PIB_B0072_2017v2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS 
RELATÓRIO FINAL PIBIC/PAIC 2017-2018 
 
 
 
FORMULÁRIO PARA RELATÓRIO FINAL 
 
1. Identificação do Projeto 
Título do Projeto PIBIC/PAIC 
Clonagem da recombinase RecA e seus efeitos na recombinação homóloga utilizando 
CRISPR-Cas9 
 Orientador 
Jerusa Araújo Quintão Arantes Faria 
 
Aluno 
Juliana Nascimento Vitoriano 
 
 
2. Informações de Acesso ao Documento 
2.1 Este documento é confidencial? 
 
2.2 Este trabalho ocasionará registro de patente? 
 
 
2.3 Este trabalho pode ser liberado para reprodução? 
 
 
 
2. 4 Em caso de liberação parcial, quais dados podem ser liberados? 
Descreva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 SIM x NÃO 
 SIM x NÃO 
x SIM NÃO 
1	
  
	
  
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS 
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO 
DEPARTAMENTO DE APOIO À PESQUISA 
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 
COMITÊ CIENTÍFICO DE CIÊNCIAS BIOLOÓGICAS 
 
 
 
CLONAGEM DA RECOMBINASE RecA E SEUS EFEITOS NA RECOMBINAÇÃO 
HOMÓLOGA UTILIZANDO CRISPR-CAS9 
 
 
 
Bolsista: Juliana Nascimento Vitoriano, Programa Institucional de Bolsas de Iniciação 
Científica (PIBIC). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANAUS 
2018 
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS 
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO 
DEPARTAMENTO DE APOIO À PESQUISA 
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 
COMITÊ CIENTÍFICO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
 
 
 
RELATÓRIO FINAL 
PIB-B/	
  0072/2017 
CLONAGEM DA RECOMBINASE RecA E SEUS EFEITOS NA RECOMBINAÇÃO 
HOMÓLOGA UTILIZANDO CRISPR-CAS9 
 
Bolsista: Juliana Nascimento Vitoriano 
Orientador: Profa. Dra. Jerusa Araújo Quintão Arantes Faria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANAUS 
2018 
3	
  
	
  
Sumário 
	
  
1. Resumo ..................................................................................................................... 4 
2. Introdução ................................................................................................................ 5 
3. Materiais e Métodos ................................................................................................ 7 
3.1. Análise por ferramentas de bioinformática das sequências codificantes de recA 
em diversas linhagens de Escherichia coli. ................................................................... 8 
3.2. Desenho do cassete de expressão do gene de recA. ............................................ 8 
3.3. Síntese química do cassete de expressão do gene que codifica RecA. ................ 8 
3.4. Linhagens celulares ................................................................................................ 8 
3.5. Preparo de célula eletrocompetentes. .................................................................... 9 
3.6. Clonagem em pUC19 do cassete de expressão do gene que codifica RecA.. ...... 9 
3.7. Transformação por eletroporação.. ...................................................................... 11 
3.8. Confirmação dos transformantes.. ........................................................................ 12 
3.9. Indução de expressão da proteína RecA.. ........................................................... 12 
3.10.Visualização da proteína em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%.. ................ 13 
4. Resultados e Discussões ..................................................................................... 14 
4.1. Análise por ferramentas de bioinformática das sequências codificantes da RecA 
em diversas linhagens de Escherichia coli .................................................................. 14 
4.2. Desenho do cassete de expressão do gene de recA%.. ...................................... 14 
4.3. Síntese química do cassete de expressão do gene que codifica RecA. .............. 16 
4.4. Clonagem em pUC19 do cassete de expressão do gene que codifica RecA. ..... 16 
4.5. Indução da proteína RecA e visualização em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 
10%. ............................................................................................................................. 18 
5. Conclusão .............................................................................................................. 19 
6. Referências ............................................................................................................ 19 
7. Cronograma ........................................................................................................... 22 
 
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
4	
  
	
  
	
  
