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Roteiros 
Métodos Instrumentais de Análise 
Manual de Estágio
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 1Análise em espectrofotômetro. 
I. Espectro de absorção e análise de amostra desconhecida
MATERIAIS QUANTIDADE
Água destilada 1 frasco (pisseta)
Alaranjado de metila (4,0 mg/L) 1 frasco (10 mL)
Amostra com teor desconhecido de alaranjado de metila
(verificar o teor a ser utilizado com o professor, sendo recomendada 
concentração entre 1 mg/L e 5 mg/L)
1 frasco (10 mL)
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro
1 aparelho para cada 
2 bancadas
Pipeta automática de 1000 µL 1 unidade
Papel-absorvente 1 unidade
Cubeta de quartzo ou vidro 1 unidade
OBJETIVO:
Este experimento tem por objetivo efetuar a varredura de comprimento de onda na 
região visível do espectro eletromagnético para uma solução aquosa de alaranjado de 
metila utilizando o espectrofotômetro UV-VIS e determinar o comprimento de onda de 
máxima absorbância dessa substância.
Serviço Social
PROCEDIMENTO
PARTE I: Determinação do Espectro de Absorção
1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para 400 nm.
2. Adicionar água destilada a uma cubeta, tomando cuidado para que o volume 
adicionado permita a passagem, pela amostra, do feixe de radiação emitido 
pelo aparelho.
3. Limpar a cubeta com papel-absorvente e introduzi-la no compartimento 
do espectrofotômetro.
4. Ler o valor da absorbância no visor do aparelho e zerar a absorbância.
5. Adicionar solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) em outra cubeta e introduzi-la 
no compartimento do espectrofotômetro.
6. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
7. Ajustar novo comprimento de onda no aparelho, como indicado na tabela 1, 
e repetir os itens 3 a 6.
8. Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos em cada comprimento 
de onda ajustado no aparelho.
Manual de Estágio
Tabela 1: Varredura de absorbância em diferentes comprimentos de onda 
para análise de solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L.
λ (nm) A (nm)
400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
510
520
530
540
550
560
Construir o gráfico que representa o espectro eletromagnético de absorção do alaranjado 
de metila, tendo a absorbância (A) como ordenada e comprimento de onda (λ) como 
abscissa. Identificar o comprimento de onda referente à máxima absorbância e indicá-lo
Analisando a tabela e o gráfico, obter o valor do comprimento de onda de máxima 
absorbância para o alaranjado de metila: λmax = _____________ nm
Serviço Social
PARTE II: Determinação da absorbância de amostras com concentração 
desconhecida de alaranjado de metila
1. Ajustar o comprimento de onda correspondente à máxima absorção para o alaran-
jado de metila (λmax), definido após análise dos resultados da Parte I.
2. Adicionar água destilada à cubeta, tomando cuidado para que o volume adicionado 
permita a passagem, pela amostra, do feixe de radiação emitido pelo aparelho.
3. Limpar a cubeta com papel-absorvente, adicioná-la no compartimento do 
espectrofotômetro e zerar a absorbância do aparelho.
4. Adicionar solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) em outra cubeta e introduzi-la 
no compartimento do espectrofotômetro.
5. Ler o valor de absorbância indicado no visor do espectrofotômetro e anotar abaixo.
A = _______
Manual de Estágio
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Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 2Análise em Espectrofotômetro. 
II. Construção da curva de calibração para análise de 
alaranjado de metila
MATERIAIS QUANTIDADE
Papel-milimetrado 1 folha
Água destilada 1 frasco (pisseta)
Alaranjado de metila 10 mg/L (solução estoque) 1 frasco (200 mL)
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro
1 aparelho para cada 2 bancadas 
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
Pipeta graduada de 20 mL 1 unidade por bancada
Pera para pipeta 1 unidade por bancada
Micropipeta automática (1000 λL) 1 unidade
Ponteiras de 1000 λL 10 unidades
Balão volumétrico 4 unidades
Papel-absorvente 1 unidade
Cubeta de quartzo, plástico ou vidro 1 unidade por bancada
OBJETIVO:
Este experimento tem por objetivo construir a curva de calibração (concentração em 
função da absorbância) para a análise do alaranjado de metila por espectrofotometria. 
Serviço Social
PROCEDIMENTO
Parte 1: Preparo dos padrões de alaranjado de metila em balões volumétricos.
1. Transferir parte da solução estoque de alaranjado de metila (10 mg/L) para um bé-
quer de 50 mL.
