Relatório Métodos Instrumentais de Análises

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UNIVERSIDADE PAULISTA
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS
CURSO: FARMÁCIA
DISCIPLINA: MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
INTRODUÇÃO.
Aula 1. Análise em espectrofotômetro. Espectro de absorção e análise de amostras desconhecida.
A espectrofotometria pode ser utilizada identificar e quantificar substâncias químicas a partir da medição da absorção e transmissão de luz que passa através da amostra.
Vamos supor que você olhe para duas soluções da mesma substância, uma com maior intensidade de cor que a outra. O senso comum diz que o mais escuro é o mais concentrado. Assim, tal como a cor da solução se intensifica, sua concentração também aumenta. Esta é uma analogia com o princípio da espectrofotometria: a intensidade da cor é a medida da quantidade de um material em solução.
Um segundo princípio é que cada substância absorve ou transmite certos comprimentos de onda, mas não outros. Por exemplo, a cor de uma folha está relacionada com comprimento de onda de luz. Cada cor tem um comprimento de onda diferente, então quando a luz atinge um objeto, alguns comprimentos de onda são absorvidos e outros refletidos de volta. A clorofila absorve luz vermelha e violeta, enquanto que transmite amarela, verde e azul. Os comprimentos de onda transmitidos e refletidos nos fazem perceber a cor verde.
É esse mesmo princípio de cor e comprimento de onda em que um espectrofotômetro se baseia. Esse equipamento mede e compara a quantidade de luz que uma substância absorve. Dessa forma é possível realizar uma análise quantitativa e qualitativa, identificando e determinando a concentração das substâncias conforme a interação com a luz.
A espectrofotometria é largamente utilizada para a determinação quantitativa de um grande número de espécies químicas, sendo baseada na medida de transmitância ou absorbância de uma solução, numa faixa muito estreita de comprimento de onda. (SKOOG, 2009).
Aula 2. Análise em espectrofotômetro. Construção da curva de calibração para análise de alaranjado de metila.
Curva de calibração é um método utilizado na química analítica para determinar a concentração de uma solução de amostra desconhecida. É um gráfico gerado por meios experimentais, com a concentração da solução de traçado no eixo x e a variável observável – por exemplo, a absorvência da solução – traçada no eixo y.
A curva é construída por meio da medição da concentração e absorvência das várias soluções preparadas, chamado padrões de calibração. Uma vez que a curva foi desenhada, a concentração da solução desconhecida pode ser determinada colocando-a sobre a curva com base na sua absorbância ou outra variável.
As soluções químicas absorvem quantidades diferentes de luz com base na sua concentração. Este fato é quantificado em uma equação conhecida como a lei de Beer, que mostra uma relação linear entre a absorvência de uma solução e da sua concentração. Os investigadores podem medir a absorbância de uma solução usando um instrumento de laboratório chamado um espectrofotômetro. Este processo como um todo é chamado de espectrofotometria.
Para o propósito de validação de métodos analíticos é suficiente indicar em que concentração do analito a detecção é problemática. Assume-se que o branco acrescido de três desvios-padrão das medições é uma aproximação suficiente e usual desse limiar, pois em muitos casos o branco é difícil de ser obtido, de modo que seu desvio-padrão, na prática, é diferente de zero. (EURACHEM, 1998).
Aula 3. Avaliação da seletividade do método espectrofotômetro de dosagem de alaranjado de metila.
A radiação eletromagnética é uma forma de energia propagada em ondas, e pode ser dividida em regiões de comprimento de onda distinto. Também pode ser considerada como um fluxo de partículas denominadas fótons e cada um destes fótons contém determinada energia cuja magnitude é proporcional à frequência e inversamente proporcional ao comprimento de onda.
Quando se trata da concentração sempre existe uma relação direta e proporcional. No entanto, é a estrutura molecular da substância analisada que define a frequência de maior absorção e conferem a sensibilidade e seletividade do método.
Os métodos espectroscópicos são fundamentados pelo produto da interação da matéria e energia eletromagnética. A seletividade e sensibilidade destes métodos são dependentes da concentração da amostra assim como da estrutura química e intensidade ou frequência de energia utilizada (GIL, 2007).
Aula 4. Avaliação da precisão e exatidão do método espectrofotômetro de dosagem de alaranjado de metila.
A precisão de um método é a declaração da proximidade da concordância entre resultados de ensaios mutuamente independentes e é normalmente expressa em termos de desvio-padrão. É considerada também como a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas. As duas formas mais comuns de expressá-la são por meio da repetitividade e a reprodutibilidade, sendo usualmente expressa pelo desvio-padrão.