 
1. Resumo 
O sistema CRISPR-CAS9 tem emergido como uma nova tecnologia que 
possibilita a edição do genoma em pontos específicos com a integração ou 
subtração de nucleotídeos de interesse. Dada a facilidade de manipulação dos 
organismos procariotos, bem como as aplicações biotecnológicas para os 
mesmos como: eliminação de genes de resistência em superbactérias, 
biorremediação de ambientes contaminados, biocombustíveis entre outras 
múltiplas abordagens, torna-se interessante a implementação do sistema de 
edição CRISPR/Cas9 em tais organismos. Contudo, como esta tecnologia é 
relativamente nova, muitos aspectos demandam aprimoramento como: a 
eficiência da edição, criação de vetores eficazes e versáteis padronização dos 
protocolos. Sendo assim, o presente trabalho teve por foco o estudo da 
recombinase RecA e a ação desta nos processos de recombinação homóloga 
determinantes na edição pelo sistema CRISPR/Cas9. Neste sentido, foi realizado 
o desenho e clonagem da proteína RecA associada ao sistema de CRISPR - 
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Primeiramente, 
analisou-se por ferramentas de bioinformática sequências codificantes de recA 
em diversas linhagens de Escherichia coli para em seguida, ser realizado o 
desenho do cassete de expressão do gene recA e envia-lo para síntese química. 
Em seguida, clonou-se a sequência de recA mais seu terminador no plasmídeo 
pUC19 e inseriu-se na E. coli por eletroporação. Por fim, a indução e expressão 
da proteína recombinante foi confirmada por SDS-PAGE. Com o resultado 
positivo da eficiência da RecA pode-se prosseguir para elaboração de um vetor 
único de clonagem que visa facilitar o método de manipulação e edição genética, 
tornando-a menos laboriosa e demandando menos tempo de laboratório. 
 
Palavras-chave: proteína RecA, edição genética, recombinação homóloga, CRISPR-
Cas9. 
 
 
5	
  
	
  
2. Introdução 
A tecnologia do DNA recombinante gerou um novo paradigma na biologia. 
Biólogos moleculares desenvolveram ferramentas capazes de manipular as moléculas 
de DNA, possibilitando o estudo de sua função, bem como a construção de novos 
circuitos genéticos, contribuindo assim para o aperfeiçoamento da engenharia 
genética (HSU et al. 2014). Novas tecnologias de edição genética baseadas em 
nucleases vem sendo desenvolvidas como: Zinc Finger Nucleases (ZFNs) e 
Transcription Activator-Like Effector nucleases (TALENs), nas quais as enzimas são 
programadas para clivar o genomas em pontos específicos. Porém, nestas técnicas é 
necessária a engenharia de uma enzima específica para cada nova sequência alvo 
(JIANG et al., 2013). Um novo sistema baseado em CRISPR - Clustered Regularly 
Interspaced Short Palindromic Repeats – que é um processo de defesa natural das 
células procarióticas, tem se mostrado uma tecnologia inovadora. Este sistema 
consiste de uma endonuclease (Cas9), primeiramente isolada de Streptococcus 
pyogenes, guiada por um RNA guia (sgRNA) para a clivagem de uma sequência de 
DNA específica (ZHAO et al, 2016). A partir desta clivagem, a célula pode seguir uma 
de duas vias alternativas para reparar o genoma, sendo uma delas o mecanismo de 
reparo por recombinação, Homology Recombination (HR), onde o DNA clivado é 
reparado na presença de um DNA homólogo e proteínas recombinases, helicases e 
polimerases (NG et al, 2016). 
A proteína RecA é uma recombinase que tem função de promovera 
recombinação através do rearranjo dos nucleotídeos em sítios específicos com a 
ativação das vias de reparo de DNA (WANG et al, 2011). Esta enzima atua na via de 
reparo por Recombinação Homóloga (HR) e pertence a família das ATPases, sendo 
altamente conservada nos diversos microrganismos. Tal conservação é decorrência 
tanto das funções cruciais de manutenção da integridade do genoma, quanto dos 
mecanismos que proporcionam a variabilidade genética. Assim, a análise da 
sequênica de recA é utilizada frequentemente para identificação de linhagens 
bacterianas (CHEN et al, 2008; LEHNINGER, 2015).	
   Em condições naturais, ao 
ocorrer uma quebra abrupta na fita de DNA do genoma, a resposta SOS é ativada 
recrutando uma exonuclease da própria maquinaria bacteriana que cliva as 
extremidades do DNA, tornando-as colantes não complementares, então a RecA, na 
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presença do seu cofator ATP, liga-se à região de fita simples do DNA clivado – single 
strand DNA (ssDNA) -, formando uma estrutura helicoidal como mostrado na figura 1. 
 
