encontra.
Cinase dependente de Ciclina (Cdk)
– Família de cinases que está desativada a não ser que esteja ligada a uma ciclina. A maioria destas moléculas participa de alguma forma no controlo do ciclo celular.
· Cdk da fase G1 (Cdk4)
· Cdk da fase S (Cdk2)
· Cdk da fase M – mitose (Cdk1)
- Os níveis destas proteínas (Cdk) na célula são aproximadamente contantes
- Para se ativar, cada Cdk associa-se a uma ciclina especifica – pelo menos da mesma família, quando não é única – há que ter em conta que o nível de ciclinas varia de acordo com a fase do ciclo celular em que a célula se encontra.
Assim, são as flutuações dos níveis de ciclinas controlam a ativação/desativação dos complexos cdk-ciclina e assim, a progressão de uma célula ao longo do ciclo celular.
Os dímeros cdk/ciclina têm o mesmo tipo de atividade cinase que os dímeros Cdc2-ciclina.
O timing da atividade das várias formas de cdk- e Cdc2-ciclina durante o ciclo celular animal sugere um modelo em que os dímeros cdk2-ciclina G1 funcionam regulando a progressão para a fase G1 e S, enquanto os dímeros Cdc2-ciclina A, B regulam a passagem para a mitose.
Ventos Regulatórios Na Mitose Das Células Animais
- Semelhantes aos das células de leveduras.
- A célula deixa mitose com monómeros de Cdc2 (sem ciclinas mitóticas pois são degradadas durante a mitose). As ciclinas são depois resintetizadas. Depois de um período lag, o seu nível atinge um limiar em que formam dímeros com a Cdc2. Contudo, isto não ativa a atividade de cinase (falta a fosforilação).
- O fosfato que é necessário na Thr-161 é adicionado pela CAK (Cdc2-activating kinase). A atividade da CAK é provavelmente constitutiva.
- A Wee1 fosforila a Tyr-15 para que a cinase de fase M se mantenha na forma inativa.
- A fosfatase Cdc25 remove o fosfato da Tyr-15 - A Cdc25 é ela própria ativada pela fosforilação - A cinase de fase M pode realizar esta fosforilação, criando um loop de feedback positivo. A remoção do fosfato da Tyr-15 permite começar a mitose.
A RB (retinoblatoma susceptibility protein) é o principal substrato dos complexos cdk-ciclina
Um importante conhecimento sobre o controlo do ciclo celular em G1 foi providenciado pela identificação de genes supressores de tumores que codificam para produtos queinteratuam com os complexos cdk-ciclina.
O supressor de tumor RB é o componente chave no controlo do ciclo celular.
RB
RB é substrato para os complexos cdk-ciclina D, e exerce os seus efeitos durante a parte da G1 que precede ao ponto de restrição.
Nas células quiescentes ou durante a primeira parte da G1, o RB encontra-se ligado ao fator de transcrição E2F. Isto tem dois efeitos:
- Alguns genes cujos produtos são essenciais para a fase S dependem da atividade do E2F (sequestrando o E2F, o RB garante que a fase S não se inicia); 
- O complexo E2F-RB reprime a transcrição de outros genes (isto talvez seja o efeito principal nas capacidade de o RB deter as células na fase G1).
O RB pode exercer a sua função repressiva através da interação com a cromatina. Liga-se às histonas deacetiladas, levantando a possibilidade de a sua ação provocar a remoção dos grupos acetilo das histonas nos promotores alvo, inativando-os. Além disso, o RB também interatua com componentes do complexo de remodelação da cromatina.
O RB não fosforilado pode complexar-se com as cdk-ciclina. No ponto de restrição ou próximo dele, o RB é fosforilado pela cdk4,6-ciclina D.
- Essa fosforilação faz com que o RB se liberte do E2F, que depois ativa a transcrição dos genes cujas funções são necessárias para a fase S (ex.: ciclinas E, ciclinas A, DNA polimerase, cinase da timidina). A expressão do E2F em células quiescentes torna-as capazes de sintetizar DNA.
