1 Microscópio óptico como ferramenta de magnificação de estruturas celulares e microtécnica vegetal

Prévia do material em texto

Microscópio óptico como ferramenta de magnificação de 
estruturas celulares e microtécnica vegetal 
 
Partes do microscópio 
 
 
Em azul: sistema óptico 
Em vermelho: sistema mecânico 
 
Sistema óptico 
 Composto por peças que aumentam a 
imagem e permitem a visualização da estrutura. 
 
Lentes oculares - Onde colocamos nossos olhos 
para observar a lâmina. Dependendo do 
equipamento, ela pode aumentar a amostra 
observada em 5 ou 10 vezes; 
• Lentes objetivas - Conjunto de 4 lentes que 
ficam próximas à amostra a ser observada. 
Possuem capacidade de ampliação do objeto de 
4, 10, 40 e 100 vezes. Para se observar 
amostras com a lente objetiva de aumento de 
100 vezes é necessário o uso de óleo de 
imersão sobre a lamínula, pois proporciona 
maior aproveitamento da quantidade de luz e, 
consequentemente, maior ampliação da 
amostra; 
• Condensador - Concentra os feixes de luz, 
formando um cone luminoso; 
consequentemente, aumenta a quantidade de 
luz que vai chegar até a amostra a ser 
observada; 
• Diafragma - Elimina os raios de luz periféricos, 
deixando passar apenas os raios centrais, logo, 
uma menor quantidade de luz sobre a amostra. 
Sempre que optamos por uma ampliação 
menor, devemos abrir o diafragma e fechá-lo 
quando a ampliação for maior; 
• Fonte de luz ou espelho - É uma lâmpada 
embutida que emite raios luminosos que 
atravessam o condensador e a amostra, 
alcançam as lentes e formam a imagem. 
 
Sistema mecânico 
Constituído por peças que movimentam a 
lâmina, possibilitam a definição do foco e dão 
suporte para todas as peças do microscópio. 
 
• Tubo ou canhão - Peça cilíndrica onde ficam as 
lentes oculares. Nos microscópios que 
possuem duas oculares (binoculares), o tubo 
permite o ajuste adequado das diferentes 
distâncias entre os olhos do observador, para 
uma visualização confortável; 
• Revólver ou tambor - Peça giratória onde 
ficam presas as lentes objetivas; 
• Braço, coluna ou estativa - peça que une o pé 
ao tubo ou canhão; 
• Platina ou mesa - Pequena plataforma com 
uma abertura para passagem da luz, ligada ao 
braço, onde é colocada a lâmina com a 
amostra. A lâmina é presa com as garras ou 
pinças; 
• Charriot - Peça que fica sobre a platina e que 
é acionada por 1 ou 2 botões, que movimentam 
a lâmina observada para cima e para baixo, 
para a esquerda e para a direita; 
• Parafuso macrométrico - Aproximamos ou 
distanciamos das lentes objetivas a platina 
contendo a lâmina, permitindo uma ampliação 
grosseira; 
• Parafuso micrométrico - Realizamos na 
platina, com a lâmina, movimentos delicados, 
fazendo o ajuste fino e preciso do foco da 
amostra. 
 
Como utilizar o microscópio 
1. Observar se a lente objetiva de menor 
aumento (4x) é a que está posicionada sobre 
a platina, caso não seja, posicionar; 
2. Ligar o microscópio na tomada, de acordo com 
a voltagem; 
3. Ligar a luz do microscópio no interruptor e 
aumentar a quantidade de luz; 
4. Afastar a platina ao máximo da lente objetiva, 
usando o parafuso macrométrico; 
5. Posicionar a lâmina e prendê-la com as garras. 
6. Movimentar o charriot para posicionar a 
amostra da lâmina no feixe de luz, sempre 
olhando para a lâmina diretamente por fora 
das lentes; 
7. Quando a amostra estiver sobre o feixe de 
luz, olhar pelas lentes oculares e aproximar a 
platina da lente objetiva, usando o parafuso 
macrométrico; 
8. Quando alcançar o foco, refine-o usando o 
parafuso micrométrico; 
9. Para ampliação da imagem, mude a lente 
objetiva, segurando pelo revólver; 
10. Ao terminar as observações, abaixe a platina 
usando o macrométrico, posicione a lente 
objetiva de menor aumento sobre a platina, 
retire a lâmina e guarde-a; reduza a luz ao 
mínimo, apague a luz, desligue o microscópio da 
tomada e coloque a capa. 
 