Figura 1: Complexo RecA- ssDNA associado ao DNA dupla-fita. À esquerda a “entrada de 
DNAs” e à direita a “saída de DNAs”, tendo como cofator da enzima o ATP (Imagem 
modificada de LEHNINGER, 2015). 
O braço 3’ deste complexo invade o DNA homólogo íntegro presente no meio, 
identifica a homologia entre ambas sequências e catalisa o intercâmbio da fita 
complementar. A partir do pareamento, uma polimerase completa a sequência 
invasora, preenche a fita clivada baseada na sequência de DNA homóloga.	
  
Juntamente com a nova síntese pela polimerase, há um cruzamento entre as 
sequências, e esse cruzamento começa a se deslocar entre as fitas, passando uma 
das fitas da sequência intacta para a sequência quebrada. Esse cruzamento é 
chamado de Junção de Holliday. Uma representação deste mecanismo está ilustrado 
na figura 2. Este processo também pode ser acionado durante a meiose com a 
recombinação de fragmentos paternos e materno determinantes para a variabilidade 
genética (CHEN et al, 2008; NEALE; KEENEY, 2006). 
7	
  
	
  
 
Figura 2: Representação do mecanismo de ação da recombinação. Atuação da RecA 
como catalizadora da reação de recombinação (Modificada de MICHEL, 2005). 
A presença de recA expresso pelo vetor de clonagem tem a função de carrear 
o DNA clivado (genoma) até o DNA molde homólogo (Vetor de clonagem) e invadi-lo 
a fim de se restaurar o genoma, porém acrescentando durante a recombinação o 
DNA de interesse. No sistema de edição genética baseado em CRISPR-Cas9, 
verifica-se uma maior eficiência de recombinação quando tal maquinaria está 
associada à recA (ZHAO et al. em 2016). O presente projeto teve por objetivo o 
desenho, a clonagem e expressão da proteína RecA induzível pelo reagente	
  Isopropyl 
β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Assim, o objetivo futuro deste trabalho consiste 
na utilização do cassete de expressão de recA na construção de um vetor único para 
manipulação e edição gênica bacteriana do tipo CRISPR-CAS9. 
3. Materiais e Métodos 
Todas as etapas experimentais deste trabalho foram realizadas no 
Laboratório de Tecnologia do DNA do Centro de Apoio Multidisciplinar (CAM) na 
Universidade Federal do Amazonas (UFAM), localizado em Manaus, Amazonas, 
Brasil. 
 
8	
  
	
  