2. Identificar quatro balões volumétricos de 50 mL, indicando as concentrações, como 
representado a seguir.
 
3. Utilizando a expressão para cálculos de diluição C1.V1 = C2.V2, determinar o 
volume de solução estoque a ser adicionado em cada balão volumétrico para obter a 
concentração final desejada.
Concentração (mg/L) VEstoque (mL)
1,0
2,5
5,0
8,0
Solução estoque 
(10 mg/L)
8,0 mg/L 5,0 mg/L 2,5 mg/L 1,0 mg/L
Manual de Estágio
4. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, o volume de solução estoque calculado 
para o balão volumétrico correspondente.
5. Completar o volume do balão com água destilada, obedecendo à marca de aferição, 
evitando erro de paralaxe e homogeneizar as soluções.
Parte 2: Dosagem dos padrões em espectrofotômetro
1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para 460 nm.
2. Adicionar água destilada à cubeta (branco), limpar a cubeta com papel-absorvente e 
introduzi-la no compartimento do espectrofotômetro.
3. Ler a absorbância do branco e zerar a escala.
4. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar as soluções preparadas, uma a 
uma, à cubeta e efetuar a leitura da absorbância para cada uma das soluções e anotar 
os valores na tabela a seguir, iniciando pela solução de menor concentração.
5. Lavar a cubeta com água destilada entre cada solução padrão analisada.
6. Descartar as amostras lidas no aparelho em frasco de descarte adequado.
Tabela: Resultados de Absorbância (A) para as soluções de diferentes 
concentrações de alaranjado de metila
C (mg/L) A
1,0
2,5
5,0
8,0
10,0
Serviço Social
CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÃO DA RETA
Em papel-milimetrado, ou utilizando software apropriado, construir a curva de calibração 
para o alaranjado de metila, tendo absorbância em função da concentração.
Determinar a equação da reta e coeficiente de correlação e representá-la a seguir.
Abs = _______ x [Concentração] + ______
ANÁLISE DO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r)
O valor calculado deverá estar próximo a 1,000, o que indica boa correlação entre a 
absorbância obtida no espectrofotômetro para as diferentes concentrações de alaranjado 
de metila.
Segundo a RDC 166/2017, o método será considerado LINEAR quando apresentar 
r ≥ 0,990.
Com a equação de reta correspondente à calibração para as soluções de alaranjado de 
metila, efetuar o cálculo do teor (concentração) dessa substância que estava presente na 
amostra desconhecida analisada na prática 1 (Parte 2). 
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Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 3Avaliação da seletividade do método espectrofotométrico 
de dosagem de alaranjado de metila
MATERIAIS QUANTIDADE
Água destilada 1 frasco (pisseta)
Alaranjado de metila (solução de referência – 
5,0 mg/L). Obs.: preparado em solução aquosa 
pelo técnico.
1 frasco (200 mL)
Amostra (solução de alaranjado de metila 
preparada pelo grupo) na concentração 
de 4,0 mg/L
1 frasco
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
Béquer (50 mL) 1 unidade
Tubos de ensaio 2 unidades
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro
1 aparelho para cada 2 bancadas 
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
Micropipeta automática (1000 λL) 1 unidade
Ponteiras de 1000 λL 10 unidades
Balão volumétrico (200 mL) 1 unidade
Frasco âmbar e rótulo 1 unidade
Papel-absorvente 2 unidades
Cubeta de plástico ou vidro 1 unidade para cada bancada
Serviço Social
Observação: a solução de referênciade alaranjado de metila (5,0 mg/L) deverá ser 
preparada pelo técnico do laboratório dissolvendo a substância em água destilada.
OBJETIVO
Realizar os ensaios de seletividade, precisão e exatidão para a validação parcial do 
método instrumental de quantificação do teor de alaranjado de metila em solução.
PROCEDIMENTO
PARTE I: Preparo de solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L (amostra)
1. Com auxílio do professor, calcular a massa a ser pesada de alaranjado de metila 
para a obtenção de 200 mL de solução de amostra na concentração 4,0 mg/L.
2. Em balança analítica ou semianalítica, pesar a massa de alaranjado de metila 
calculada.
3. Transferir, quantitativamente, para balão volumétrico de 200 mL.
4. Efetuar a dissolução completa pela adição de 100 mL de água destilada.
5. Completar o balão volumétrico com água destilada (observando a marca 
de aferição).
6. Transferir a solução de amostra 4,0 mg/L para frasco e rotular indicando que se trata 
da solução de amostra preparada pelo grupo. 