Formação da imagem 
A imagem é visualizada por intermédio do 
microscópio óptico começa a ser formada com o 
feixe de luz emitido pelo sistema de iluminação, 
atravessando a amostra na lâmina. 
Depois que atravessa as células, o feixe de 
luz cônico entra na lente objetiva, que projeta uma 
imagem ampliada no plano focal da ocular, que, por 
sua vez, amplia ainda mais a imagem a ser 
visualizada. Este percurso, desde a fonte de luz 
até a visualização da imagem ampliada, é 
denominado caminho óptico. 
O microscópio possibilita a observação de 
estruturas que a olho nu não são visíveis. Contudo, 
apenas a capacidade de ampliar células ou 
estruturas não é suficiente para determinar a 
qualidade de um microscópio. A aproximação deve 
estar associada com uma boa distinção dos 
detalhes das estrutura, ou seja, uma boa 
resolução. Cada microscópio possui um limite de 
resolução, que é a menor distância entre dois 
pontos, de modo que ainda apareçam 
individualizados na imagem. 
 
Aumento da imagem 
Para calcular o aumento total proporcionado 
pelo microscópio óptico, deve-se multiplicar o 
aumento da lente objetiva pelo aumento da lente 
ocular que é observada (aumento da objetiva x 
aumento da ocular). Os aumentos podem ser de 
40X (10x4), 100X (10x10), 400X (10x40) e 1000X 
(10x100) 
Além do aumento proporcionado pelo jogo de 
lentes, o campo de visão, que é a área da amostra 
possível de observar ao microscópio, também se 
altera, conforme a combinação das lentes 
objetivas com as oculares. Quanto menor o 
aumento, maior o campo de visão; quanto maior o 
aumento, menor o campo de visão. 
 
 
Microtécnica vegetal 
Compreende uma série de técnicas 
empregadas na confecção de lâminas para 
estudos histológicos, anatômicos ou histoquímicos 
dos diferentes órgãos da planta. Deve seguir as 
etapas de coleta, fixação, conservação, corte, 
coloração e montagem da lâmina. 
 
Coleta, fixação e conservação 
Todos os órgãos de uma angiosperma podem 
ser utilizados para estudos anatômicos, de acordo 
com os objetivos das observações. Qualquer que 
seja o órgão, precisa estar íntegro, sem sinais de 
predação ou de ataques por fungos e bactérias, 
sem sinais de envelhecimento. 
 
• Raízes e caules - Os caules, dependendo da 
planta, podem apresentar duas regiões 
anatomicamente distintas: o corpo primário e 
o corpo secundário. O corpo primário fica nas 
porções apicais e próximas a elas e o restante 
corresponde ao corpo secundário. Quando o 
objetivo é estudar as células em divisão 
mitótica e células jovens, a região ideal é o 
ápice da raiz. Para obter este tipo de amostra, 
pode-se colocar uma cebola com a base em 
água para desenvolver as raízes e obter as 
células de interesse; 
• Folhas - As folhas adequadas para os estudos 
anatômicos são as do 4º ao 6º nó, pois já 
estão plenamente expandidas e em plena 
atividade fotossintetizante; 
• Flores – Para estudar a organização geral da 
flor, deve-se coletar botões jovens, pois eles 
já apresentam todas as estruturas formadas 
e organizadas. Se o alvo do estudo são as 
características de peças específicas da flor, 
como pétalas, estames, estigma, devem ser 
coletados de flores recém-abertas; 
• Frutos e sementes - Devem ser coletados 
ainda imaturos, pois já apresentam a 
organização definitiva dos tecidos. Para 
sementes, é usual a coleta dos frutos 
imaturos, e todos os procedimentos para a 
montagem da lâmina são feitos no fruto, de 
onde se observam, analisam e descrevem as 
características das sementes. 
 
As amostras vegetais podem ser frescas 
ou fixadas. 
Amostras frescas são usadas para 
observar os movimentos que as organelas fazem 
dentro da célula, ou com objetivo de estudar 
plasmólise. Amostras frescas também são 
adequadas para analisar qualquer característica 
de tecidos ou anatomia de cada órgão da planta. 
Contudo as lâminas devem ser preparadas 
imediatamente após a coleta, para preservar as 
características celulares. O tempo de coleta deve 
ser breve, para que as amostras não percam 
suas características. Após a coleta, se o tempo 
até a montagem das lâminas for de 12 a 24 horas, 
mantenha as amostras dentro dos sacos 
plásticos, sob refrigeração. 
Já amostras fixadassão aquelas que 
recebem tratamento adequado com reagentes 
fixadores, assim que são coletadas, para 
paralisarem as atividades celulares vitais e de 
autólise, sem que haja perda da integridade da 
estrutura celular. As amostras devem ser 
mergulhadas completamente no fixador, assim 
que coletadas. 
 
