UNIDADE 3

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UNIDADE 3. 
Pirogênios e toxicidade de microrganismos 
 
Fernanda Waitman 
OBJETIVOS DA UNIDADE 
 
 Diferenciar os testes de pirogênios in vitro e in vivo; 
 Compreender a importância de detectar endotoxinas em medicamentos; 
 Conhecer os procedimentos de Draize; 
 Entender o conceito de toxicidade. 
 
TÓPICOS DE ESTUDO 
 
Pirogênios in vitro 
– 
// Bactérias Gram-negativas e Gram-positivas 
// Tipos de pirogênios 
// Procedimento de gelificação 
 
Pirogênios in vivo 
– 
// Procedimento in vivo 
// Fonte de pirogênios 
// Despirogenização 
 
Toxicidade 
– 
// Testes de toxicidade aguda 
// Testes de toxicidade subcrônica e crônica 
// Procedimento de Draize 
 
Pirogênios in vitro 
Seção 2 de 4 
 
O termo pirogênio é relativamente novo, 
tendo começado a ser estudado mais 
profundamente há cerca de cinquenta 
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anos. Contudo, existem relatos nas 
literaturas antigas de que dois mil anos 
atrás já se faziam experimentos com 
substâncias que induziam febre nos 
seres humanos. 
Entendia-se que a febre era, principalmente, um mecanismo terapêutico, sendo 
tratada dessa forma durante muitos anos, ao ponto de se induzí-la por meio de 
injeções com substâncias específicas, para tratar diferentes patologias. 
Contudo, a partir do século XIX, a temperatura corporal alta começou a ser vista 
com outros olhos. Houve a isolação de produtos classificados 
como antipiréticos, utilizados para baixar a temperatura do corpo. Assim, um 
estudioso chamado Billbroth foi o primeiro a usar o termo pirogênio para 
conceituar substâncias capazes de induzir a febre. Com o avanço da ciência, 
foram isolados produtos, liberados por bactérias, capazes de fazer com que a 
temperatura do corpo se elevasse acima do aceitável, classificados como 
pirogênios. 
Os produtos mais conhecidos como pirogênios são as endotoxinas, excretadas 
por bactérias como, principalmente, as Gram-negativas. Embora toda 
endotoxina seja um pirogênio, nem todo pirogênio é uma endotoxina. Dito isso, 
o conceito mais atualizado é que qualquer tipo de substância proveniente de 
injetáveis contaminados, capazes de desenvolver um quadro febril, bem como 
infecções causadas por bactérias Gram-negativas, é classificado como 
pirogênio. 
BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS E 
GRAM-POSITIVAS 
 
Antes de aprofundarmos o estudo sobre os pirogênios propriamente ditos, 
devemos diferenciar as bactérias Gram-positivas das Gram-negativas. Na 
Figura 1, podemos ver essas duas bactérias, que apresentam suas principais 
diferenças na quantidade de camadas que possuem em volta de si mesmas. Em 
roxo-azulado, temos a bactéria Gram-positiva e, logo ao lado, um esquema das 
camadas existentes ao seu redor, salientando que, de cima para baixo, podemos 
ver da camada mais interna para a mais externa. 
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Figura 1. Comparação bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Fonte: Shutterstock. 
Acesso em: 07/11/2020. 
 
CURIOSIDADE 
Essas bactérias são denominadas Gram-positivas e Gram-negativas, 
pois, durante o processo de cultivo microbiológico, para determinar que 
tipos de bactérias estão presentes, é realizado um procedimento 
chamado coloração de Gram. Devido à diferença nas camadas 
existentes em volta de cada uma, após a coloração, a Gram-negativa 
fica com a coloração rosa/vermelha, enquanto a Gram-positiva pode ser 
visualizada em um tom roxo-azulado. 
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Logo, podemos observar que a bactéria Gram-positiva possui três camadas, 
sendo a mais profunda, ou mais próxima do citoplasma, a chamada membrana 
plasmática, conhecida por estar presente em todas as células vivas, com o 
propósito de selecionar a entrada e a saída de substâncias do meio intracelular 
e extracelular. Em seguida, existe um espaço, mais fino quando comparado aos 
outros, denominado espaço periplasmático e, por último, já na parte mais 
externa e em contato com o líquido extracelular, temos a camada de 
peptideoglicanos. 
Ainda na Figura 1, em vermelho, temos a bactéria Gram-negativa, que possui 
duas camadas a mais do que as Gram-positivas. Além de apresentar uma 
membrana plasmática, um espaço periplasmático e uma camada de 
peptideoglicanos (que é mais fina nas Gram-negativas), essas bactérias também 
apresentam mais um espaço periplasmático e uma membrana externa, em 
contato com o líquidoextracelular. 
Assim, as bactérias Gram-negativas causam doenças mais graves que as Gram-
positivas, devido a elas possuírem uma cápsula protetora, em volta das suas 
membranas, que faz com que as células de defesa do organismo não consigam 
atacar, dificultando o combate a elas. Logo, a membrana externa tem 
propriedades que favorecem a resistência desse tipo de bactéria a antibióticos 
como a penicilina, além de produzir substâncias pirogênicas, quando atacada. 
TIPOS DE PIROGÊNIOS 
 