- O único papel da ciclina D1 pode ser inativar o RB e permitir a entrada na fase S. Uma sobreexpressão da D1 faz com que as células entrem na fase S mais cedo.
Ciclina D
- É a primeira a ser produzida no ciclo celular, em resposta a fatores extracelulares (por exemplo: fatores de crescimento).
Mecanismos Gerais da interação cdk-ciclina
Após receberem um sinal pró-mitótico extracelular:
· Ativação dos complexos cdk-ciclinas G1 para preparar a fase S:
- Promovendo a expressão de fatores de transcrição que promovem a expressão de ciclinas da fase S e de enzimas necessárias à replicação do DNA
- Estes complexos promovem a degradação de moléculas inibidoras da fase S, marcando-os para Ubiquitinação – torna-se alvo do proteossoma que promoverá a sua degradação proteolítica.
· Ativação dos complexos cdk-ciclinas da fase S
- Promovem a fosforilação de proteínas que constituem complexos de pré-replicação que são montados durante a fase G1 nas origens da replicação do DNA. Esta fosforilação serve dois propósitos:
· Ativar cada um dos complexos de pré-replicação já montados.
· Impedir a formação de novos complexos (toda a porção do genoma é replicada uma só vez).
Ciclina E 
- Liga-se à cinase constitutivamente expressa na célula, formando o complexo cdk-ciclina E, que faz com que a célula passe de G1 para a fase S.
Durante a progressão da fase S ocorre a formação do complexo cdk2-ciclina A (S-phase promoting factor (SPF) ) que entra no núcleo (e centrossoma) para a replicação.
· Ativação dos complexos cdk-ciclinas mitóticas (estes complexos são sintetizados mas estão inativos durante a fase S e G2)
- Promovem a iniciação da mitose estimulando proteínas downstream envolvidas na condensação da cromatina e na formação do spindle mitótico.
- Ativação do complexo APC (anaphase-prmoting complex), que promove a degradação de proteínas que impedem a realização da anáfase e de ciclinas, assegurando que a telófase e a citocinese podem prosseguir.
Após a replicação ocorre a destruição da ciclina E, e um aumento das ciclinas mitóticas, durante a fase G2.
Cdk1- Ciclina A
- Formado durante a Fase G2, promove a passagem da célula de fase G2 para a mitose
- A ciclina A permanece associada com a cdk1 até tarde na fase G2, onde posteriormente é substituída pela ciclina B. Após a ciclina B ser ativada, a ciclina A é marcada para degradação por Ubiquitinação.
M-Phase promoting factor
- Complexo que inclui ciclinas mitóticas A ou B e a cinase da fase M (Cdc2 em leveduras, cdk1 em outros eucariotas – cinase serina/treonina).
O complexo cdk1 - ciclina B é essencial na:
· Condensação dos cromossomas, visto que afeta a H1
· Formação do spindle mitótico
· Desagregação do invólucro nuclear – visto que a fosforilação das laminas A, B e C leva a despolimerização da lamina nuclear
· Fragmentação do complexo de Golgi e do reticulo endoplasmático.
A degradação de certas ciclinas (e outras proteínas) é essencial à progressão da fase M:
· Primeiro ocorre a degradação da ciclina A na metáfase.
· A separação dos cromossomas na anáfase requere a atividade de um sistema proteassomal que degrade proteínas (mas não de ciclinas). O alvo é a proteína Pds1p cuja degradação despoleta a via que permite a separação dos cromatídeos irmãos.
· Durante a anáfase, as ciclinas B são degradadas para inativar a cinase de fase M, que permite o fim da mitose – é necessário reverter a fosforilação do substrato catalisada pela cinase da face M (cdk1) –ou seja ocorre a “desmontagem” do MFP quando o APC poliubiquitina a ciclina B, marcando-a para destruição. O APC torna-se ativo especificamente na mitose.