Os resultados da precisão são variações devido a eventos aleatórios, como diferentes dias, analistas e equipamentos. Na determinação da precisão, o modelo experimental deve ser muito bem traçado de modo que as variáveis do analista possam ser monitoradas.
A exatidão é a concordância entre o resultado de um ensaio e o valor de referência aceito como verdadeiro. A exatidão de um método analítico é verificada quando são obtidos resultados muito próximos em relação ao valor verdadeiro. A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença percentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança (SWARTZ, 2007).
Aula 5. Análise por cromatografia em camada delgada. Análise cromatográfica de ácido acetilsalicílico e paracetamol. 
A cromatografia é um dos métodos de destaque devido à facilidade como efetua separação, identificação e quantificação de substâncias químicas. A cromatografia é um método físico-químico que permite a separação de misturas de substâncias em seus componentes individuais. Esta técnica permite também obter informações quantitativas e qualitativas sobre as substâncias contidas em uma mistura . A técnica é largamente utilizada para identificar compostos, por comparação com padrões já existentes, ou para purificação, separando compostos indesejáveis em uma mistura reacional.
Para comparar e identificar compostos existe diversos tipos de cromatografia, sendo usado um para cada tipo específico no critério de avaliação, e esses métodos variam desde os mais simples até os mais sofisticados. Como cromatografia em papel, por centrifugação, em camada delgada, gasosa, líquida e a cromatografia supercrítica (VOGEL, 2002).
Aula 6. Cromatografia em Camada Delgada. Análise cromatográfica de pigmentos.
A cromatografia é uma técnica e separação bastante adequada para ilustrar os conceitos de interações intermoleculares, polaridade e propriedades de funções orgânicas, com uma abordagem ilustrativa e relevante. A cromatografia pode ser utilizada tanto para a identificação de compostos por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis, como para a separação dos componentes de uma mistura. 
Neste sentido, diversos experimentos envolvendo ensaios cromatográficos são descritos na literatura, uns utilizando como fase estacionária a sílica gel e alumina, outros utilizando materiais alternativos como o giz, mistura de areia e mármore e o açúcar comercial, os quais favorecem a análise e separação dos princípios ativos de medicamentos, extrato de folhas de espinafre, tinta de caneta, extrato de flores, pigmentos de pimentões.
A utilização de substâncias naturais tem sido empregada como uma importante alternativa para o estudo da química, principalmente, aquelas relacionadas ao emprego dos conceitos e técnicas utilizadas na química orgânica, como a cromatografia e extração de óleos essenciais (Fonsecae Gonçalves, 2004).
Aula 7. Análise por cromatografia em coluna de troca iônica. Hemoglobina glicada em amostras de sangue.
 A determinação da concentração total de um elemento químico, normalmente, não é suficiente para uma avaliação de seus efeitos sobre o meio, exigindo informações adicionais sob as várias formas físico-químicas presentes e suas concentrações, ou seja, conhecer a sua especiação físico-química.
A técnica denominada cromatografia de íon, possibilitou a resolução de muitos problemas relacionados com a determinação de espécies iónicas em solução. Devido à sua resposta universal, essa técnica é ideal para avaliar espécies iónicas uma vez que combina a capacidade de separação da cromatografía de troca iónica com a detecção condutimétrica. A cromatografía de íons é considerada uma técnica versátil, sensível e seletiva para separação e determinação de uma série de íons presentes em baixas concentrações, além de permitir a especiação de contaminantes ambientais. Devido a essas características vem sendo aplicada para resolver uma série de problemas referentes à análise de íons nas várias áreas como: clínica, alimenticia, farmacêutica e ambiental. Nos anos 70 as primeiras publicações de trabalhos com cromatografia de íons descreveram aplicações ambientais (FRANKENBERGER, 1990).
 
 RESULTADOS E DISCUSSÕES.
Aula 1. Análise em espectrofotômetro. Espectro de absorção e análise de amostras desconhecida.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Água destilada
	1 frasco (pisseta)
	Alaranjado de metila (4,0 mg/L)
	1 frasco (10 mL)
	Amostra com teor desconhecido de alaranjado de metila
(verificar o teor a ser utilizado com o professor, sendo recomendada concentração entre 1 mg/L e 5 mg/L)
	
1 frasco (10 mL)
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Espectrofotômetro
	1 aparelho para cada
2 bancadas
	Pipeta automática de 1000 µL
	1 unidade
	Papel-absorvente
	1 unidade
	Cubeta de quartzo ou vidro
	1 unidade
OBJETIVO:
Este experimento tem por objetivo efetuar a varredura de comprimento de onda na região visível do espectro eletromagnético para uma solução aquosa de alaranjado de metila utilizando o espectrofotômetro UV-VIS e determinar o comprimento de onda de máxima absorbância dessa substância.