Na indústria farmacêutica, é obrigatório, 
dentro do controle de qualidade, que os 
medicamentos injetáveis passem pelo teste 
de pesquisa de pirogênio, visto que esse tipo 
de substância pode causar danos nos vasos 
sanguíneos, além de outras complicações, 
podendo levar à morte. 
Desse modo, existem dois tipos de pirogênios, com base no local de formação 
da endotoxina, que são: 
 
EXÓGENO 
O exógeno, que é formado fora do corpo (Figura 2). Em geral, ele usa uma via 
de administração parenteral contaminada para entrar no corpo do animal; 
 
ENDÓGENO 
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https://sereduc.blackboard.com/courses/1/7.5152.61892/content/_4392009_1/scormcontent/index.html
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O endógeno, que é formado dentro do próprio corpo. Foi descoberto 
após alguns experimentos de cientistas que perceberam que o aumento 
de temperatura poderia ser uma forma de mecanismo de defesa do 
organismo. 
 
Figura 2. Molécula de endotoxina de lipopolissacarídeo (LPS, lipídeo A e fragmento de 
núcleo interno) de E. coli. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 07/11/2020. 
Assim, detectou-se que células do sistema hematopoiético, como, por exemplo, 
os leucócitos polimorfonucleares produziam pirogênios endógenos, que tinham 
como finalidade elevar a temperatura corporal. Ambos tipos de pirogênios 
podem induzir a produção de uma molécula chamada de prostaglandina, que 
tem sua ação bloqueada por fármacos responsáveis por baixar a temperatura 
corporal, conhecidos como antitérmicos ou antipiréticos, sugerindo uma 
interligação entre essas substâncias. Assim, podemos listar dois tipos de testes 
mais comumente utilizados para detectar a presença de pirogênios: 
 bullet 
O teste de pirogênio in vivo, também chamado de teste em coelhos; 
 bullet 
O teste de pirogênios in vitro, também conhecido como teste de endotoxina bacteriana, 
ou, ainda, lisado de amebócito do limulus (LAL). 
O teste in vitro é realizado em laboratórios específicos, sem a participação de 
animais vivos. Esse teste passou a ser denominado lisado de amebócito do 
limulus (LAL), pois, no fim do século XIX, cientistas perceberam que, quando 
o sangue de um caranguejo da espécie Limulus polyphemus (Figura 3) era 
retirado de seu corpo, ocorria uma coagulação, passando a apresentar uma 
consistência de gelatina. 
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Figura 3. Caranguejo-ferradura. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 07/11/2020. 
 
ASSISTA 
Para que melhor entendamos a importância dessa espécie de caranguejo 
para a vida humana, o documentário Caranguejos-ferradura (também 
conhecido como Límulo), do canal Vídeos da década de 2000, no 
YouTube, mostra o habitat natural desses animais e traz informações 
interessantes, abordando outros estudos realizados com essa espécie, 
que contribuiu para a evolução do ser humano. 
Desse modo, estudando mais a fundo, os pesquisadores descobriram que 
circulava na corrente sanguínea dos caranguejos apenas uma célula, conhecida 
como amebócito. Além disso, algumasbactérias Gram-negativas acometiam 
esses animais e os matavam, pois induziam uma coagulação intravascular neles. 
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Para descobrir exatamente como isso acontecia, os pesquisadores 
desenvolveram um teste experimental que comprovou que a presença dos 
amebócitos era responsável por reagir com a endotoxina liberada pelas bactérias 
Gram-negativas e mudar a consistência do sangue. Assim, com o passar dos 
anos, cientistas foram estudando e aprimorando a técnica LAL, que consiste 
em: 
Extrair o sangue 
– 
Extrair o sangue do caranguejo por meio de um procedimento chamado 
de sangria, pela introdução de uma agulha estéril entre a musculatura 
do animal; 
Misturar o sangue 
– 
Misturar o sangue com produtos anticoagulantes, a fim de evitar a 
coagulação precipitada do material; 
Centrifugar o sangue 
– 
Centrifugar o sangue e, em seguida, desprezar as substâncias que 
ficarem na superfície; 
Realizar a lavagem 
– 
Realizar a lavagem dos amebócitos e a retirada do anticoagulante com 
solução de soro fisiológico; 
Introduzir água destilada 
– 
Introduzir água destilada para o rompimento das membradas celulares e 
a liberação dos produtos intracelulares no meio; 
Liofilizar a solução 
– 
Liofilizar a solução e armazenar. 
Desse modo, a técnica de LAL, ou in vitro, foi constantemente atualizada e 
levada para dentro dos laboratórios de controle de qualidade das indústrias, com 
o objetivo de detectar a presença de endotoxinas em amostras. 
PROCEDIMENTO DE GELIFICAÇÃO 
 