O M-phase promoting factor promove a ativação do APC/C (também chamado ciclossoma) – este complexo é uma ubiquitina ligase, que marca como alvo proteínas do ciclo celular para degradação pelo proteossoma 26S – é responsável por:
· Desencadear a destruição de coesinas (permite a segregação dos cromatídeos irmãos)
· Desencadear a degradação da ciclina mitótica B por Ubiquitinação
· Desencadear a degradação dos Geminin (prevenindo a duplicação do DNA duplicado)
· Desencadear a síntese de G1 para o próximo ciclo celular (a divisão celular das células filhas é controlada pelas células mãe)
A maior parte das ciclinas são degradadas por Ubiquitinação.
- A degradação cíclica das ciclinas nos animais só se verifica com as ciclinas mitóticas (A e B, e também com a ciclina e). Assim a ciclina D não é regulada por degradação.
Algumas cdk quando estão fosforiladas estão inibidas e assim não exercem a sua função – por exemplo, a cdk1 está inativa quando fosforilada, durante a fase S e G2, e só se ativa por ação de cinases que removem o fosfato. Isto acontece com a M phase kinase, que para estar ativa necessita de estar fosforilada em dois resíduos e desfosforilada num outro.
O DNA Danificado Despoleta Checkpoints:
As células possuem vias para responder ao DNA danificado, e são extremamente sensíveis ao DNA em cadeia dupla que contém quebras.
Um complexo de proteínas liga-se ao DNA danificado, despoletando as vias de sinal.
- Bloqueio do ciclo celular, que permite ter tempo não só para ativar os genes de resposta como para reparar o dano.
- Desencadear a morte das células (que previne a ocorrência de mutações nos locais danificados) por apoptose.
Os checkpoints que respondem aos DNA danificado encontram-se em todos os estágios do ciclo celular, e geralmente envolvem três grupos de proteínas:
· Sensor proteins – reconhecem os eventos que despoletam a via. No caso do checkpoint que responde ao DNA danificado, elas ligam-se ao DNA no local do dano.
· Tranducer protein – são ativadas pelas sensor proteins. São geralmente cinases que amplificam o sinal por fosforilação dos grupos de proteínas que se seguem no próximo passo da via.
· Effector proteins – são ativadas pelas transducer cinases. Executam as ações que são requeridas por uma via em particular. Muitas vezes incluem cinases cujos alvos são as proteínas finais da via.
Cinase ATM
- Um dos efetores da via de resposta a DNA danificado das células animais.
- A perda de função da ATM é responsável pela doença humana ataxia telangiectasia. Doentes com esta patologia não são só anormalmente sensíveis aos agentes que danificam o DNA, como também têm muitos defeitos celulares que resultam de erros que ocorrem durante o ciclo de divisão celular normal (não há reparação, pois eles não têm o checkpoint). A proteína cinase ATR está relacionada com a ATM e também despoleta esta resposta.
- A ATM existe em células unirradiated como um dímero em que a sua atividade enzimática é suprimida. Danos no DNA causam a fosforilaçãoda serina, que faz com que o dímero se dissocie. O monómero é uma cinase ativa. O evento de ativação pode ser a consequência de alterações na estrutura da cromatina que resultam de quebram no DNA causadas pela radiação.
- Danos no DNA despoletam o checkpoint G2 que envolve cinases e fosfatases.
- A ATM ativa a cinase Chk2 que fosforila a Cdc25 no resíduo Ser216.
- A Cdc25 liga-se à proteína 14-3-3σ, que se mantém num estado inativo. Como resultado, a Cdc25 não consegue fosforilar a Cdc2, pelo que a fase M não pode ser ativada.
- A reparação do DNA danificado requere a combinação dos produtos dos genes que são ativados em resposta ao dano e proteínas que são ativadas por fosforilação.