PROCEDIMENTO.
PARTE I: Determinação do Espectro de Absorção.
1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para 400 nm.
2. Adicionar água destilada a uma cubeta, tomando cuidado para que o volume adicionado permita a passagem, pela amostra, do feixe de radiação emitido pelo aparelho.
3. Limpar a cubeta com papel-absorvente e introduzi-la no compartimento do espectrofotômetro.
4. Ler o valor da absorbância no visor do aparelho e zerar a absorbância.
5. Adicionar solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) em outra cubeta e introduzi-la no compartimento do espectrofotômetro.
6. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
7. Ajustar novo comprimento de onda no aparelho, como indicado na tabela 1, e repetir os itens 3 a 6.
8. Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos em cada comprimento de onda ajustado no aparelho.
Tabela 1: Varredura de absorbância em diferentes comprimentos de onda para análise de solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L.
	λ (nm)
	A (nm)
	400
	
	410
	0,506
	420
	0,580
	430
	0,640
	440
	0,705
	450
	0,754
	460
	0,790
	465
	0,794
	470
	0,788
	480
	0,738
	490
	0,639
	500
	0,517
	510
	0,374
	520
	0,242
	530
	0,140
	540
	0,168
	550
	0,025
	560
	0,002
Construir o gráfico que representa o espectro eletromagnético de absorção do alaranjado de metila, tendo a absorbância (A) como ordenada e comprimento de onda (λ) como abscissa. Identificar o comprimento de onda referente à máxima absorbância e indicá-lo.
Analisando a tabela e o gráfico, obter o valor do comprimento de onda de máxima
 absorbância para o alaranjado de metila: λmax = 465 nm.
PARTE II: Determinação da absorbância de amostras com concentração desconhecida de alaranjado de metila
1. Ajustar o comprimento de onda correspondente à máxima absorção para o alaranjado de metila (λmax), definido após análise dos resultados da Parte I.
2. Adicionar água destilada à cubeta, tomando cuidado para que o volume adicionado permita a passagem, pela amostra, do feixe de radiação emitido pelo aparelho.
3. Limpar a cubeta com papel-absorvente, adicioná-la no compartimento do espectrofotômetro e zerar a absorbância do aparelho.
4. Adicionar solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) em outra cubeta e introduzi-la no compartimento do espectrofotômetro.
5. Ler o valor de absorbância indicado no visor do espectrofotômetro e anotar abaixo.
A = 0,547 nm.
Aula 2. Análise em espectrofotômetro. Construção da curva de calibração para análise de alaranjado de metila.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Papel-milimetrado
	1 folha
	Água destilada
	1 frasco (pisseta)
	Alaranjado de metila 10 mg/L (solução estoque)
	1 frasco (200 mL)
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Espectrofotômetro
	1 aparelho para cada 2 bancadas
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
	Pipeta graduada de 20 mL
	1 unidade por bancada
	Pera para pipeta
	1 unidade por bancada
	Micropipeta automática (1000 λL)
	1 unidade
	Ponteiras de 1000 λL
	10 unidades
	Balão volumétrico
	4 unidades
	Papel-absorvente
	1 unidade
	Cubeta de quartzo, plástico ou vidro
	1 unidade por bancada
OBJETIVO:
Este experimento tem por objetivo construir a curva de calibração (concentração em função da absorbância) para a análise do alaranjado de metila por espectrofotometria.
PROCEDIMENTO.
Parte 1: Preparo dos padrões de alaranjado de metila em balões volumétricos.
1. Transferir parte da solução estoque de alaranjado de metila (10 mg/L) para um bé- quer de 50 mL.
2. Identificar quatro balões volumétricos de 50 mL, indicando as concentrações, como representado a seguir.
3. Utilizando a expressão para cálculos de diluição C1.V1 = C2.V2, determinar o volume de solução estoque a ser adicionado em cada balão volumétrico para obter a concentração final desejada.
	Concentração (mg/L)
	VEstoque (mL)
	1,0
	5
	2,5
	12,5
	5,0
	25
	8,0
	40
4. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, o volume de solução estoque calculado para o balão volumétrico correspondente.
5. Completar o volume do balão com água destilada, obedecendo à marca de aferição, evitando erro de paralaxe e homogeneizar as soluções.
6. 
Parte 2: Dosagem dos padrões em espectrofotômetro
1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para 460 nm.
2. Adicionar água destilada à cubeta (branco), limpar a cubeta com papel-absorvente e introduzi-la no compartimento do espectrofotômetro.