PARTE II: Ensaio de seletividade
1. Nomear dois tubos de ensaio como:
TUBO A: AMOSTRA (solução preparada pelo grupo na aula prática anterior).
TUBO B: AMOSTRA COM ADIÇÃO DA SOLUÇÃO REFERÊNCIA.
Manual de Estágio
2. Adicionar, com auxílio de micropipeta automática, 2 mL da solução matriz (amostra 
preparada pelo grupo) no tubo “A”.
3. Adicionar, com auxílio de micropipeta automática, 1 mL da solução matriz (amostra 
preparada pelo grupo) no tubo “B”.
4. Ao tubo “B”, adicione 1 mL de solução referência em 1 mL de solução matriz (amostra 
preparada pelo grupo).
5. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para 460 nm.
6. Adicionar água destilada à cubeta (branco) e limpá-la com papel-absorvente.
7. Ler a absorbância do branco e zerar a escala.
8. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo A à cubeta e 
efetuar a leitura da absorbância. Lavar a cubeta com água destilada.
9. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (A) na tabela a seguir.
10. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução matriz (solução de 
alaranjado de metila preparada pelo grupo) à cubeta e efetuar a leitura no aparelho. 
Lavar a cubeta com água destilada.
11. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo B à cubeta e 
efetuar a leitura da absorbância. Lavar a cubeta com água destilada.
12. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (AP) na tabela a seguir.
Tabela de resultados
Tubo Absorbância (A)
A A=
B AP=
 P=
Serviço Social
13. Utilizar os resultados para o cálculo da porcentagem de recuperação e avaliação da 
seletividade do método de acordo com a RDC 196/2017, utilizando a fórmula a seguir.
AP: concentração para a amostra com adição do padrão de referência.
A: concentração para a amostra sem adição do padrão de referência.
P: concentração do padrão de referência.
No método da adição de padrão, os valores aceitos são entre 80% - 120% de recuperação 
para que o método possa ser considerado seletivo.
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Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 4Avaliação da precisão e exatidão do método 
espectrofotométrico de dosagem de alaranjado 
de metila
MATERIAIS QUANTIDADE
Água destilada 1 frasco (pisseta)
Alaranjado de metila (solução de referência – 10,0 mg/L). 
Obs.: preparado em solução aquosa. TÉCNICO
1 frasco (200 mL)
Alaranjado de metila (solução de referência – 4,0 mg/L). 
Obs.: preparado em solução aquosa. TÉCNICO
1 frasco (200 mL)
Amostra (solução de alaranjado de metila preparado pelo 
grupo) na concentração de 4,0 mg/L
1 frasco 
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
Béquer (50 mL) 1 unidade
Tubos de ensaio 11 unidades
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro
1 aparelho para 
cada 2 bancadas 
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
Micropipeta automática (1000 λL) 1 unidade
Ponteiras de 1000 λL 10 unidades
Balão volumétrico (50 mL) 5 unidades
Papel-absorvente 1 unidade
Cubeta de quartzo 1 unidade para cada bancada
Serviço Social
Observação: a solução de referência de alaranjado de metila (4,0 mg/L) e a solução 
de referência de alaranjado de metila (10 mg/L) deverão ser preparadas pelo técnico do 
laboratório dissolvendo a substância em água destilada.
OBJETIVO
Realizar os ensaios de precisão e exatidão para a validação parcial do 
método instrumental.
PARTE I: ENSAIO DE PRECISÃO E EXATIDÃO
1. Cálculo do teor a 80% da concentração da solução de alaranjado de metila com 
concentração 4,0 mg/L.
Para analisar uma solução de alaranjado de metila com 80% da concentração da 
amostra preparada pelo aluno (4,0 mg/L) será necessário efetuar uma diluição da solução 
de referência (10 mg/L) de forma a se alcançar uma concentração igual a 3,2 mg/L. 
Para tanto, seguir o procedimento descrito a seguir.
a. Transferir 32 mL da solução referência (10,0 mg/L) para balão volumétrico 
de 100 mL.
b. Completar o volume com água destilada.
c. Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fa-
zendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando 
água destilada para ajuste do zero (branco). 
d. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir.
Manual de Estágio
Tabela 1: Absorbância obtida pela leitura de solução de alaranjado de metila.
Replicata (80% da concentração) Absorbância (A)
1
2
3
Média
Concentração (mg/L)
2. Cálculo do teor a 120% da concentração da solução de alaranjado de metila com 
concentração 4,0 mg/L.