Um dos métodos mais simples e utilizados para identificar a presença de 
endotoxinas utilizando a técnica do LAL é chamado de ponto final de 
gelificação e pode ser dividido em duas fases. A primeira, denominada teste-
limite, apenas detecta se a quantidade de endotoxina presente na amostra está 
acima ou abaixo dos valores de referência, ou seja, se está dentro dos limites 
pré-determinados. A segunda fase é chamada de teste semiquantitativo e torna 
possível quantificar os valores de endotoxinas por método geométrico, após 
repetidas diluições. 
Esse procedimento consiste em colocar a endotoxina em contato com o meio 
de cultura LAL, para que, assim, ocorra o processo de coagulação do sangue do 
caranguejo. No Diagrama 1, podemos ver um esquema de como a endotoxina 
age quando entra em contato com esse tipo de substância, sendo responsável 
pela transformação de uma pró-enzima – ainda inativa – em uma enzima 
ativada. Essa, por sua vez, faz com que o coagulogênio, também em uma forma 
inativa, se transforme em sua forma ativa, chamada de coagulina, fazendo com 
que ocorra a formação do gel. 
Diagrama 1. Cascada de gelificação. 
Por meio do teste, é possível garantir que haja a presença de endotoxinas 
bacterianas, liberadas por bactérias Gram-negativas. Assim, quanto mais 
espesso o gel ficar, maior a quantidade de toxina presente na amostra. A 
diluição desse gel com a substância de amostra já introduzida, por sua vez, 
permite quantificar os valores existentes de endotoxinas. 
Contudo, esse método de ponto final de gelificação apresenta desvantagens, 
como a incapacidade ou a pouca capacidade de detectar a presença de 
endotoxinas quando a quantidade está muito baixa. Dessa forma, existem outros 
meios mais sensíveis, como o ensaio turbidimétrico, que é capaz de medir 
mais precisamente a quantidade de endotoxina, por meio da turbidez da 
amostra, causada pela precipitação de proteínas. 
 
VAMOS REFORÇAR O QUE 
APRENDEMOS ATÉ AGORA? 
 
As bactérias Gram-negativas tendem a ser mais patogênicas que as 
Gram-positivas, principalmente porque, quando se sente ameaçada, a sua 
camada externa libera uma substância chamada: 
Conforme visto no tópico “Pirogênios in vitro”, as bactérias Gram-
negativos têm o mecanismo de liberação de substâncias que causam 
febre, chamadas de endotoxinas. Nesse caso, sua camada mais 
próxima do meio extracelular libera esses produtos pirogênicos, 
que são soltos para o meio, causando danos no indivíduo infectado. 
 
 Pirogênios in vivo 
 
As endotoxinas são os pirogênicos mais estudados na indústria farmacêutica, 
pois existe a preocupação de evitar sua presença em soluções injetáveis, 
vendidas para a utilização em seres vivos. Esses compostos possuem alto peso 
molecular, sendo encontrados na camada externa de bactérias Gram-negativas 
e, quando purificados, passam a ser chamados de lipopolissacarídeos (LPS), 
devido à sua constituição química. Podemos observar, na Figura 4, o esquema 
das membranas que envolvem a bactéria Gram-negativa, com ênfase nos 
compostos presentes no LPS. Assim, podemos dividi-la em três partes: 
 Lipídeo A, que quefica entre os fosfolipídeos da membrana externa; 
 Polissacarídeo central, como se fosse a parte inicial da cauda; 
 Polissacarídeo-O 
Figura 4. Camadas da parede celular da bactéria Gram-negativa com ênfase no 
lipopolissacarídeo. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 09/11/2020. 
 
O lipídeo A é uma parte com característica hidrofóbicas e bem parecidas em 
todas as bactérias que possui o LPS, já a parte de polissacarídeos é mais variável 
em sua constituição. O oligossacarídeo, encontrado na porção final do 
polissacarídeo-O e voltado ao meio extracelular, é responsável pela 
especificidade do lipopolissacarídeo. Desse modo, as cadeias que formam essas 
estruturas têm sequências diferentes entre os açúcares, os lipídeos e as proteínas 
que a compõem. Isso permitiu que os pesquisadores descobrissem variedades 
de espécies de bactérias, como as Salmonellas. 
PROCEDIMENTO IN VIVO 
Na primeira metade do século XIX, ficou determinado que o teste de pirogênio 
em medicamentos administrados por via parenteral era fundamental. 
 