3.1. Análise por ferramentas de bioinformática das sequências 
codificantes de recA em diversas linhagens de Escherichia coli. 
Inicialmente, foram conduzidos o estudo de revisão das literatura sobre o 
mecanismo de ação de RecA na recombinação homóloga. Para a análise in silico de 
RecA foram adquiridas as sequências codificantes de DNA através da plataforma do 
NCBI (National Center for Biotechnology Information) (BENSON et al., 2014.) A 
sequência do gene recA proveniente de Escherichia coli MG1655 foi selecionada. 
Estas ORFs (open read frames) foram estudadas através de programas de 
bioinformática como ExPasy (Bioinformatics Resource Portal) de acordo com 
GASTEIGER, et al. 2003 para traduzir as sequências de DNA em aminoácidos. 
3.2. Desenho do cassete de expressão do gene de recA. 
Para o desenho do cassete de expressão, primeiramente foram deletadas as 
sequências correspondentes aos sítios de enzimas de restrição da EcoRI, NcoI e PstI 
de acordo com o prefixo padrão de BioBricks (SHETTY et al. 2008) na sequência de 
recA, com auxílio de programas de bioinformática como NEBcutter V2.0 como 
descrito em VINCZE, et al. 2003, o qual mapeia sítios de restrição presentes na 
sequência submetida e EMBOSS Sixpack, que analisa as fases de códons, a fim de 
se deletar os sítios sem alterar as sequências originais de aminoácidos. Além disso, 
foi acrescentado um terminador de transcrição e sítios antes e depois da sequência 
codificante da RecA, a fim de se faciltar na clonagem. 
3.3. Síntese química do cassete de expressão do gene que codifica 
RecA. 
A síntese química do cassete de expressão do gene da proteína RecA foi 
realizada pela empresa IDT - Integrated DNA Technologies - (Skokie, Illinois – EUA ) 
cedido aos times participantes da Competição Internacional de Engenharia de 
Sistemas Biológicos - International Genetically Engineered Machine Competition 
(iGEM), de acordo com o método primeiramente desenvolvido por KHORANA et al. 
em 1976. Após a síntese e confirmação da sequência através de sequenciamento, a 
empresa enviou o DNA liofilizado. 
3.4. Linhagens celulares 
Neste projeto foram utilizadas as linhagens de Escherichia coli BL21DE3, 
DH5α, DH5α F’IQ, e MG1655 provenientes do banco de bactérias do Laboratório de 
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Tecnologia do DNA do Centro de Apoio Multidisciplinar (CAM) – Universidade Federal 
do Amazonas (UFAM). 
3.5. Preparo de célula eletrocompetentes 
Uma colônia isolada das bactérias de cada linhagem foi inoculada em 20 mL 
de meio LB sem antibiótico e incubadas a 37°C com rotação a 150 rpm overnight. Em 
seguida, foi transferido 2,0 ml para 1L de meio LB sem antibiótico. Deixou-se crescer 
até atingir uma Densidade Ótica (OD) 600nm =0,7 (aproximadamente 5 horas a 150 
rpm). Ao atingir a OD, o material foi centrifugado por 10 minutos a 4°C a 4000rpm, 
lavou-se o pellet com glicerol 12% gelado ressuspendendo com cuidado e 
centrifugado em 4°C a 4000 rpm durante 10 minutos, repetiu-se este processo 4 
vezes. O pellet foi ressupendido em 1,5ml de glicerol 12% gelado. O material foi 
distribuído em microtubos estéreis de 100 µl e congelado rapidamente para estocar à 
- 80°C; 
3.6. Clonagem em pUC19 do cassete de expressão do gene que codifica 
RecA. 
O DNA obtido da síntese foi ressuspendido em água deionizada na 
concentração de 10 ng/µL, de acordo com as instruções da empresa. Os fragmentos 
de DNA e vetores purificados foram quantificados pelo Kit da Quibit 2.0 Fluorometer, 
seguido as recomendações da empresa Invitrogen – Life Technologies. O fragmento 
de DNA dupla fita contendo a sequência de recA e o vetor de clonagem pUC 19 foram 
submetido a digestão com a incubação das enzimas SmaI e EcoRI com os tubos 
estoque na concentração de 20.000 unidades/ mL, da New England Biolabs de 
acordo com a tabela 1 e 2 a baixo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 1: Sistema de digestão de pUC19 e recA com enzima SmaI. 
 Controle (pUC 19) pUC 19 pUC 19 recA 
H2O 7.5µL 23µL 23µL 12.5µL 
Tampão 10x 
CutSmart 
1µL 5µL 5µL 4µL 
DNA 1.5µL 20µL 20µL 20µL 
SmaI X 2µL 2µL 2µL 
Total 10µL 50µL 50µL 40µL 
 
Após 1h30min incubando à 25°C em banho-seco seguiu-se com a condução 
do protocolo descrito na tabela 2: 
Tabela 2: Sistema de digestão de pUC19 e recA com enzima EcoRI. 
	