Para se analisar uma solução de alaranjado de metila com 120% da concentração da 
amostra preparada pelo aluno (5,0 mg/L) será necessário efetuar uma diluição da solução 
de referência (10 mg/L) de forma a se alcançar uma concentração igual a 4,8 mg/L. 
Para tanto, seguir o procedimento:
a. Transferir 48 mL da solução referência (10,0 mg/L) para balão volumétrico 
de 100 mL.
b. Completar o volume com água destilada. 
c. Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fa-
zendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando 
água destilada para ajuste do zero. 
d. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir.
e. Utilizar a equação de reta (curva de linearidade para o alaranjado de metila) obtida 
para converter o valor para concentração de alaranjado de metila na solução. 
Serviço Social
Tabela 2: Absorbância obtida pela leitura de solução de alaranjado de metila.
Replicata (120% da concentração) Absorbância (A)
1
2
3
Média
Concentração (mg/L)
3. Cálculo do teor a 100% da concentração da solução de alaranjado de metila com 
concentração 4,0 mg/L.
Para se analisar uma solução de alaranjado de metila com 100% da concentração da 
amostra preparada pelo aluno (4,0 mg/L) será necessário utilizar a solução preparada pelo 
grupo e reservada em frasco âmbar. Para tanto, seguir o procedimento:
a. Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fa-
zendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando 
água destilada para ajuste do zero. 
b. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir.
c. Utilizar a equação de reta (curva de linearidade para o alaranjado de metila) obtida 
para converter o valor para concentração de alaranjado de metila na solução. 
Manual de Estágio
Tabela 3: Absorbância obtida pela leitura de solução de alaranjado de metila.
Replicata (100% da concentração) Absorbância (A)
1
2
3
Média
Concentração (mg/L)
4. Utilizar os resultados para o cálculo do coeficiente de variação (CV%) e avaliação da 
precisão do método de acordo com a RDC 196/2017.
5. Utilizar os resultados para o cálculo da porcentagem da exatidão do método de 
acordo com a RDC 196/2017.
Serviço Social
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 5Análise por cromatografia em camada delgada 
I. Análise cromatográfica de ácido acetilsalicílicoe paracetamol
EQUIPAMENTOS
1 cuba cromatográfica a cada 3 grupos
1 banho de aquecimento (40 ºC) a cada 3 grupos
Lâmpada de UV
REAGENTES
50 mL solução de extração (25 partes de acetato de etila, 1 parte de etanol e 1 parte de 
ácido acético) por grupo
Ácido acetilsalicílico e paracetamol (1 comprimido triturado de cada medicamento) – 100 
mg de cada substância (amostra)
OBJETIVO
Avaliar a separação de princípios ativos de ação analgésica pela técnica da CCD. Estudar 
o emprego de técnicas cromatográficas para separação e análise de substâncias em função 
de sua estrutura química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. Serão analisadas 
amostras de aspirina, paracetamol e coristina D.
PROCEDIMENTO
Parte 1: Preparação das amostras de analgésicos (técnico do laboratório)
1. Transferir para béquer, previamente, a amostra triturada de ácido acetilsalicílico e 
paracetamol (substância a ser analisada). Um béquer para cada amostra triturada.
Manual de Estágio
2. EM CAPELA: a cada béquer, adicionar 10 mL de solução de extração.
3. Com auxílio de bastão de vidro, efetuar agitação.
4. Levar os béqueres a banho de água e deixar por 5 minutos em aquecimento 
moderado (40 ºC).
5. Aguardar a decantação das partículas insolúveis.
Parte 2: Análise cromatográfica
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (acetato de etila 
com 0,5% de ácido acético glacial). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a 
completa saturação. Manter a cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm), efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da 
extremidade) indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto onde se indicará o 
final da corrida.
2. Utilizando um capilar, aplique duas porções de cada extrato sobre uma placa de 
sílica (2,5 x 7,5 cm) a 1,0 cm de uma das extremidades.
3. Colocar cuidadosamente a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de 
aplicação da amostra mergulhe no solvente.
4. Aguardar até que o solvente atinja cerca de 0,5 cm do topo da placa, remover a placa 
e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
5. Para que seja possível a visualização na placa de sílica é necessário levar até 
uma lâmpada de UV (utilizar óculos de segurança e obedecer a todas as regras de 
segurança quanto ao uso desse tipo de lâmpada passadas pelo professor no momento 
da visualização).
