Técnicas de estudo de DNA - Parte 1 SLIDE 5

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BIOLOGIA MOLECULAR 
Técnicas de estudo de DNA 
Prof. Grazielle Ribeiro - Departamento de Bioquímica e Imunologia - UFMG 
Instrumentos utilizados na 
exploração dos genes 
• Análise com enzimas de restrição 
• Eletroforese 
• Técnicas de transferência 
• Reação em cadeia da polimerase 
•Sequenciamento de DNA 
•Tecnologia do DNA recombinante 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
Reconhecem sequências específicas e hidrolosam uma ligação 
fosfodiéster em cada filamento 
Regiões palindrômicas: 
Radar 
A grama é amarga 
Roma me tem amor 
Como um gene pode ser 
purificado? ? 
• Papel biológico  Cortar moléculas exógenas de DNA 
 
O DNA da própria célula não é degradado, pois os pontos reconhecidos 
por suas próprias enzimas de restrição estão metilados 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
 
• Papel na Biologia Molecular  Clivar o DNA em 
sequências específicas para gerar um conjunto de 
fragmetos menores 
 
• Utilizadas em métodos para mapeamento e análise 
de genes e genomas 
EcoRI 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html 
http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
• O tamanho dos fragmentos produzidos por clivagem com uma 
endonuclease depende da frequência com que um sítio de restrição 
ocorre numa longa molécula de DNA. 
 
• Isso depende do tamanho da sequência de reconhecimento. 
44=256  sequência de 4pb aparece em média a cada 256 nucleotídeos 
46=4.096  sequência de 6pb aparece em média a cada 4.096 nucleotídeos 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
Extremidades 
coesivas Extremidades 
cegas 
Impressão digital de uma molécula 
de DNA 
Fragmentos de restrição podem ser 
separados por Eletroforese em Gel 
Enzimas de restrição (Endonucleases de restrição) 
Introduzida em 1939 por Tiselius e Kabat com o objetivo de separar 
partículas orgânicas. 
- 
+ - 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- - 
- 
Em princípio uma molécula com carga desloca-se em um campo 
magnético em uma velocidade proporcional à sua densidade de carga 
total, tamanho e forma. 
Eletroforese 
• DNA, carga negativa 
– Tem tendência a se dirigir ao 
polo positivo quando sujeito a 
um campo elétrico 
 
• As moléculas são separadas 
devido ao tamanho. O formato das 
moléculas também podem influenciar. 
Movimento de partículas dispersas num fluído sob 
influência de um campo elétrico uniforme 
Eletroforese 
Utiliza-se uma cuba com dois compartimentos separados por 5 a 10 cm. 
Num compartimento o eletrodo com fio preto determina o pólo negativo, 
e no outro compartimento o eletrodo com fio vermelho é o pólo positivo. 
Eletroforese 
1 - Montar a cuba; 
2 - Adicionar o gel, previamente preparado; 
3 - Colocar a solução tampão com pH definido; 
4 - Adicionar as amostras a serem separadas: 
 DNA 
 Azul de bromofenol 
 
 O azul-de-bromofenol acusa sua posição por sua banda azul e 
adverte sobre o término da corrida antes de chegar à extremidade do gel. 
Também auxilia na sedimentação das amostras nos poços. 
5 - Ligar a cuba  Eletroforese 
Eletroforese - Preparação 
6 - Coloração 
Montagem da cuba 
Horizontal X Vertical 
Agarose X Poliacrilamida 
• Polímero linear extraído de algas marinhas e basicamente 
composto de D-Galactose e L-Galactose. 
• Ao solidificar, após o aquecimento, os longos filamentos de 
agarose formam uma matriz (malha) que serve de "peneira" de 
separação de fragmentos de DNA. 
• Capaz de separar fragmentos maiores 
Preparação do gel 
Gel de agarose 
Fatores que influenciam a migração em gel de agarose: 
• Concentração da agarose no gel (quanto maior a concentração de 
agarose, menor a malha); 
• O tamanho dos fragmentos de DNA (fragmento menor é mais rápido); 
• A conformação do DNA, (circular fechado, mais rápido; circular aberto, 
mais lento; linear, intermediário); 
• A corrente aplicada: maior voltagem resulta em migração mais rápida; 
• Mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. 
 