  
 
 
 
 
 
Após mais uma hora de digestão, as amostras foram purificadas em colunas 
de purificação do Kit GE Healthcare para o volume final de 30µL. Em seguida, foi 
realizada a quantificação em Quibit das concentrações das amostras revelando que	
  
pUC19 estava com concentração de 20,5ng/µL e o cassete de recA com 1,61ng/µL.A 
partir desses dados foi calculada a quantidade necessária de cada amostra para se 
montar o sistema de ligação conforme a tabela 3: 
 
 
 pUC 19	
   pUC19	
   recA	
  
Tp 10x	
   5.0µL	
   5.0µL	
   4.0µL	
  
EcoRI	
   2.0µL	
   2.0µL	
   2.0µL	
  
Total	
   7.0µL	
   7.0µL	
   6.0µL	
  
11	
  
	
  
Tabela 3: Sistema de ligação de pUC 19 e recA. 
 recA	
  
Tp Ligase 10x	
   1.5µL	
  
DNA (pUC 19)	
   1µL	
  
DNA (gBlock 4)	
   11.5µL	
  
Ligase	
   1.5µL	
  
TOTAL	
   15.5µL	
  
	
  
A reação foi incubada durante 17 horas a 16°C e seguiu-se para a 
precipitação com 2 µL de glicogênio 20% 0,1V de NaCl 3 M e 2,5 de álcool 70% 
durante 6 horas. Em seguida foi centrifugado a 16.000g em 4°C durante 5 minutos e o 
sobrenadante removido para proceder com a lavagem do tubo com 1 mL de álcool 
70%. Novamente, centrifugou-se a 16.000g em 4°C durante 10 minutos e o 
sobrenadante foi removido. Esperou-se secar o resíduo de álcool e se eluiu o material 
em 3µL de água deionizada. 
3.7. Transformação por eletroporação. 
Antes do procedimento foram preparadas placas de petri contendo meio Luria 
Bertani e 100µL/mL de penicilina. Para transformação genética, as células 
eletrocompetentes congeladas juntamente com o DNA precipitado foram colocados 
no gelo durante 10 minutos, em seguida foram aplicados a volume dav precipitação 
na célula competente e aguardado 5 minutos no gelo. Passado este tempo, a solução 
foi passada para uma curveta de eletroporação, com o cuidado de não causar choque 
térmico, e acoplada ao eletroporador da Eppendorf onde recebeu uma carga elétrica 
de 1900 Volts. Para recuperação da célula, foi transferido o material eletroporado a 
um tubo eppendorf de 1,5mL contendo 500mL de meio Luria Bertani e incubado à 
37°C durante 1 hora. Após a recuperação, as culturas foram plaqueadas em três 
placas de petri nas quantidades de 50µL, 100µL e 150µL da amostra, e colocadas na 
estufa a 37°C– overnight. Cada linhagem transformada foi destinada para processos 
diferentes. A cepa DH5α transformada foi destinada à extração plasmidial para futura 
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clonagem em vetor de pSB1C3, a MG1655 para teste de eficiência que será discutido 
mais posteriormente e DH5αF’IQ e BL21DE3 que foram destinadas para expressão 
da proteína. 
3.8. Confirmação dos transformantes 
A partir das bactérias crescidas nas placas de petri, foram selecionadas 
colônias para extração plasmidial com o Kit de miniprep da GE Healthcare, 
recuperando-se 30µL. Em seguida, as amostras foram digeridas com EcoRI e PvuII 
com os tubos estoque na concentração de 20.000 unidades/ mL, da New England 
Biolabs, para confirmação da clonagem do cassete de expressão de RecA em 
pUC19. O sistema está esquematizado na tabela 4: 
Tabela 4: Sistema de Digestão para confirmação de clonagem 
 