Na época, não se conheciam as 
endotoxinas tão a fundo como hoje em 
dia, contudo, os efeitos adversos que 
ocorriam em muitos pacientes 
apontaram para a necessidade de 
estudos mais completos. Assim, 
amostras de soluções contaminadas 
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foram aplicadas em coelhos, havendo 
o aumento da temperatura desses 
animais. Desse modo, começaram os 
experimentos mais aprofundados sobre 
o assunto. 
Desde então, pouca coisa mudou nesses estudos, que não são sensíveis em 
indicar a quantidade de endotoxina, mas lembram um teste-limite, 
determinando se há ou não a presença de endotoxinas. Uma das mudanças que 
aconteceram foi a quantidade de animais testados, visto que, quanto mais testes 
forem realizados, menor a chance de desvio de resultado. Assim, um aumento 
de 0,5 °C, em média, de todos os animais testados, já permite que se considere 
a presença de endotoxinas na amostra injetada. 
Na Figura 5, podemos observar como são realizados esses experimentos, sendo 
os coelhos colocados em aparatos específicos, chamados de contendores, para 
imobilizar a região cervical e impedir que eles se locomovam, e o profissional 
injeta a substância em umas das orelhas do animal. Nesse mesmo contexto, é 
aferida a temperatura, após o tempo pré-determinado. Isso pode ser feito por 
via retal, sendo o termômetro introduzido por cerca de 7 cm no reto do animal, 
de acordo com a farmacopeia. Todos os materiais utilizados devem ser, 
obrigatoriamente, despirogenizados e calibrados, a fim de garantir os resultados 
obtidos. 
 
Figura 5. Aplicação de substância em coelhos para teste in vivo. Fonte: Shutterstock. 
Acesso em: 10/11/2020. 
O coelho foi o animal escolhido nesse caso devido à semelhança em relação 
aos termorreceptores dos seres humanos. Visto que a diferença de peso entre 
as duas espécies deve ser levada em consideração, utilizam-se coelhos adultos. 
Contudo, os resultados obtidos são averiguados e uma equivalência de dose e 
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peso é feita, para comparar como seria a resposta do ser humano à mesma 
substância. 
Nesse tipo de teste, é permitido que o animal seja reutilizado, desde que seja 
obedecida as normas entre uma inoculação e outra. Assim, animais que não 
tiveram reação podem passar pornovos testes após dois ou três dias, enquanto 
os que tiveram têm que aguardar de duas a três semanas para passarem por 
novos procedimentos. Isso ocorre até que os animais se tornem resistentes ou 
morram. 
FONTES DE PIROGÊNIOS 
 
Desde que os testes de pirogênio começaram a ser aplicados, não havia valor 
exato que seria aceitável para reprovar ou aprovar um medicamento. Assim, 
quando resolveram quantificar, foram colocados valores muito altos, 
permitindo que grandes quantidades de endotoxinas fossem liberadas em 
medicamentos. Com o avanço dos experimentos, a U.S. Food and Drug 
Administration (FDA), agência reguladora americana, determinou valores 
aceitáveis, de acordo com os produtos estudados (Tabela 1). 
Tabela 1. Valores limites de endotoxinas em produtos específicos, segundo a FDA. 
Muito se fala nas endotoxinas, já que são as mais comumente encontradas com 
ação pirogênica. Contudo, é importante comentarmos de outros tipos, que 
também podem causar danos, como, por exemplo, as cepas de estreptococos 
do grupo A, que possuem exotoxinas que causam vermelhidão da pele e 
aumento da temperatura corpórea, chegando a causar choques e podendo levar 
o ser humano à morte. Quando submetidos a testes in vitro, como o LAL, elas 
causam gelificação no meio muito mais consistente do que no caso da ação das 
endotoxinas. 
Outra bactéria conhecida pelo seu efeito pirogênico é a Mycobacterium 
tuberculosis, responsável por desenvolver a patologia conhecida 
como tuberculose. O aumento de temperatura se deve pela ação de fagócitos, 
além da reação sistêmica, ou seja, que engloba o corpo como um todo. Vale 
salientar que os pirogênicos não são exclusividade de bactérias. Existem vírus 
e fungos que podem causar febre em seres humanos, porém, os testes in vivo 
realizados em coelhos não foram totalmente esclarecedores para compreender 
o mecanismo de ação desses tipos de microrganismos. 
 
EXPLICANDO 
Células fagocitárias são responsáveis por, entre outras funções, 
englobar microrganismos estranhos presentes no corpo, formando uma 
bolsa e causando sua destruição, jogando enzimas que vão digerí-los e 
eliminá-los. As células de defesa, como os leucócitos, são classificadas 
como fagocíticos, uma vez que usam esse mecanismo para defender o 
organismo de patógenos. Além disso, existem estudos que estabelecem 
que esse tipo celular está envolvido no mecanismo de pirogênios, 
participando do processo de aumento de temperatura corporal. 
DESPIROGENIZAÇÃO 
 