As Transições G0/G1 E G1/S Envolve Inibidores Cdk
O RB é um alvo para várias vias que inibem o crescimento, pelo que pode ser um meio através do qual os sinais inibidores de crescimento mantêm as células em G1 (ou G0).
Existem dois tipos de genes que previnem a progressão do ciclo celular. Como são essenciais na prevenção na formação de tumores, têm o nome de genes supressores de tumor – CKIs - que inibem os complexos cdk-ciclina ligando-se a estes, mantendo-os na sua forma inativa, e assim impedem a fosforilação da RB e a progressão do ciclo celular para a fase S mantendo a célula em fase G0 ou G1.
- A família kip que inibe toda a família da cdk e que possui três membros: os genes p21, p27 e p57.
- O p21 e p27 bloqueiam a subunidade catalítica das cdk-ciclina, fazendo com que estes deixem de ser substratos para ativação por fosforilação através das CAK. Além disso, também impedem a atividade catalítica dos complexos cdk-ciclina.
p21
- Inibidor cdk universal, podendo ligar-se a todos os complexos da cdk 2,4,6.
- ativado pelo p53 que é desencadeado por danos no DNA (p.ex.: radiação).
- O aumento de subunidades do p21 associadas com cdk-ciclina inibe a função da cinase.
p27
- Ativado pelo Transforming Grow Factor of β –inibidor do crescimento
- Tem uma sequência parcialmente relacionada com o p21, e também se liga ao complexo cdk-ciclina.
- Uma sobreexpressão do p27 bloqueia a progressão através da fase S.
- Os níveis de p27 aumentam quando as células vão para um estado quiescente pelo tratamento com o TGFβ.
- A família INK4a/ARF específica para a cdk4, inclui o p16
- As proteínas INK-4 inibem as atividades da cdk4-ciclinaD e da cdk6-ciclinaD através da ligação às subunidades cdk. A p16 e p19 ligam-se perto do local de ligação ao ATP da cdk6, inibindo a atividade catalítica e levando a uma alteração conformacional que impede a ligação da ciclina.
P16
- Liga-se à cdk4 e impede a célula de sair da fase G1/G0
– Não pode inibir a proliferação de células que não possuam RB o que indica que o seu mecanismo de atuação está relacionado com a utilização da RB como substrato.
Inibidores da Cdc25 (cinase necessária para a ativação da cdk1) podem ser úteis na paragem do ciclo celular e portanto, ser úteis como agentes anti-tumorais.
As coesinas mantêm os cromatídeos irmãos juntos:
- Os cromatídeos irmãos são mantidos juntos por um complexo de coesinas, que garantem a associação dos cromatídeos no começo da mitose, bem como a sua dissociação durante a mitose.
- Na metáfase, cada par de cromatídeos irmãos está em equilíbrio no fuso, conectados a ambos os polos pelos microtúbulos. Quando as coesinas se dissolvem, os cromatídeos irmãos separam-se e ascendem para os polos opostos (transição da metáfase para a anáfase).
As separinas são controladas por securina e estão responsáveis por libertar as coesinas.
- Se a securina sequestra a separina, é provável que ocorra separação dos cromossomas prematura.
- Se o gene da securina está inativado, os cromossomas têm dificuldade em separar-se, podendo originar anormalidades na segregação dos cromossomas.
- A securina tem dois papéis: ativa a separina, mas mantém-na sequestrada. Quando a securina é degradada, a separina é libertada num estado ativo. Se a securina estiver completamente ausente, a separina nunca se tornará ativa, pelo que as coesinas não são destruídas.
Nas células eucarióticas superiores, a coesina Scclp é principalmente libertada a partir dos cromossomas durante a prófase, contudo é deixada nas regiões centroméricas. É degradada no início da anáfase, e a sua perda nas regiões centroméricas talvez seja o motivo que despoleta a separação dos cromossomas.