• Poros muito pequenos  fragmentos de DNA menores que 500 nucleotídeos 
(permitem separação de moléculas que diferem em apenas um nucleotídeo 
de comprimento) 
 
• São usados para separar fragmentos 
de DNA menores que 2 kpb, enquanto 
que moléculas de até 200 kpb podem ser 
separaradas em géis de agarose. 
Preparação do gel 
Gel de poliacrilamida 
Aplicação das amostras 
Corrida do gel 
• Aplicação do campo elétrico 
 
• Fonte elétrica gera fluxo de 
íons através da solução 
tampão 
 
• Terminais positivo e negativo 
Corrida do gel 
. 
 Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob 
UV podemos ver as bandas de DNA. 
Coloração das moléculas 
 
 
 
 
A intensidade da fluorescência do SYBR 
Green é aumentada em 100X quando se 
liga ao DNA. 
 
- Vantagens sobre o EtBr: 
 - É muito menos mutagênico, 
 - Pode ser adicionado diretamente à 
 amostra antes da eletroforese. 
Coloração das moléculas 
SYBR Green > Molecular Probes 1995 
Coloração das moléculas 
brometo de etídio nitrato de prata raio – X 
quimiluminescência coomasie blue 
Eletroforese 
http://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM&feature=related 
Eletroforese em Gel de campo pulsado 
Pulsed-field gel electroforesis (PFGE) 
Separação de moléculas de DNA muito longas (cromossomos inteiros de bactérias 
e leveduras) 
 
A eletroforese em gel de agarose não é eficiente porque o campo elétrico aplicado 
estira essas moléculas muito longas, de forma que elas migram pelo gel como 
“serpentes”. A velocidade de migração dessas moléculas estiradas não depende 
do seu tamanho. 
 
PFGE  A direção do campo elétrico é modificada periodicamente, o que força 
a molécula a se reorientar antes de continuar a se mover sinuosamente atraves 
do gel. Essa reorientação é mais demorada para moléculas maiores, que se movem 
mais lentamente do que as mais curtas. 
Eletroforese em campo pulsado 
Grandes fragmentos 
de DNA 
Técnica de Hibridação 
(Transferência de Sourthen) 
A fita dupla é desnaturada em 
fita simples e depois transferida 
para uma membrana de 
nitrocelulose ou nylon 
Sonda marcada 
de DNA 
unifilamentar 
A sonda forma um híbrido 
com um fragmento de 
restrição tendo uma 
sequência complementar 
Autoradiografia revela a 
posição do duplex sonda-
fragmento de restrição 
Técnica de Hibridação 
(Transferência de Sourthen) 
• Identificação de pessoas: em testes de paternidade, comparando o DNA do 
suposto pai,da mãe e do filho; 
• Identificação de criminosos 
Aplicações da eletroforese 
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/
gelelectrophoresis.html 
Amplificação do DNA 
(Reação em cadeia de polimerase) 
Componentes necessários 
 
•Um par de primers que formem 
híbridos com as sequências de 
flanco do alvo 
 
• Os quatro trifosfatos de 
desoxiribonucleotídeos (dNTPs) 
 
• Uma DNA polimerase 
termoestável 
Taq polimerase  oriunda da bactéria 
Thermus aquaticus que vive em fontes de 
água à temperatura de 75oC no 
“Yellowstone National Park” 
Amplificação do DNA 
(Reação em cadeia de polimerase) 
• Separação dos filamentos (Os dois 
filamentos da molécula parental são 
separados, aquecendo-se a solução a 
95oC por 15s) 
 
• Hibridação de primers (A solução é 
resfriada a 54oC e os primers formam 
híbridos com as extremidades 3`). 
 
• Síntese de DNA (A solução é 
aquecida a 72oC, temperatura ideal para 
a DNA polimerase Taq) 
Ciclagem 
Gráfico da Cinética do PCR. 
Amplificação do DNA 
(Reação em cadeia de polimerase) 
Separação das fitas 
Ligação dos primers 
Síntese de DNA 
 