Existem diferentes formas de 
despirogenização, relacionadas à 
inativação e à remoção da molécula 
LPS da parede celular das bactérias, de 
modo que a destruição, total ou parcial, 
ou a inativação dos sítios ativos podem 
fazer com que a amostra seja 
classificada como apirogênica. 
Assim, devemos entender alguns dos mecanismos capazes de cumprir essa 
função, começando pelos meios adequados para inativar o lipopolissacarídeo. 
A hidrólise acidobásica atua no lipídeo A, realizando sua inativação e, desse 
modo, impedindo a ação biológica do LPS. Assim, ela impede a movimentação 
de substâncias entre a membrana, visto que essa parte da molécula é responsável 
pelo transporte aquoso de substâncias. A hidrólise ácida ocorre pela 
incorporação de ácido clorídrico (HCL), por 30 minutos, a 100 °C, enquanto na 
alcalina age o hidróxido de sódio (NaOH) pelo processo de saponificação, por 
1 hora, a 50 °C. 
A oxidação foi descoberta no começo do século XX, quando a água oxigenada 
foi incorporada à solução com as endotoxinas, e, assim, a perda de função 
pirogênica é percebida. A ideia é que essa substância inative o lipídeo A, por 
oxidação dos ácidos graxos. Contudo, há vantagens e desvantagens: a facilidade 
de utilização do peróxido de hidrogênio, tanto para adicionar como eliminar da 
amostra, é uma vantagem, mas ele pode oxidar outras substâncias presentes, o 
que pode atrapalhar na função geral do produto farmacêutico. 
A alquilação, geralmente, é feita com a utilização de óxido de etileno, que se 
incorpora em uma ligação presente no lipídeo A, fazendo com que perca sua 
função. Também existe o processo por radiação ionizante, que tem como 
mecanismo de ação física e biológica a mudança da conformação das 
endotoxinas, que, consequentemente, perdem a função. Contudo, os riscos de 
contaminação são maiores do que os benefícios de despirogenização por esse 
tipo de mecanismo. 
Por fim, temos o processo térmico, comumente o mais utilizado em produtos 
que não são sensíveis à temperatura, conhecidos como termolábeis. Nesse caso, 
utiliza-se o calor seco, dentro de estufas, podendo ser colocados tanto a 
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substância, como frascos de vidro e plástico, resistentes ao calor. Dependendo 
do tipo de endotoxina que se quer inativar, utiliza-se uma temperatura e tempo 
adequados, lembrando que alguns tipos são mais resistentes que outros. 
 
Até aqui, exploramos os mecanismos capazes de inativar a ação de endotoxinas. 
Agora, poderemos conhecer os meios de remover tal composto da amostra em 
questão. Um dos mais básicos é a lavagem, geralmente utilizada em locais 
sólidos, como superfícies, em que, para realizar o procedimento, se utiliza água 
de injeção estéril. 
Destilação 
– 
Ainda dentro de meios simples para eliminação de endotoxinas, temos 
a destilação (Figura 6), na qual acontece a mudança de estado físico da 
substância. Primeiramente, a substância é fervida, até que se evapore, e, em 
seguida, ela passa por um condensador, voltando ao seu estado líquido. Desse 
modo, as moléculas de lipopolissacarídeos são grandes o suficiente para não 
conseguirem evaporar e, assim, se mantêm na primeira fase líquida. 
Ultrafiltração 
– 
A ultrafiltração também pode ser eficiente para eliminar as endotoxinas, que 
utiliza membranas de filtração com poros menores que a endotoxinas, para que 
haja eficiência no processo. Em casos em que as moléculas sejam muito grandes 
e dificultem a filtração, pode-se incorporar um agente que as quebre, mas que 
ainda as mantenha em tamanhos maiores que o poro da membrana. 
Osmose 
– 
A osmose ocorre quando existe diferença de concentração entre dois meios, ou 
seja, há uma membrana que separa duas soluções, sendo uma mais concentrada 
e a outra menos concentrada. Um exemplo simples e didático seria quando uma 
membrana semipermeável separa um litro de água com 500 mg de sal de 
cozinha diluído (muito concentrado) de outra solução, com apenas 100 mg de 
sal. Assim, as soluções tendem a se manter em equilíbrio, isto é, a água migra, 
de forma passiva (naturalmente), do lado com menor quantidade de sal para o 
lado com maior concentração, com o intuito de deixar o meio mais diluído e, 
assim, igualar as concentrações. 
Osmose reversa 
– 
Dito isso, podemos conceituar a osmose reversa, em que a água fará o trajeto 
inverso, indo do meio mais concentrado para o menos concentrado, ao contrário 
da osmose normal. Contudo, para que isso ocorra, é necessário que seja 
realizado uma pressão (Figura 7), pois não será um processo natural, mas, sim, 
forçado. Desse modo, é realizada uma pressão em cima da solução que pretende 
ser despirogenizada, forçando-a a passar pela membrana semipermeável, cujo 
tamanho dos poros é menor que as endotoxinas, impedindo que essas moléculas 
passem para o outro lado. 
 