A formação do complexo de coesina ocorre durante a fase S. O sistema de coesão é um alvo para o checkpoint. A progressão para a mitose requere que todos os cinetocoros estejam emparelhados com os seus homólogos.
- Este checkpoint é despoletado pela presença de um cinetocoro que não está ligado.
Mutações nos genes Mad e Bud permitem que a mitose continue de forma aberrante na presença de cinetocoros desemparelhados.
- As proteínas Mad controlam o sistema de segregação dos cromatídeos: ligam-se ao CDC20 impedindo a ativação da APC. Quando os cinetocoros estão todos ligados, as Mad libertam-se do CDC20 que ativa a APC, permitindo a continuação da anáfase.
A saída da mitose é controlada pela localização da fosfatase Cdc14 (e ativação)
- Durante a interfase, a Cdc14 é mantida no nucléolo. Neste local, a fosfatase não consegue encontrar nenhum substrato, pelo que está inativa.
Quando é libertada, atua em pelo menos dois substratos desfosforilando-os: Cdh1 e Sic1.
- A proteína de ligação ao GTP, Tem1 que é ativada quando ligada a GTP e pela concentração do fator de troca Lte1 no Bud formado durante a divisão das leveduras. A ativação do Tem1 provoca a libertação do Cdc14, levando à saída da mitose.
O fim do ciclo celular é o ato da divisão. Os eventos relevantes incluem:
· Condensação da cromatina
· Dissolução da lamina nuclear em várias subunidades e desagregação do invólucro nuclear, reticulo endoplasmático e Golgi apparatus em pequenas vesículas membranares.
· Dissociação dos microtúbulos em dímeros de tubulina e sua reconstrução num fuso.
· Reorganização dos filamentos de actina para a substituir rede usual de anéis contrácteis que dividem as células filhas na citocinese.
Estas mudanças são reversíveis, pelo que após a separação das células volta tudo ao normal. A cinase de fase M atua diretamente na cromatina fosforilando a histona H1 e outras proteínas alvo, provocando a condensação dos cromossomas.
Efeitos mecânicos provocados pelo crescimento dos microtúbulos provocam a desagregação do invólucro nuclear. As laminas são fosforiladas no início da mitose, e a presença dos grupos fosfato apenas em dois resíduos de serina per lamina é suficiente para causar a dissociação dessas laminas.
- Mutações que alteram serinas para alaninas impedem essa dissociação na mitose
O fuso é orientado pelos centrossomas:
Alguns microtúbulos estendem-se de um polo para o outro, enquanto outros conectam os cromossomas aos polos. A extremidade de cada microtúbulo está ligada aos MTOCs (microtubule organizing centres).
- MTOCs nos polos estão no centrossoma; MTOC no cromossoma está no cinetocoro.
Nas células animais, o centrossoma contém um par de centríolos, rodeados por uma região amorfa densa. Os centríolos são possivelmente responsáveis pela orientação do fuso, podendo ter também um papel no estabelecimento da direccionalidade do movimento celular.
- Os centríolos possuem o seu próprio ciclo de replicação – quando nasce a célula tem 2 centríolos, mas como na interfase estes duplicam, no início da mitose existem 4.
A duplicação do centrossoma é regulada durante o ciclo celular, existindo um checkpoint que para o ciclo até essa duplicação ter ocorrido.
A proteína monomérica G – Ran - controla a montagem do fuso:
Controla a direção do transporte proteico através do invólucro nuclear.
Ativa quando ligada a GTP. Normalmente, no núcleo está presente Ran-GTP, e no citosol Ran-GDP.
- O complexo de exportação de proteínas é estável na presença da Ran-GTP, enquanto o complexo de importação é estável na presença de Ran-GDP.
Mutações em algumas proteínas que se ligam à Ran provocam malformações do fuso.
- Um mutante da Ran, a proteína RCC mantem a Ran num estado