Cassete de recA em pUC19 
 Controle Negativo EcoRI PvuII PvuII + EcoRI 
H2O 8.5µL 7.75µL 7.75µL 7.25µL 
Tp 2.1 
10X 
1µL 1µL 1µL 1µL 
DNA 0.5µL 0.75µL 0.75µL 0.75µL 
EcoRI - 0.5µL - 0.5µL 
PvuII - - 0.5µL 0.5µL 
Total 10µL 10µL 10µL 10µL 
 
3.9. Indução de expressão da proteína RecA . 
No dia anterior ao da indução, foi feito o pré-inóculo das E. coli das linhagens 
BL21DE3 e DH5αF’IQ com o plasmídeo de expressão da RecA e as mesmas 
bactérias sem essa construção, que ficaram crescendo no agitador durante 16h. Após 
este tempo, foi realizada a transferência de 200µL de cada amostra para 6 tubos 
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contendo 2mL de meio Luria-Bertani. Os tubos destinados às bactérias 
transformantes foram quatro ao total, sendo duas para a cepa BL21DE3 e as outras 
duas para DH5αF’IQ, todas contendo 2µL de ampicilina. Nos outros dois tubos foram 
inoculados as outras células não transformantes. Após este processo, todos os tubos 
foram incubados no agitador a 37°C até atingirem a OD em 600nm de 0,6. 
Com o valor de OD atingida, foi acrescentado em cada tubo mais 1mL de 
meio LB contendo 1µL de ampicilina, onde em um dos tubos de cada grupo das 
bactérias transformadas foi acrescentado IPTG 1mM, e incubado novamente no 
shaker a 37°C durante 2,5 horas. Em seguida, 2mL do material foi centrifugado a 
13.500 rpm 4°C durante 10 minutos para formação de pellet e retirado o sobrenadante 
para armazenagem do material a -20°C. 
3.10. Visualização da proteína em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. 
O material congelado foi ressuspenso em tampão de amostra contendo Tris-
HCl a 100mM pH 6,8 e 2% de SDS 10%. Após a eluição, as amostras foram 
submetidas ao sonicador Ecosonics com a potência em 20% de 1 pulso durante 5 
segundos. Para quantificação das proteínas, foi utilizado o kit 2D Quant de acordo 
com o protocolo recomendado pela empresa. Os marcadores de quantificação foi o 
Soro de Albumina Bovina (BSA) para a escala 0, 10, 20 e 30 que também foram 
submetidos a estes processos. Esperou-se 20 minutos e as amostras foram lidas no 
espectrofotômetro da Thermo a 480nm e foram anotados suas respectivas valores de 
absorbâncias. 
Através dos dados obtidos, foi calculado a quantidade necessária para se 
aplicar x micrograma de proteínas totais no gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 12%). 
Para a migração das proteínas foi utilizado uma tensão de 200v, e corrente elétrica 
30mA no aparato de eletroforese da marca BioRad. Para a visualização, o gel foi 
coroado com Comassie-Blue R350 seguido de descoloração em solução descorante. 
O gel foi visualizado sendo analisado no digitalizador de gel Typhoon FLA 7000 da 
GE Healthcare. 
 
 
 
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4. Resultados e Discussões 
4.1. Análise por ferramentas de bioinformática das sequências 
codificantes da RecA em diversas linhagens de Escherichia coli. 
A partir da análise de sequências codificantes da RecA proveniente de várias 
linhagens de E.coli verificou-se a elevada conservação das sequências primárias 
entre as diversas linhagens, como apresentado na figura 3. 
 