3. Ler a absorbância do branco e zerar a escala.
4. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar as soluções preparadas, uma a uma, à cubeta e efetuar a leitura da absorbância para cada uma das soluções e anotar os valores na tabela a seguir, iniciando pela solução de menor concentração.
5. Lavar a cubeta com água destilada entre cada solução padrão analisada.
6. Descartar as amostras lidas no aparelho em frasco de descarte adequado.
Tabela: Resultados de Absorbância (A) para as soluções de diferentes concentrações de alaranjado de metila.
	C(mg/L)
	A
	1,0
	0,021
	2,5
	0,086
	5,0
	0,171
	8,0
	0,271
	10,0
	0,339
CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÃO DA RETA
Em papel-milimetrado, ou utilizando software apropriado, construir a curva de calibração para o alaranjado de metila, tendo absorbância em função da concentração.
 Determinar a equação da reta e coeficiente de correlação e representá-la a seguir.
ANÁLISE DO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r)
O valor calculado deverá estar próximo a 1,000, o que indica boa correlação entre a absorbância obtida no espectrofotômetro para as diferentes concentrações de alaranjado de metila.
Segundo a RDC 166/2017, o método será considerado LINEAR quando apresentarr ≥ 0,990.
Com a equação de reta correspondente à calibração para as soluções de alaranjado de metila, efetuar o cálculo do teor (concentração) dessa substânciaque estava presente na amostra desconhecida analisada na prática 1 (Parte 2).
0,547=0,0348.x-0,0069
0,547+0,069 = 0,0348x
X =0,5539/0,0348
X =15,92mg/L.
Aula 3. Avaliação da seletividade do método espectrofotômetro de dosagem de alaranjado de metila.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Água destilada
	1 frasco (pisseta)
	Alaranjado de metila (solução de referência – 5,0 mg/L). Obs.: preparado em solução aquosa
pelo técnico.
	
1 frasco (200 mL)
	Amostra (solução de alaranjado de metila preparada pelo grupo) na concentração
de 4,0 mg/L
	
1 frasco
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	Béquer (50 mL)
	1 unidade
	Tubos de ensaio
	2 unidades
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Espectrofotômetro
	1 aparelho para cada 2 bancadas
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
	Micropipeta automática (1000 λL)
	1 unidade
	Ponteiras de 1000 λL
	10 unidades
	Balão volumétrico (200 mL)
	1 unidade
	Frasco âmbar e rótulo
	1 unidade
	Papel-absorvente
	2 unidades
	Cubeta de plástico ou vidro
	1 unidade para cada bancada
Observação: a solução de referência de alaranjado de metila (5,0 mg/L) deverá ser preparada pelo técnico do laboratório dissolvendo a substância em água destilada.
OBJETIVO
Realizar os ensaios de seletividade, precisão e exatidão para a validação parcial do método instrumental de quantificação do teor de alaranjado de metila em solução.
PROCEDIMENTO
PARTE I: Preparo de solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L (amostra)
1. Com auxílio do professor, calcular a massa a ser pesada de alaranjado de metila para a obtenção de 200 mL de solução de amostra na concentração 4,0 mg/L.
2. Em balança analítica ou semianalítica, pesar a massa de alaranjado de metila calculada.
3. Transferir, quantitativamente, para balão volumétrico de 200 mL.
4. Efetuar a dissolução completa pela adição de 100 mL de água destilada.
5. Completar o balão volumétrico com água destilada (observando a marca de aferição).
6. Transferir a solução de amostra 4,0 mg/L para frasco e rotular indicando que se trata da solução de amostra preparada pelo grupo.
PARTE II: Ensaio de seletividade
1. Nomear dois tubos de ensaio como:
TUBO A: AMOSTRA (solução preparada pelo grupo grupo na aula prática anterior). TUBO B: AMOSTRA COM ADIÇÃO DA SOLUÇÃO REFERÊNCIA.
2. Adicionar, com auxílio de micropipeta automática, 2 mL da solução matriz (amostra preparada pelo grupo) no tubo “A”.
3. Adicionar, com auxílio de micropipeta automática, 1 mL da solução matriz (amostra preparada pelo grupo) no tubo “B”.
4. Ao tubo “B”, adicione 1 mL de solução referência em 1 mL de solução matriz (amostra preparada pelo grupo).
5. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para 460 nm.
6. Adicionar água destilada à cubeta (branco) e limpá-la com papel-absorvente.
7. Ler a absorbância do branco e zerar a escala.
8. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo A à cubeta e efetuar a leitura da absorbância. Lavar a cubeta com água destilada.
9. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (A) na tabela a seguir.
10. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução matriz (solução de alaranjado de metila preparada pelo grupo) à cubeta e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água destilada.
11. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo B à cubeta e efetuar a leitura da absorbância. Lavar a cubeta com água destilada.
12. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (AP) na tabela a seguir.
Tabela de resultados.
	Tubo
	Absorbância (A)
	A = 0,138
	A= 0,348
	B = 0,135
	AP= 0,594
	
	P= 4 mg/L
13. Utilizar os resultados para o cálculo da porcentagem de recuperação e avaliação da seletividade do método de acordo com a RDC 196/2017, utilizando a fórmula a seguir. 
AP: concentração para a amostra com adição do padrão dereferência.
A: concentração para a amostra sem adição do padrão de referência. P: concentração do padrão de referência.
No método da adição de padrão, os valores aceitos são entre 80% - 120% de recuperação para que o método possa ser considerado seletivo.
% Recup = 20,94 – 21,03 x 100
4
% Recup = - 0,09 x 100
4
% Recup = - 0,022 x 100
% Recup = - 2,25
O valor de recuperação foi muito abaixo do esperado pois muitas pessoas realizaram o processo.
Aula 4. Avaliação da precisão e exatidão do método espectrofotômetro de dosagem de alaranjado de metila.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Água destilada
	1 frasco (pisseta)
	Alaranjado de metila (solução de referência – 10,0 mg/L).
Obs.: preparado em solução aquosa. TÉCNICO
	1 frasco (200 mL)
	Alaranjado de metila (solução de referência – 4,0 mg/L).
Obs.: preparado em solução aquosa. TÉCNICO
	1 frasco (200 mL)
	Amostra (solução de alaranjado de metila preparado pelo
grupo) na concentração de 4,0 mg/L
	1 frasco
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	Béquer (50 mL)
	1 unidade
	Tubos de ensaio
	11 unidades
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	
Espectrofotômetro
	1 aparelho para
cada 2 bancadas
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
	Micropipeta automática (1000 λL)
	1 unidade
	Ponteiras de 1000 λL
	10 unidades
	Balão volumétrico (50 mL)
	5 unidades
	Papel-absorvente
	1 unidade
	Cubeta de quartzo
	1 unidade para cada bancada
Observação: a solução de referência de alaranjado de metila (4,0 mg/L) e a solução de referência de alaranjado de metila (10 mg/L) deverão ser preparadas pelo técnico do laboratório dissolvendo a substância em água destilada.
OBJETIVO
Realizar os ensaios de precisão e exatidão para a validação parcial do método instrumental.
PARTE I: ENSAIO DE PRECISÃO E EXATIDÃO
1. Cálculo do teor a 80% da concentração da solução de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L.
Para analisar uma solução de alaranjado de metila com 80% da concentração da amostra preparada pelo aluno (4,0 mg/L) será necessário efetuar uma diluição da solução de referência (10 mg/L) de forma a se alcançar uma concentração igual a 3,2 mg/L. Para tanto, seguir o procedimento descrito a seguir.
a. Transferir 32 mL da solução referência (10,0 mg/L) para balão volumétrico de 100 mL.
b. Completar o volume com água destilada.
c. Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fa- zendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando água destilada para ajuste do zero (branco).
d. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir.
Tabela 1. Absorbância obtida pela leitura de solução de Alaranjado de Metila.
	Replicata (80% da concentração)
	Absorbância (A)
	1
	0,63
	2
	0,67
	3
	0,64
	Média
	0,64
	Concentração (mg/L)
	3,2 mg/L
2. Cálculo do teor a 120% da concentração da solução de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L.
Para se analisar uma solução de alaranjado de metila com 120% da concentração da amostra preparada pelo aluno (5,0 mg/L) será necessário efetuar uma diluição da solução de referência (10 mg/L) de forma a se alcançar uma concentração igual a 4,8 mg/L. Para tanto, seguir o procedimento:
a. Transferir 48 mL da solução referência (10,0 mg/L) para balão volumétrico de 100 mL.
 b. Completar o volume com água destilada.
c. Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fa- zendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando água destilada para ajuste do zero.
d. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir.
e. Utilizar a equação de reta (curva de linearidade para o alaranjado de metila) obtida para converter o valor para concentração de alaranjado de metila na solução.
 Tabela 2. Absorbância obtida pela leitura de solução de Alaranjado de Metila.
	Replicata (120% da concentração)
	Absorbância (A)
	1
	0,91
	2
	0,89
	3
	0,95
	Média
	0,91
	Concentração (mg/L)
	4,8 mg/L
3. Cálculo do teor a 100% da concentração da solução de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L.
Para se analisar uma solução de alaranjado de metila com 100% da concentração da amostra preparada pelo aluno (4,0 mg/L) será necessário utilizar a solução preparada pelo grupo e reservada em frasco âmbar. Para tanto, seguiro procedimento:
a. Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fa- zendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando água destilada para ajuste do zero.
b. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir.
c. Utilizar a equação de reta (curva de linearidade para o alaranjado de metila) obtida para converter o valor para concentração de alaranjado de metila na solução.