Serviço Social
6. Marcar, com auxílio de lápis, o ponto visualizado para cada analgésico após a corrida 
na placa de sílica. 
7. Com auxílio de régua, determinar a distância de cada ponto e calcular os valores 
de Rf.
8. Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha 
cromatográfica obtida.
9. Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
Molécula Rf
Paracetamol
Ácido acetilsalicílico
Principais princípios ativos presentes nos analgésicos:
Acetaminofeno (paracetamol)
Ácido acetilsalicílico
Manual de Estágio
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 6Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
II. Análise cromatográfica de pigmentos
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE A CADA 3 BANCADAS
Cuba 2 (uma para a análise e uma para revelação com iodo)
Chapa de aquecimento 1 (manter na capela)
Balança semianalítica 1
MATERIAIS QUANTIDADE POR GRUPO
Béquer 50 mL 2
Erlenmeyer 125 mL 2
Funil para filtração 1
Funil de separação 2
Suporte 1
Garra 2
Pinça metálica 1
Bastão de vidro 1
Capilares 2
Papel de filtro 2
Placa cromatográfica 1
Hexano Para extração e preparo da cuba
Acetona Para extração e preparo da cuba
Iodo sólido Para revelação
Pimentões (vermelho e amarelo) 30 g de cada para extração
Sulfato de sódio anidro ----
Papel para pesagem em balança 2
Espátula 2
Serviço Social
OBJETIVO
Avaliar a separação de pigmentos pela técnica da CCD. Estudar o emprego de técnicas 
cromatográficas para separação e análise de substâncias em função de sua estrutura 
química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. 
PROCEDIMENTO
Parte 1: Preparação do extrato (técnico do laboratório)
As etapas 1 a 11 serão executadas pelo técnico do laboratório a fim de permitir a 
visualização do resultado da análise no próprio dia da prática pelo aluno. A depender da 
disponibilidade de horário, poderá ser feita uma demonstração pelo professor das etapas 
de extração como forma de elucidar o procedimento.
1. Pesar cerca de 30 g dos pedaços (previamente cortados) de cada pimentão (verde, 
vermelho e amarelo) em béqueres diferentes.
2. Adicionar, com auxílio de proveta, 10 mL de acetona e 50 mL de hexano.
3. Transferir cada mistura separadamente para um almofariz com pistilo e macerar até 
obter uma pasta homogênea.
4. Deixar em repouso por 1 hora.
5. Filtrar e transferir para um funil de separação.
6. Separar a fase aquosa em um béquer.
7. Adicionar 15 mL de água destilada. Agitar suavemente para evitar formação de emulsão.
8. Separar e descartar a fase aquosa no béquer.
9. Transferir a fase orgânica para um Erlenmeyer de 125 mL.
10. Adicionar 2 g de sulfato de sódio anidro. Deixar em repouso por 5 minutos.
11. Filtrar em um béquer e concentrar os extratos até o volume de 1 mL através de aqueci-
mento em manta a 70 ºC.
Manual de Estágio
Parte 2: Análise cromatográfica (grupo de alunos)
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (hexano com 5% de 
acetona). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Manter a 
cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm), efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da 
extremidade) indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto onde se indicará o 
final da corrida.
2. Utilizando um capilar, aplique o extrato concentrado de cada pimentão (em posições 
diferentes) sobre a placa de sílica na altura da marcação.
3. Colocar cuidadosamente a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de aplicação da 
amostra mergulhe no solvente.
4. Aguardar até que o solvente atinja a segunda marcação do topo da placa 
(final da corrida).
5. Remover a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
6. Deixar secar ao ar por 5 minutos e observar o número de manchas coloridas formadas. 
7. Se necessário, efetuar revelação com vapor de iodo: em uma cuba contendo iodo sólido 
(preparado 30 minutos antes do início da aula), acondicionar a placa de sílica por alguns 
minutos até observação de manchas escuras.
8. Efetuar o cálculo Rf para as manchas observadas:
Serviço Social
Discussão
Têm-se três tipos de moléculas presentes no extrato de pimentão: 
- Carotenoides
- Criptoxantinas
- Captoxantinas
Portanto, esperam-se, ao menos, três manchas como resultado da análise por CCD.
