Atividade Sequenciamento de novo

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INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA
 Christian Cortez
 Felesmar Rodrigues de Souza Oliveira
Kauan Cristiano de Souza
Sequenciamento de novo
Atividade apresentado junto à disciplina de proteômica, ministrada pelo Prof. Dr. André Zelanis.
São José dos Campos
2021
1. Introdução
Proteínas são macromoléculas que desempenham papeis fundamentais dentro dos organismos, tais como catabolismo e anabolismo de biomoléculas, mecanismos envolvidos na replicação do DNA e na síntese proteica, transporte de moléculas entre outros. Muitas proteínas tem função estrutural e mecânicas, como as que compõem o citoesqueleto, já outras estão envolvidas em vias de sinalização para respostas imunológicas contra patógenos (NELSON & COX, 2014). Contudo, essas biomoléculas são primordiais para o entendimento da biologia de um organismo bem como a sua função no mesmo, sendo possível ter um maior entendimento do funcionamento das vias do organismo e por consequência entender com maior clareza distúrbios que acarretam no desenvolvimento de doenças, elucidar mecanismos de evasão do sistema imune, composição proteica utilizada por patógenos para infectar células entre outras (NELSON & COX, 2014). Além do contexto biológico e suas áreas complementares, diversas biomoléculas tem uma grande aplicação em biotecnologia e no ramo farmacêutico por exemplo para o desenho e desenvolvimento de fármacos que atuem em vias metabólicas especificas, insumos biotecnológicos, etc.
Para se determinar a sequência de aminoácidos de uma macromolécula e aplicado metodologias de sequenciamento de proteínas, sendo as principais a degradação de Edman(EDMAN,1949) e a espectrometria de massas (HOFFMANN; & STROOBANT,2007). O presente trabalho ira discorrer com maior riqueza de detalhes a espectrometria de massas, sendo a mesma a técnica utilizada neste trabalho. A espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica que consiste na criação de íons de compostos orgânicos por um método especifico para cada técnica, onde ocorre a separação com base na razão massa e carga e posteriormente ocorre a detecção qualitativa e quantitativa com base em sua taxa da razão massa e carga e sua abundancia respectivamente (HOFFMANN; & STROOBANT,2007. As proteínas antes de serem submetidas a análise por espectrometria de massas, é realizado uma proteólise mediada por proteases, tais como a tripsina e pepsina, e um tratamento com agente desnaturantes para clivar pontes de dissulfeto e evitar o reestabelecimento da mesma e a separação dos fragmentos é normalmente feita por cromatografia liquida (CANTU et al.,2008). Essa analise resulta em um espectro de massa com diferentes picos e com técnicas de sequenciamento de novo é possível determinar a sequência de aminoácidos. No presente trabalho será realizado a análise de um espectro de massas levando em consideração as series -b e a serie complementar –y para determinar a sequência de aminoácidos do peptídeo.
2. Metodologia aplicada
Os dados e o material base utilizados nessa analise foram fornecidas pelo professor. Assim foi realizado analise do espectro 4, cujo Scan era 4654.Os dados estavam contidos em um arquivo “OB_ANDRE_20120830_1.raw” e foram lidos utilizando a ferramenta SeeMS (ZELANIS,2021). O espectro que será analisado esta mostrado abaixo.
O espectro estudado é oriundo de uma análise de espectrometria de massas de veneno de cobra. Esse veneno foi submetido a uma proteólise mediada por tripsina e também foi tratada com iodoacetamida para quebra das pontes de dissulfeto e também para o não reestabelecimento das mesmas (ZELANIS,2021). Para identificar quais aminoácidos compõem o peptídeo, vale discorrer que a tripsina cliva a jusante de lisina e arginina, mostrando assim que os fragmentos que se encontram entre o início e fim tem em sua composição lisina e arginina. No sequenciamento serão usadas como base a série –b e a complementar –y. Nesse tipo clivagem enzimática, os aminoácidos na região C-terminal são a lisina ou a arginina e também ocorre um incremento em sua massa de 19 Da, devido a adição de um H20+H, e na região N-terminal são os aminoácidos leucina ou isoleucina e também ocorre incremento de 1 Da, proveniente de H, esses aminoácidos são denotados como íons diagnósticos (CANTU et al,2008) . A um incremento de massa de 57 Da no aminoácido cisteína por conta do tratamento com iodoacetamida (ZELANIS,2021). A massa do peptídeo é de 1114,6 Da e a série –b e –y se iniciam do N-terminal e C-terminal respectivamente. O sequenciamento de novo será feito utilizando a série –y, pois em clivagens trípticas os fragmentos da série –y geralmente apresentam maior intensidade e a metodologia usada será identificar picos correspondentes aos íons diagnósticos e partir desse pico fazer a diferença entre o mesmo e o pico subsequente e com diferença será possível identificar a quais aminoácidos o pico corresponde e posteriormente será feito o mesmo procedimento com a série –b para verificação e identificação de possíveis erros.
3. Resultados
Utilizando a estratégia acima abordada foi obtido a sequência de aminoácidos KML/INVMQHL/I. Abaixo é mostrado os picos utilizados e as aminoácidos identificados e também sua sequência de aminoácidos da série—y e a sequência complementar.
Com a sequência já determinada foi utilizado novamente o SeeMS e foi realizado uma anotação mostrando a série de íons –b e –y, conforme mostrado na imagem abaixo:
4. Considerações finais
Calculando a massa da sequência determinada se obtêm um valor muito próximo ao valor observado e devido a massa muito próxima dos aminoácidos leucina e isoleucina não foi possível determinar com precisão qual aminoácidos estava presente na constituição do peptídeo e por conta disso os aminoácidos foram representados pela letra X. Com a metodologia apresentada no material base foi possível determinar com grande precisão a sequência. Primeiramente foi determinado a série de íons –y e como a série –b e complementar foi possível verificar que a sequencias estavam coerentes. Entretanto, é ideal realizar analise com demais series para confirmar que a sequência está correta e por fim, conclui-se que o presente trabalho obteve um resultado satisfatório.
5. Referencias
CANTU, M.D. et al. Seqüenciamento de peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático. São Paulo: Química Nova,2008.
EDMAN; P.A. Method for the determination of amino acid sequence in peptides. Arch Biochem. 1949.
HOFFMANN; E.; STROOBANT; V. Mass Spectrometry Principles and Applications. England:WILEY,2007.
NELSON, D.L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. São Paulo: ARTMED, 2014.
ZELANIS; A. Interpretando espectros de MS/MS. São José dos Campos: Tutorial,2021.