 Tabela 3. Absorbância obtida pela leitura de solução de Alaranjado de Metila.
	Replicata (100% da concentração)
	Absorbância (A)
	1
	0,792
	2
	0,797
	3
	0,791
	Média
	0,793
	Concentração (mg/L)
	4,8 mg/L
Aula 5. Análise por cromatografia em camada delgada. Análise cromatográfica de ácido acetilsalicílico e paracetamol. 
	EQUIPAMENTOS
	1 cuba cromatográfica a cada 3 grupos
	1 banho de aquecimento (40 ºC) a cada 3 grupos
	Lâmpada de UV
	REAGENTES
	50 mL solução de extração (25 partes de acetato de etila, 1 parte de etanol e 1 parte de
ácido acético) por grupo
	Ácido acetilsalicílico e paracetamol (1 comprimido triturado de cada medicamento) – 100
mg de cada substância (amostra)
OBJETIVO
Avaliar a separação de princípios ativos de ação analgésica pela técnica da CCD. Estudar o emprego de técnicas cromatográficas para separação e análise de substâncias em função de sua estrutura química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. Serão analisadas amostras de aspirina, paracetamol e coristina D.	
PROCEDIMENTO
 Parte 1: Preparação das amostras de analgésicos (técnico do laboratório)
Transferir para béquer, previamente, a amostra triturada de ácido acetilsalicílico e paracetamol (substância a ser analisada). Um béquer para cada amostra triturada.
1. EM CAPELA: a cada béquer, adicionar 10 mL de solução de extração.
2. Com auxílio de bastão de vidro, efetuar agitação.
3. Levar os béqueres a banho de água e deixar por 5 minutos em aquecimento moderado (40 ºC).
4. Aguardar a decantação das partículas insolúveis.
Parte 2: Análise cromatográfica
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (acetato de etila com 0,5% de ácido acético glacial). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Manter a cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm), efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da extremidade) indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto onde se indicará o final da corrida.
2. Utilizando um capilar, aplique duas porções de cada extrato sobre uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) a 1,0 cm de uma das extremidades.
3. Colocar cuidadosamente a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente.
4. Aguardar até que o solvente atinja cerca de 0,5 cm do topo da placa, remover a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
5. Para que seja possível a visualização na placa de sílica é necessário levar até uma lâmpada de UV (utilizar óculos de segurança e obedecer a todas as regras de segurança quanto ao uso desse tipo de lâmpada passadas pelo professor no momento da visualização).
6. Marcar, com auxílio de lápis, o ponto visualizado para cada analgésico após a corrida na placa de sílica.
 7. Com auxílio de régua, determinar a distância de cada ponto e calcular os valores de Rf.
8. Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha cromatográfica obtida.
9. Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
	Molécula
	Rf
	Paracetamol
	0,91
	Ácido acetilsalicílico
	0,85
 Aula 6. Cromatografia em Camada Delgada. Análise cromatográfica de pigmentos.
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE A CADA 3 BANCADAS
	Cuba
	2 (uma para a análise e uma para revelação com iodo)
	Chapa de aquecimento
	1 (manter na capela)
	Balança semianalítica
	1
	MATERIAIS
	QUANTIDADE POR GRUPO
	Béquer 50 mL
	2
	Erlenmeyer 125 mL
	2
	Funil para filtração
	1
	Funil de separação
	2
	Suporte
	1
	Garra
	2
	Pinça metálica
	1
	Bastão de vidro
	1
	Capilares
	2
	Papel de filtro
	2
	Placa cromatográfica
	1
	Hexano
	Para extração e preparo da cuba
	Acetona
	Para extração e preparo da cuba
	Iodo sólido
	Para revelação
	Pimentões (vermelho e amarelo)
	30 g de cada para extração
	Sulfato de sódio anidro
	----
	Papel para pesagem em balança
	2
	Espátula
	2
OBJETIVO
Avaliar a separação de pigmentos pela técnica da CCD. Estudar o emprego de técnicas cromatográficas para separação e análise de substâncias em função de sua estrutura química e do fenômeno de adsorção cromatográfica.
PROCEDIMENTO
Parte 1: Preparação do extrato (técnico do laboratório)
As etapas 1 a 11 serão executadas pelo técnico do laboratório a fim de permitir a visualização do resultado da análise no próprio dia da prática pelo aluno. A depender da disponibilidade de horário, poderá ser feita uma demonstração pelo professor das etapas de extração como forma de elucidar o procedimento.