Fig. 6 Destilação 
 
Fig. 7 Osmose Reversa 
VAMOS REFORÇAR O QUE APRENDEMOS 
ATÉ AGORA? 
 
De acordo com a tabela de valores de limite de endotoxinas permitidas em 
produtos farmacêuticos, relacione as colunas a seguir: 
“Fontes de pirogênios”, existe uma diferença entre os limites 
máximos aceitáveis de endotoxinas em tipos de substâncias 
especificas. Assim, por exemplo, os radiomarcadores podem 
possuir até 2,5 UE/kg, enquanto a água para injeção pode ter, no 
máximo, 0,25 UE/mL de endotoxinas presentes e, por fim, as drogas 
intratecais só chegam até 0,2 UE/mL.Toxicidade 
Seção 4 de 4 
 
Quando classificamos uma substância como 
tóxica, estamos dizendo que ela é capaz de 
causar danos, de alguma forma. Em outras 
palavras, quando valoramos o quão danoso 
um produto é para o ser vivo, estamos 
estimando a sua toxicidade. Assim, a 
presença de pirogênios e outras substâncias 
nocivas faz parte do nível de toxicidade que 
pode ser encontrado em medicamentos. 
Para garantir que um fármaco não tenha possibilidade de intoxicar os seres 
vivos que o usarão, é necessário que ele passe por todo o processo de garantia 
de qualidade e esteja dentro das especificações já estabelecidas pelas agências 
de saúde. Assim, é necessário que se faça tanto o teste in vitro como o in vivo, 
sendo que a quantidade de animais utilizados, diferentemente dos testes para 
pirogênio, deve ser a menor possível, entre 5 e 15 animais. 
Ainda existe muita controvérsia em utilizar animais de laboratório, sejam 
coelhos ou camundongos, a fim de administrar substâncias potencialmente 
tóxicas. As especificações descrevem que não se deve levar o animal ao 
sofrimento durante os experimentos. Além disso, devido à necessidade de que 
os animais sejam sacrificados após os testes, muito já se falou sobre a proibição 
dos testes in vivo. Contudo, eles ainda são considerados fundamentais para 
garantir a segurança do ser humano. 
TESTES DE TOXICIDADE AGUDA 
 
Os produtos passíveis de teste de toxicidade são os medicamentos de origem 
sintética e biológica, bem como os correlatos (material plástico e as embalagens 
de acondicionamento), as matérias-primas, os produtos acabados, os 
cosméticos e os produtos de higiene em geral. Esses devem passar tanto pelo 
teste in vitro como pelo teste in vivo. De modo que, para analisarmos os 
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diferentes riscos que esses agentes tóxicos podem trazer para o ser vivo, os 
testes de toxicidade focam na maneira que essas substâncias podem se 
desenvolver e o tempo de exposição necessário para causar danos. Assim, 
podemos classificá-las em aguda, subcrônica e crônica. 
Os experimentos práticos e teóricos da toxicidade buscam informar, bem como 
ter como referência, o que conhecemos como dose letal mediana, 
representados pela sigla , que significa que a dose utilizada foi capaz de matar 
50% dos animais que foram testados. Na Figura 8, podemos observar um 
gráfico ilustrativo que mostra as doses utilizadas em testes e que mataram 50% 
da população estudada, isto é, quanto maior o valor da escala, maior a potência 
de causar danos no ser humano. 
Figura 8. Exemplo de dose letal mediana de algumas substâncias. Fonte: Wikimedia Commons. 
Acesso em: 13/11/2020. 
A toxicidade de um produto também está relacionada à quantidade utilizada, 
pois a grande maioria das substâncias encontradas no planeta têm um nível de 
toxicidade. Assim, a diferença entre o que faz bem e o que faz mal está na dose. 
Para avaliar a toxicidade aguda de produtos, existem algumas especificações 
para separar qual tipo de produto deve ser testado. 
Em se tratando de correlatos, por exemplo, observa-se o tempo de 
utilização do produto, sendo considerado de curto prazo quando dura de 60 
minutos a um mês de contato, e de longo prazo quando dura mais de 30 dias. 
Quando o quesito é avaliar a exposição direta do corpo humano a esse material, 
podemos classificar em: 
 
Limitado:Quando a exposição é de menos de 24 horas; 
 
Prolongado: Quando a exposição é entre 24 horas e 30 dias; 
 