Moléculas:
(Criptoxantina)
(Capsantina)
-Caroteno
Manual de Estágio
a. Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha 
cromatográfica obtida.
b. Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
Molécula Rf
Caroteno
Capsantina
Criptoxantina
Serviço Social
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
AULA 7Análise por cromatografia em coluna de troca iônica 
Hemoglobina glicada em amostra de sangue
MATERIAIS POR GRUPO
Coluna de separação para Hb-glicada (kit de glico-hemoglobina) – 1 unidade
Tubos de ensaio grandes – 3 unidades
Micropipeta (1000 microlitros) – 1 unidade
Micropipeta (10 – 100 microlitros ou equivalente) – 1 unidade
Ponteiras de 1000 microlitros
Ponteiras de 100 microlitros ou equivalente
EQUIPAMENTOS
Espectrofotômetro (λ = 415 nm)
Cubeta de quartzo – 1 unidade por equipamento
REAGENTES POR GRUPO
Água destilada
Amostra de hemolisado – 100 microlitros (fracionado)
Tampão de separação (frasco 1 – kit Labtest) – 5,0 mL (fracionado)
Manual de Estágio
OBJETIVO
Avaliar a separação dasfrações de hemoglobina glicada e normal em coluna de troca 
iônica. Determinar a porcentagem de hemoglobina glicada em amostra de sangue.
PROCEDIMENTO
Parte 1: Preparação da amostra de hemolisado (executado pelo técnico do 
laboratório)
1. Pipetar em tubo de ensaio 1,0 mL de amostra de sangue total (coletado com EDTA) 
bem homogeneizado.
2. Centrifugar a 2000 RPM por 5 minutos. Retirar o plasma sem ressuspender 
as hemácias.
3. Adicionar 3,0 mL de NaCl (0,85%), homogeneizando o tubo.
4. Centrifugar e remover o sobrenadante sem ressuspender as hemácias. 
5. Ressuspender as hemácias em 3,0 mL de NaCl (0,85%). Centrifugar e acertar 
o volume para a marca de 1,0 mL, retirando o excesso de sobrenadante.
6. Em um tubo de 12x75, adicionar 0,4 mL de solução hemolisante (Frasco 2 – kit) 
e 0,1 mL de amostra de hemácias.
7. Agitar vigorosamente por 20 segundos.
8. Aguardar 5 minutos para que ocorra a hemólise.
Parte 2: Preparação da coluna cromatográfica (executada pelo técnico do 
laboratório)
As etapas 1 a 5 deverão ser realizadas pelo técnico do laboratório no dia da 
prática para que seja possível realizar a separação cromatográfica e a análise 
espectrofotométrica pelo grupo de alunos. O grupo de alunos iniciará a prática a 
partir da etapa 6. 
Serviço Social
1. Nomear um tubo de ensaio como “tampão”.
2. Acomodar a coluna de Troca Iônica sobre esse tubo de ensaio e retirar a tampa su-
perior da coluna.
3. Introduzir o bastão fazendo movimentos giratórios descendentes e ascendentes para 
ressuspender a resina (fase estacionária).
4. Remover a tampa inferior e acomodar novamente a coluna (verticalmente) sobre o 
tubo de ensaio “tampão”.
Obs.: não permita que a ponta da coluna encoste no líquido transferido para o tubo.
5. Aguarde que todo o líquido penetre no interior da resina (fase estacionária). Fechar 
a saída de eluente da coluna e aguardar o início da aula prática.
Parte 3: Análise cromatográfica (executada pelo grupo de alunos no dia da prática)
6. Adicione 0,05 mL (50 microlitros) de amostra de hemolisado sobre a resina 
(com cuidado para evitar formação de bolhas de ar).
7. Aguardar que o hemolisado penetre no interior da resina.
8. Transferir a coluna para um novo tubo de ensaio (enumerado como “1”).
9. Adicionar lentamente (com a adição pela parede da coluna) 3,5 mL de tampão 
(frasco 1 – kit).
10. Aguardar até que todo o tampão penetre no interior da resina.
11. Homogeneizar o líquido coletado no tubo “1”.
12. Enumerar outro tubo de ensaio (seco e limpo) como “2”. Adicionar a esse tubo 7,0 mL 
de água destilada e 0,02 mL (20 microlitros) de amostra de hemolisado. Homogeneizar.
13. Levar os tubos “1” e “2” para o espectrofotômetro, previamente ajustado em 
λ = 415 nm, zerando com água destilada.
Manual de Estágio
14. Efetuar a leitura das absorbâncias dos dois tubos (A1 e A2).
15. Efetuar o cálculo do teor de hemoglobina glicada na amostra de sangue:
Obs.: considera-se como valor de referência um teor de Hb-G entre 5,3% e 8,0%.