1. Pesar cerca de 30 g dos pedaços (previamente cortados) de cada pimentão (verde, vermelho e amarelo) em béqueres diferentes.
2. Adicionar, com auxílio de proveta, 10 mL de acetona e 50 mL de hexano.
3. Transferir cada mistura separadamente para um almofariz com pistilo e macerar até obter uma pasta homogênea.
4. Deixar em repouso por 1 hora.
5. Filtrar e transferir para um funil de separação.
6. Separar a fase aquosa em um béquer.
7. Adicionar 15 mL de água destilada. Agitar suavemente para evitar formação de emulsão.
8. Separar e descartar a fase aquosa no béquer.
9. Transferir a fase orgânica para um Erlenmeyer de 125 mL.
10. Adicionar 2 g de sulfato de sódio anidro. Deixar em repouso por 5 minutos.
Filtrar em um béquer e concentrar os extratos até o volume de 1 mL através de aqueci- mento em manta a 70ºC.
Parte 2: Análise cromatográfica (grupo de alunos)
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (hexano com 5% de acetona). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Manter a cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm), efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da extremidade) indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto onde se indicará o final da corrida.
2. Utilizando um capilar, aplique o extrato concentrado de cada pimentão (em posições diferentes) sobre a placa de sílica na altura da marcação.
3. Colocar cuidadosamente a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente.
4. Aguardar até que o solvente atinja a segunda marcação do topo da placa (final da corrida).
5. Remover a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
6. Deixar secar ao ar por 5 minutos e observar o número de manchas coloridas formadas.
7. Se necessário, efetuar revelação com vapor de iodo: em uma cuba contendo iodo sólido (preparado 30 minutos antes do início da aula), acondicionar a placa de sílica por alguns minutos até observação de manchas escuras.
8. Efetuar o cálculo Rf para as manchas observadas:
Rf= 4,9/5,6
Rf= 0,875
DISCUSSÃO.
Têm-se três tipos de moléculas presentes no extrato de pimentão:
· Carotenoides
· Criptoxantinas
· Captoxantinas
Portanto, esperam-se, ao menos, três manchas como resultado da análise por CCD. Moléculas.
a. Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha cromatográfica obtida.
b. Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
	Molécula
	Rf
	Caroteno
	0,78
	Capsantina
	0,71
	Criptoxantina
	0,56
Aula 7. Análise por cromatografia em coluna de troca iônica. Hemoglobina glicada em amostras de sangue. 
	MATERIAIS POR GRUPO
	Coluna de separação para Hb-glicada (kit de glico-hemoglobina) – 1 unidade
	Tubos de ensaio grandes – 3 unidades
	Micropipeta (1000 microlitros) – 1 unidade
	Micropipeta (10 – 100 microlitros ou equivalente) – 1 unidade
	Ponteiras de 1000 microlitros
	Ponteiras de 100 microlitros ou equivalenteEQUIPAMENTOS
	Espectrofotômetro ( λ = 415 nm)
	Cubeta de quartzo – 1 unidade por equipamento
	REAGENTES POR GRUPO
	Água destilada
	Amostra de hemolisado – 100 microlitros (fracionado)
	Tampão de separação (frasco 1 – kit Labtest) – 5,0 mL (fracionado)
OBJETIVO
Avaliar a separação das frações de hemoglobina glicada e normal em coluna de troca iônica. Determinar a porcentagem de hemoglobina glicada em amostra de sangue.
PROCEDIMENTO
Parte 1: Preparação da amostra de hemolisado (executado pelo técnico do laboratório)
1. Pipetar em tubo de ensaio 1,0 mL de amostra de sangue total (coletado com EDTA) bem homogeneizado.
2. Centrifugar a 2000 RPM por 5 minutos. Retirar o plasma sem ressuspender as hemácias.
3. Adicionar 3,0 mL de NaCl (0,85%), homogeneizando o tubo.
4. Centrifugar e remover o sobrenadante sem ressuspender as hemácias.
5. Ressuspender as hemácias em 3,0 mL de NaCl (0,85%). Centrifugar e acertar o volume para a marca de 1,0 mL, retirando o excesso de sobrenadante.
6. Em um tubo de 12x75, adicionar 0,4 mL de solução hemolisante (Frasco 2 – kit) e 0,1 mL de amostra de hemácias.
7. Agitar vigorosamente por 20 segundos.
8. Aguardar 5 minutos para que ocorra a hemólise.
Parte 2: Preparação da coluna cromatográfica (executada pelo técnico do laboratório)
As etapas 1 a 5 deverão ser realizadas pelo técnico do laboratório no dia da prática para que seja possível realizar a separação cromatográfica e a análise espectrofotométrica pelo grupo de alunos. O grupo de alunos iniciará a prática a partir da etapa 6.