As três etapas (Separação 
dos filamentos, Hibridação 
de primers e Síntese de 
DNA) constituem um ciclo 
da amplificação por PCR e 
podem serfeitas 
repetidamente apenas 
mudando-se a temperaruta 
da mistura de reação 
A termoestabilidade 
da Taq permite fazer 
PCR em um ambiente 
fechado. Nenhum 
reagente é adicionado 
após o primeiro ciclo. 
As duplas hélices são 
aquecidas para começar o 
segundo ciclo 
Dois filamentos curtos que 
constituem apenas a 
sequêcia alvo e a dos primers 
Amplificam 
exponencialmente 
a sequência alvo 
Amplificação do DNA 
(Reação em cadeia de polimerase) 
Amplificação do DNA 
(Reação em cadeia de polimerase) 
Amplificação do DNA 
Aplicações 
• Diagnóstico médico (Detcção de parasitos com o uso de primers específicos) 
• Detecção precoce de alguns cânceres 
• Monitoramento da quimioterapia do câncer (Detecção de quando lihagens 
cancerosas foram eliminadas) 
• Aplicação judicial e na medicina legal. 
• Parentesco biológico em disputa de paternidade 
•Amplificação de moléculas muito antigas  DNA é muito estável 
Tipagem do DNA 
• A impressão digital do DNA é baseada nos polimorfismos de sequência 
(usualmente alterações únicas de pares de bases) que ocorrem de indivíduo 
para indivíduo, uma para 500 a 1000 pb, em média. 
 
• Algumas das alterações de sequência afetam os sítios de 
reconhecimento para enzimas de restrição, resultando numa variação de 
indivíduo para indivíduo, no tamanho de certos fragmentos de DNA 
produzidos pela digestão. 
 
• Essas diferenças de tamanho são referidas como polimorfismos do 
comprimentos dos fragmentos de restrição (RFLPs) 
Tipagem do DNA 
• Sondas para regiões que contêm DNA 
repetitivo (sequências curtas repetidas milhares 
de vezes: STRs  Small Tandem Repeats) 
 
• O número de unidades repetidas em tal DNA 
varia de indivíduo para indivíduo. O padrão das 
bandas é distinto para cada indivíduo 
• Manchas de sangue e amostras de sêmem  culpa ou inocência em casos de 
assalto ou estupro 
2. Extração do DNA 
 
3. Amplificação do DNA 
 
1. Coleta do sangue 
3. Digestão do DNA 
4. Eletroforese 5a. Southern Blotting 
Como é feito o exame de paternidade? ? 
5b. Hibridização da membrana de nylon 
6. Visualização 
Figura Inclusão - Observe que um dos 
alelos (banda) do filho é proveniente da 
mãe e o outro alelo proveniente do 
suposto pai. Neste caso, a paternidade fica 
comprovada. 
Figura Exclusão - Observe que um dos 
alelos (banda) do filho é proveniente da 
mãe. O outro alelo, no entanto, difere dos 
alelos do suposto pai. Neste caso, ocorreu 
uma exclusão de paternidade. 
 Não é possível cultivar uma ampla variedade de 
microorganismos; 
 As bactérias isoladas representam uma 
pequena parte do que está realmente presente 
naquele local. 
• Amplificação de DNA de microorganismos que ainda não foram isolados e 
cultivados 
 A extração de ácidos nucléicos diretamente das amostras do 
ambiente, chama a atenção para a grande proporção de 
microorganismos que não são facilmente cultivados em laboratório, 
mas que tem grande importância em atividades de biodegradação. 
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ 
 
Animação: Faça o PCR 
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm 
http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ 
Amplificação do DNA 
(Reação em cadeia de polimerase) 
- 
 R
T
 
+
 R
T
 
RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction) 
Tipos de PCRs: 
http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/Flash/RT_PCR.html 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
Ciclo no qual a reação atinge 
o limiar da fase exponencial 
(Cycle Threshold – CT) 
Permite a quantificação exata e 
reprodutível baseado na 
fluorescência 
A emissão de 
fluorescência aumenta 
de acordo com os 
produtos da PCR 
Não requer gel para 
avaliar resultados 
• Termociclador com sistema ótico para excitação da fluorescência e coleta da 
emissão 
• Computador com software para aquisição e análise de dados 
• Fluoróforos (moléculas que absorvem e emitem luz em um comprimento 
específico) 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
O SYBR® Green se liga entre a fita 
dupla de DNA e com a excitação da 
luz emitida pelo sistema ótico do 
termociclador, emite uma 
fluorescência verde. 
• Baixo custo, facilidade no uso e 
sensibilidade 
• Liga-se em todo DNA fita dupla, 
incluindo dímeros iniciadores 
• A fluorescência é realçada quando 
liga-se à fita dupla 
SYBR® Green 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
Sonda TaqMan® 
Fluoróforo 
Quencher 
Molecular beacon 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
Leucemia mielóide crônica (LMC), (elevada a expressão do transcrito BCR-
ABL) 
Em casos de pacientes com LMC, ao diagnóstico espera-se maior quantidade de 
seqüências-alvo no início da reação, favorecendo precocemente a elevação da 
emissão de luz, quando comparados a pacientes em remissão citogenética. 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
Aplicações 
 