Permanente: Quando a exposição é de mais de 30 dias. 
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De modo que, para a determinação do DL50 em ensaios de toxicidade aguda, são 
necessárias 24 horas de teste, enquanto, quando se pretende determinar a 
concentração media letal CL50, são necessárias 96 horas. Assim, as principais 
finalidades para realizar o teste de toxicidade aguda são conseguir informações 
especificas e determinar a dose e a concentração media letal de tais produtos. 
Outro ponto importante é entender como funciona o mecanismo desse produto 
no corpo, isto é, como ele consegue intoxicar o ser vivo. Além disso, com os 
resultados agudos, podemos traçar quais seriam as doses utilizadas caso seja 
necessário estudos para toxicidade crônica. Por último, é importante garantir a 
segurança do consumidor final, sendo necessário o estudo de cada lote liberado 
na indústria. 
Até aqui, vimos o teste de toxicidade aguda, com efeito local em partes do 
corpo. Contudo, também há o teste agudo sistêmico, usado quando a 
substância age em mais de um sistema de funcionamento do ser vivo. O teste 
pode ser feito por administração oral, com base no DL50 da amostra a ser 
estudada e considerando a duração do efeito sistêmico, a escolha do grupo de 
testes (quantidade, idade e tipo de animal-teste) e a dieta a ser seguida durante 
a observação. Além disso, entre as 8 e 12 horas após a administração, os animais 
devem ser controlados. 
Seguindo protocolos parecidos, embora cada um tenha suas especificidades, 
pode-se realizar testes de aplicação dérmica (Figura 9), sendo realizada a 
tricotomia, para eliminar os pelos do animal, a fim de não interferir na absorção 
da substância em teste. Em seguida, são feitos pontos, para delimitar e definir 
onde serão realizadas as aplicações, que devem ser mantidos até o final do 
experimento, de modo que deve ser analisada a pele, bem como se há 
interferência no crescimento da pelagem nova, já que o estudo não é apenas 
local, estudando também como essa substância age no corpo. 
 
Figura 9. Teste dérmico. Fonte: Shutterstock. Acesso em:13/112020. 
Outras vias de administração comumente estudadas são a inalação, que pode 
ser feita por meio de canículas introduzidas nas narinas ou por meio de câmaras 
de gás, e as vias parenterais, geralmente feita por meio de injeções sistêmicas. 
TESTES DE TOXICIDADE SUBCRÔNICA E 
CRÔNICA 
 
Após compreendermos como funcionam os 
testes em toxicidade aguda, devemos 
conceituar os testes que analisam outros 
níveis. Quando tratamos da toxicidade 
subcrônica, por exemplo, estamos falando 
de testes que duram entre 30 dias e 10% da 
expectativa de vida do animal em teste, ou 
seja, se um camundongo vive entre dois anos 
e meio e três anos, para que seja considerado 
um teste subcrônico, sua duração não pode 
ser maior que 90 dias. 
Os estudos feitos para observar os resultados desse tipo de teste são mais 
variados do que nos testes agudos. Assim, além de coletar os dados básicos, 
também se faz uma análise de urina, uma hematologia, um controle de massa 
corporal e uma histopatologia, entre outros. Sendo esse tipo de teste mais 
prolongado, se torna ainda mais necessário seguir corretamente as referências 
impostas, tanto para garantir resultados confiáveis, que permitirão traçar 
estratégias para posteriores estudos, como para evitar o sofrimento do animal-
teste. 
Em testes de toxicidade crônica, a diferença se dá, principalmente, no tempo 
que o animal será exposto à substância, para a realização do experimento, 
havendo variações de acordo com a espécie do ser vivo. Por exemplo, em 
camundongos, o teste dura em torno de 18 a 24 meses, enquanto, nos macacos, 
esse tempo é de 5 a 7 anos e, nos ratos, de 24 a 30 meses, sendo as vias de 
administração iguais às utilizadas nos testes agudos e subcrônicos. Vale 
salientar que, em estudos muito prolongados, como os crônicos, é recomendado 
Flavia
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Flavia
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que se façam estudos complementares, de teor oncológico, para determinar os 
riscos do desenvolvimento de tumores (benignos ou malignos). 
Ainda dentro desse contexto, existe a avaliação de teratogenicidade, realizado 
em animais-testes fêmeas gestantes, a fim de obter informações sobre se a 
substância em estudo pode desenvolver algum problema no feto, seja uma 
anormalidade morfológica ou funcional. O estudo se desenvolve com a 
aplicação de substância durante todoo período gestacional da fêmea, sendo que, 
após o nascimento, esse filhote passa por vários exames, para detectar diferentes 
sinais de anomalias. Esse tipo de teste também é realizado in vitro, ou seja, em 
células desenvolvidas em laboratório, buscando alguma alteração durante a sua 
divisão celular. 
 