1. Nomear um tubo de ensaio como “tampão”.
2. Acomodar a coluna de Troca Iônica sobre esse tubo de ensaio e retirar a tampa su- perior da coluna.
3. Introduzir o bastão fazendo movimentos giratórios descendentes e ascendentes para ressuspender a resina (fase estacionária).
4. Remover a tampa inferior e acomodar novamente a coluna (verticalmente) sobre o tubo de ensaio “tampão”.
Obs.: não permita que a ponta da coluna encoste no líquido transferido para o tubo.
5. Aguarde que todo o líquido penetre no interior da resina (fase estacionária). Fechar a saída de eluente da coluna e aguardar o início da aula prática.
Parte 3: Análise cromatográfica (executada pelo grupo de alunos no dia da prática)
6. Adicione 0,05 mL (50 microlitros) de amostra de hemolisado sobre a resina (com cuidado para evitar formação de bolhas de ar).
7. Aguardar que o hemolisado penetre no interior da resina.
8. Transferir a coluna para um novo tubo de ensaio (enumerado como “1”).
9. Adicionar lentamente (com a adição pela parede da coluna) 3,5 mL de tampão (frasco 1 – kit).
10. Aguardar até que todo o tampão penetre no interior da resina.
11. Homogeneizar o líquido coletado no tubo “1”.
12. Enumerar outro tubo de ensaio (seco e limpo) como “2”. Adicionar a esse tubo 7,0 mL de água destilada e 0,02 mL (20 microlitros) de amostra de hemolisado. Homogeneizar.
13. Levar os tubos “1” e “2” para o espectrofotômetro, previamente ajustado em
λ = 415 nm, zerando com água destilada.
14. Efetuar a leitura das absorbâncias dos dois tubos (A1 e A2).
15. Efetuar o cálculo do teor de hemoglobina glicada na amostra de sangue:
% HbA1C = AbsxA1 x F
 AbsxA2
% HbA1C = 0,139 x 8,88
 0,973
%HbA1C = 0,14 x 8,88
%HbA1C = 1,24 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .
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COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATTO, P. S. (coords.). Introdução a métodos cromatográficos. 7. ed. Campinas: Unicamp, 1997.
GARCÍA, B. C. História da luminescência. Circumscribere, v. 12, p. 76-83, 2012. Disponível em: http:// ken.pucsp.br/circumhc/article/viewFile/13367/10197. Acesso em: 9 jan. 2020. GENTIL, V. Corrosão. 3. ed. São Paulo: LTC, 1994.
HAGE, D. S.; CARR, J. D. Química analítica e análise quantitativa. Tradução: S. M. Yamamoto. São Paulo: Pearson Prentice Hall, 2012.
HARRIS, D. C.; LUCY, C. A. Análise química quantitativa. 9. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2017.
MOTTA, V. T. Bioquímica. 2. ed. Rio de Janeiro: Medbook, 2011.
PRADO, A. G. S.; FARIA, E. A.; PADILHA, P. M. Aplicação e modificação química da sílica gel obtida de areia. Química Nova, v. 28, n. 3, p. 544-547, 2005. Disponivel em: http://static.sites.sbq.org.br/ quimicanova.sbq.org.br/pdf/Vol28No3_544_29-ED03324.pdf. Acesso em: 21 jul. 2020.
REMIÃO, J. O. R. et al. Bioquímica: guia de aulas práticas. Porto Alegre: PUCRS, 2003.
SANTOS, M. T. et al. Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG-EM) e suas diversas aplicações. Anais do I Congresso Brasileiro de Ciências da Saúde, v. 1, 2016.
Absorbância (A)
do Alaranjado de Metila.
A (nm)	y = -0,0039x + 2,3401
R² = 0,4841
400	410	420	430	440	450	460	465	470	480	490	500	510	520	530	540	550	560	0.42099999999999999	0.50600000000000001	0.57999999999999996	0.64	0.70499999999999996	0.754	0.79	0.79400000000000004	0.78800000000000003	0.73799999999999999	0.63900000000000001	0.51700000000000002	0.374	0.24199999999999999	0.14000000000000001	0.16800000000000001	2.5000000000000001E-2	2E-3	
Absorbancia(465nm)
 Absorbância(465nm)	y = 0,0348x - 0,0069
R² = 0,9985
1	2.5	5	8	10	2.1000000000000001E-2	8.5999999999999993E-2	0.17100000000000001	0.27100000000000002	0.33900000000000002