Corte 
Para que o feixe de luz atravesse a amostra 
e projete a imagem nas lentes objetivas, é preciso 
que a amostra permita a passagem da luz e, para 
isso, ela precisa estar transparente. Com isso, 
entende-se que os cortes histológicos devem ser 
extremamente finos, para proporcionar a 
transparência necessária à passagem da luz. A 
espessura ideal de um corte histológico é entre 3 
e 5µm. Entretanto é possível uma boa visualização 
se os cortes tiverem entre 20 e 30µm, desde 
que estejam precisamente retos. Logo, os cartes 
para estudos de anatomia vegetal devem ser 
retos. 
Quando os cortes são espessos, ocorre 
sobreposição de tecidos e a visualização dos 
detalhes das células e tecidos fica prejudicada. Da 
mesma forma, se o corte ficar enviesado, as 
células são visualizadas como riscos ou borrões, 
perdendo completamente a precisão dos detalhes. 
O corte pode ser feito com a técnica de 
micrótomo rotatório, micrótomo de Ranvier, 
micrótomo de mão, micrótomo de mesa e por meio 
de cortes a mão livre. 
 
• Corte anatômico em folhas 
Cada tipo de corte executado em folhas 
possibilita visões diferentes da organização celular 
do órgão. Portanto, é importante ter em mente o 
objetivo do estudo anatômico para realizar o corte 
adequado. As características anatômicas 
observadas em cada tipo de corte em folhas 
poderão ser aplicadas a estudos taxonômicos, 
evolutivos e de controle de qualidade de plantas 
medicinais, por exemplo. 
➢ As secções de bordo, nervura mediana e 
região intercostal sempre são feitas no 
terço médio da folha; 
➢ As amostras de base e ápice devem 
possuir um comprimento aproximado da 
metade do terço apical ou basal; 
➢ Pecíolos médio e longos precisam ser 
analisados nas porções proximal (próximo 
à lâmina foliar), distal (próximo ao caule) e 
mediana; 
➢ As folhas permitem, ainda, cortes 
paralelos à sua superfície, em ambas as 
faces; são os cortes paradérmicos. 
 
 
 
 
• Corte anatômico em caules 
Nos caules (e nas raízes) também são feitos 
cortes transversais e longitudinais. Porém, como o 
arranjo dos tecidos condutores é complexo, as 
secções longitudinais devem ser de dois tipos, para 
possibilitar a visualização adequada de todas as 
células. 
 
Coloração e montagem da lâmina 
O emprego de coloração nos cortes 
possibilita a visualização das características 
estruturais das células e tecidos. 
O corante reage quimicamente com as 
moléculas diversas que compõem a estrutura das 
células, evidenciando a forma e tamanho delas, 
bem como a espessura e a natureza das paredes 
celulares. Essas características permitem 
identificar os tecidos e sua organização. 
 
• Tipos de corantes 
➢ Safranina hidroalcoólica 0,5%: Ideal para 
epiderme (cora em vermelho); 
➢ Fucsina 0,5%: Evidencia as paredes 
celulares lignificadas (cora em vermelho ou 
rosa escuro); 
➢ Azul de toluidina 0,03%: Evidencia com 
tonalidades diferentes de azul e verde os 
diversos tecidos, de acordo com a 
natureza da parede celular; 
➢ Verde firme (fast green) 0,5%: Evidencia 
as paredes celulósicas em tons de azul; 
➢ Safrablau: Duplo corante, resultante da 
mistura de Safranina 1,0% + azul de astra 
1%. Diferencia os tecidos, corando em azul 
as paredes celulares celulósicas e, em 
vermelho, as paredes celulares lignificadas. 
 
• Etapas de coloração 
1. Diafanização, também chamada de 
despigmentação ou clareamento; 
2. Enxágues; 
3. Diferenciação (quando o corante for aquoso) 
seguida de enxágue; 
4. Desidratação (quando o corante for alcoólico); 
5. Coloração; 
6. Enxágues. 
 
Tipos de lâminas 
• Permanentes - Durabilidade indeterminada, as 
amostras são montadas em lâmina contra 
lamínula com o uso de uma resina solidificável, 
o que aumenta a transparência dos cortes e 
permite sua conservação; 
• Semipermanentes - Duram alguns meses e 
têm como líquido de montagem a solução de 
glicerina 50%, que mantém a amostra 
hidratada e com boa transparência para 
visualização; 
• Temporárias - Têm a duração de poucos dias 
porque o líquido de montagem é a água, que 
evapora e resseca a amostra; são 
confeccionadas durante as aulas práticas e 
devem ser desmontadas logo após as análises. 
 
Montagem de lâminas 
1. Depositar os cortes um a um com o pincel, do 
centro para as laterais da lâmina, em 
quantidade que possa ser coberta 
adequadamente pela lamínula. Nunca colocar 
cortes próximo das bordas da lâmina; 
2. Pingar uma gota de glicerina 50% para cada 
2 cortes ou em quantidade suficiente para 
cobrir toda a superfície, quando a lamínula for 
depositada, sem extravasar; 
3. Com ajuda de uma pinça, depositar a lamínula 
sobre os cortes, apoiando um dos lados na 
lâmina e deitando cuidadosamente, evitando a 
formação de bolhas; 
4. Vedar as bordas da lamínula com o esmalte 
transparente, para que a lâmina não seque.