Identificação de alelos em DNA genômico 
Análise de sequências virais, bacterianas ou de protozoários a 
partir de várias fontes, 
Análise de produtos trangênicos 
Real time PCR 
Tipos de PCRs: 
http://www.youtube.com/wa
tch?v=QVeVIM1yRMU 
• Único vivo dentre os 4 indivíduos que já venceram dois 
prêmios Nobel 
• ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos 
da insulina 
– Ganhou o Nobel de química em 1958 
• 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido 
formil-metionina 
• 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S 
• 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA 
• 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro 
de um organismo, o bacteriófago phi X 174 
– 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“ 
– Ganha o segundo Nobel de química em 1980 
Frederick Sanger 
Sequenciamento do DNA 
Término controlado da replicação (Método didesoxi de Sanger) 
Método enzimático com terminadores de cadeia específicos, para gerar quatro 
populações de fragmentos que terminam em A,G,C ou T. 
Terminadores: 2`3`-didesoxinucleotídeos trifosfatos 
marcados com radioatividade 
Não tem a ponta de hidroxila 
3`necessária para formar a ligação 
fosfodiéster seguinte 
Os fragmentos de tamanho 
diferentes correspondem as 
posições de A 
A utilização do primer garante que 
o novo DNA sintetizado comece 
sempre do mesmo ponto 
A concentração do análogo 
didesoxi é baixa o suficiente para 
que ocorra o término apenas 
ocasionalmente 
Sequenciamento do DNA 
Sequenciamento do DNA 
Sequenciamento do DNA 
Sequenciamento do DNA 
• Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e 
coloca-se na máquina de PCR para a reação de amplificação 
interrompida. 
 
• Diferenças com relação ao PCR 
– Utilização de um só primer 
– Utilização dos ddNTPs 
 
• Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos 
contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao 
sequenciador de DNA 
Sequenciamento automático do DNA 
O que faz um sequenciador de DNA? 
• Segunda etapa: realização da eletroforese capilar 
– O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-
finos 
– Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o 
comprimento de onda emitido pelo didesóxi 
 
Sequenciamento automático do DNA 
Sequenciamento do DNA em capilar 
Sequenciamento automático do DNA 
Terminadores: 2`3`-didesoxinucleotídeos trifosfatos marcados com 
fluorescencia (uma cor diferente para cada terminador) 
Reação única e automatizada 
• As faixas separadas de DNA são detectadas por sua fluorescência à medida que 
surgem na eletroforese. 
• A sequência de suas cores dá diretamente a sequência de bases 
http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM 
Sequenciamento automático 
As sequências de nucleotídeos são utilizadas para 
predizer a sequência de aminoácidos de proteínas 
Embora existam seis dases de leitura diferentes nas quais a sequência de DNA pode 
ser traduzida em preoteínas (três em cada fita), a correta é conhecida como a únicasem códons de terminação frequentes. 
Para uma sequência de nucleotídeos aleatória lida em uma fase em 
particular, um sinal de terminação para síntese de proteína é encontrado, 
em média, cerca de 1 a cada 21 aa (1 a cada 63 nucletídeos) 
Não tem um códon 
de terminação 
As sequências de nucleotídeos são utilizadas para 
predizer a sequência de aminoácidos de proteínas 
Sinal de terminação 
Sequência de DNA de 1.700pb 
Regiões entre possíveis sinais de início e 
terminação para síntese de proteína 
Codifica uma proteína de 
475 resíduos de aa de 
comprimento 
Embora existam seis dases de leitura diferentes nas quais a sequência de DNA pode 
ser traduzida em preoteínas (três em cada fita), a correta é conhecida como a única 
sem códons de terminação frequentes.