CURIOSIDADE 
Existem fármacos, como, por exemplo, a isotretinoína, representada 
comercialmente pelo nome de Roacutan, utilizada para tratamento de 
acne severa. Estudos de teratogenicidade comprovaram que a 
capacidade de provocar anomalias em fetos de mães que fizeram uso 
desse medicamento é altíssima. De modo que mulheres em idade fértil 
precisam assinar um termo de responsabilidade, que diz que estão 
cientes dos riscos que correm se engravidarem durante e até um ano 
depois do tratamento feito com esse medicamento. 
PROCEDIMENTO DE DRAIZE 
 
John H. Draize foi um cientista que, em 1944, padronizou o teste de 
irritabilidade primária da pele, utilizado até os dias de hoje, sem nunca ter sido 
modificado em seu contexto geral. O teste foi realizado em vários tipos de 
animais, até que se constatou que a pele dos coelhos reagia de maneira mais 
Flavia
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aproximada à dos seres humanos. Esse experimento é realizado após a 
raspagem do pelo do animal e de escoriações na pele, em uma área delimitada, 
sendo aplicada cerca de 0,5 mL ou 0,5 g de substância. Em seguida, se envolve 
a região com algum tipo de material impermeável, por 24 horas, a fim de evitar 
a evaporação do produto. Por fim, deve-se observar os resultados, comparando-
os a valores pré-definidos, repetindo isso após 72 horas da aplicação. 
Os resultados são obtidos pela busca por eritemas e edemas (Figura 10), tipos 
de irritabilidade da pele. A vermelhidão na pele caracteriza o eritema, enquanto 
a descamação é chamada de escara, porém, em casos mais graves, podem-se 
formar edemas, quando existe um acúmulo de água no tecido, formando 
bolhas. 
 
Figura 10. Eritema de pele. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 13/11/2020. 
Os resultados são analisados de acordo com os parâmetros definidos na Tabela 
2, sendo declarados os valores referentes à situação encontrada na pele do 
animal após 24 ou 72 horas da aplicação. Por exemplo, o valor 0 é definido 
quando não se observa nenhuma alteração na pele, enquanto a escala de número 
4 são os casos mais severos. 
Tabela 2. Grau de irritabilidade da pele pelo procedimento de Draize. Fonte: CHORILLI; et al., 2009. 
(Adaptado). 
 
VAMOS REFORÇAR O QUE APRENDEMOS 
ATÉ AGORA? 
 
Para que seja realizado o teste de toxicidade, é necessário seguir alguns 
parâmetros de classificação dos agentes tóxicos, que podem ser: 
Conforme visto no tópico “Toxicidade”, os testes de toxicidade são 
feitos de acordo com o tempo e a capacidade de ação dos compostos 
estudados. Assim, quando a exposição se dá de forma abrupta, ela 
é chamada de toxicidade aguda; quando demora um pouco mais de 
tempo, temos uma toxicidade subcrônica; e, quando já está em 
estágio mais avançado, ela é denominada de toxicidade crônica. 
Agora é a hora de sintetizar tudo o 
que aprendemos nessa unidade. 
Vamos lá?! 
SINTETIZANDO 
Durante o controle de qualidade de medicamentos produzidos pela indústria 
farmacêutica, é imprescindível seguir técnicas, processos e comparar os valores 
obtidos com os limites pré-estabelecidos por agências sanitárias. Assim, testes 
em laboratório que simulam o contato dessas substâncias com o fluido corpóreo 
se tornaram indispensáveis para que esses fármacos fossem liberados para 
comercialização. 
Quando se trata de soluções com via de administração parenteral, foram 
desenvolvidos testes de pirogenicidades, realizados, primeiramente, in vitro, 
pelo processo conhecido como teste de endotoxina bacteriana ou lisado de 
amebócito do Limulus (LAL). Nesse caso, as amostras entram em contato com 
um meio de cultura fabricada a partir do sangue de um caranguejo-ferradura e, 
caso haja endotoxinas presentes na solução, há mudança do meio, saindo do 
aquoso e se transformando em gel. Nesse caso, dependendo de como é feito o 
teste, pode-se apenas saber se existe ou não a presença de pirogênios, como as 
endotoxinas, e, também, quantificá-las após várias diluições desse meio de 
cultura. 
Após a realização do teste in vitro, é realizado o teste in vivo, que tem como 
referência a utilização de coelhos, nos quais se injeta a amostra que se necessita 
testar e afere-se a temperatura dos animais. Após obter os resultados, faz-se 
uma média de quanto se aumentou a temperatura corpórea, para poder concluir 
se existe ou não endotoxinas na amostra. Há um valor limite para cada tipo de 
produto farmacêutico, sendo permitido para alguns um valor pouco maior de 
contaminação. Contudo, há técnicas que se pode utilizar para inativar ou 
remover as endotoxinas, o que chamamos de despirogenização, garantindo que 
superfícies, frascos e soluções se tornem apirogênicas. 
Por fim, falamos de toxicidade, que pode ser classificada como aguda, local ou 
sistêmica, bem como subcrônica e crônica. Os tipos de via de administração dos 
testes são praticamente os mesmos, sendo que as diferenças se dão devido ao 
tempo de exposição do animal-teste com o produto, além da quantidade de 
exames realizados a fim de obter os resultados necessários para concluir qual a 
extensão do dano que a amostra pode causar. Ainda nesse contexto, abordamos 
o procedimento de Draize, uma técnica antiga, e conservada até os dias atuais, 
que traz resultados sobre como um produto pode ou não irritar a pele do ser 
vivo. 
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