Figura 3: Porcentagem da composição dos resíduos de aminoácidos da proteína RecA 
em diversas cepas de bactéria E. coli. A composição dos resíduos de aminoácidos da 
proteína de RecA apresenta-se conservadas nas linhagens UMN026, O157H7, NRG857C, 
MG1655 e LY180 de E. coli. (Fonte: Foto modificada do aplicativo Mega). 
Os dados obtidos refletem o alto grau de conservação da sequência primária 
de recA devido a importância crucial da mesma nos processos de recombinação e 
reparo para a sobrevivência celular. A composição de recA está de acordo com o 
descrito em SANCAR et a.,1980. 
4.2. Desenho do cassete de expressão do gene de recA. 
Para o desenho do cassete de expressão de RecA, a sequência codificante 
deste gene adquirido da plataforma NCBI usando-se a cepa de MG1655. Precisou ser 
redesenhado substituindo-se algumas sequências de sítios de enzimas de EcoRI e 
PstI os quais foram usados na estratégia posterior de clonagem. Este processo é 
possível graças à versatilidade que um mesmo aminoácido pode ser sintetizado por 
mais de um códon de nucleotídeos, podendo-se manipular desta forma qualquer 
sequência de interesse sem alterar a sequência primária da proteína como descrito 
em LEHNINGER et al. 2015. 
Em seguida foi acrescentado o terminador de transcrição forte L3S2P00 
(CHEN et al. 2013) do repositório do iGEM após a sequência codificante de recA. Na 
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região montante (upstream) do cassete gene-terminador foi inserido as sequências 
correspondentes aos sítios de EcoRI, NotI e XbaI e na parte a jusante do cassete os 
sítios para NotI e PstI. Ao fim do desenho, o cassete completo apresentou uma 
extensão total de 1181 pares de bases .O desenho do cassete está representado na 
figura 4. 
 
Figura 4: Cassete de expressão de recA. No prefixo do cassete estão inseridos os sítios de 
digestão para as enzimas EcoRI, NotI e XbaI, após a sequência codificante foi inserido o 
terminador L3S2P00, seguido dos sítios de digestão correspondente à de NotI e PstI 
(Modificado da Wiki iGEM Team:Amazonas_Brazil). 
Ovetor pUC19 possui 2686 pares de base e inclui a sequência gênica LacZ 
flanqueada por vários sítios alvos de enzima restrição como descrito no GenBank, o 
que facilita a confirmação dos recombinantes. O mapa de enzimas de restrições do 
vetor pUC19 é apresentado na figura 5. 
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Figura 5: Mapa de restrição pUC19. Tamanho do vetor e mapa de todos os sítios de 
restrição contidas no vetor de pUC19, sendo EcoRI e SmaI inseridas na sequência de LacZ 
(Fonte: figura obtida do site da New England Biolabs). 
4.3. Síntese química do cassete de expressão do gene que codifica 
RecA. 
Após o envio do pedido de síntese, foi necessárias o aguardo de 4 semanas 
para a chegada do material. Durante esse período foram feitas revisões bibliográficas 
e organização dos reagentes como o preparo de células eletrocompetentes DH5a 
necessários à próxima etapa do desenvolvimento do projeto. 
4.4. Clonagem em pUC19 do cassete de expressão do gene que 
codifica RecA. 
O vetor pUC19 possui cerca de 2686 pares de base enquanto o cassete de 
expressão do gene que codifica RecA possui 1181pb. Na primeira digestão com 
enzimas de restrição, o vetor (pUC19) liberou um fragmento de 16 pares de bases e 
ficou linear e contendo uma ponta colante para o sítio de EcoRI e uma abrupta para 
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SmaI, enquanto o inserto (cassete de expressão de recA) apenas teve seu sítio de 
EcoRI clivado. 
Após a ligação destes dois segmentos, o sítio de EcoRI foi restaurado na 
nova clonagem enquanto SmaI virou uma cicatriz no novo plasmídeo. A clonagem do 
cassete de expressão de recA em pUC 19 utilizando-se as enzimas de restrição foi 
realizada com êxito, como o observado na corrida eletroforética das amostras 
digeridas (figura 6). 
 
 
Figura 6: Gel de eletroforese das amostras da digestão enzimática para a confirmação 
de clonagem. 1 e 2 são resultados de outras construções do projeto de vetor único. a) 
legenda da relação do tamanho do fragmento em pares de base com a distância corrida no 
gel; b) o marcador de 1kb; c) vetor pUC19 contendo o cassete de RecA sem enzima; d) vetor 
pUC19 contendo o cassete de RecA digerido apenas com a enzima EcoRI; e) vetor pUC19 
contendo o cassete de RecA digerido apenas com a enzima com PvuII; f) vetor pUC19 
contendo o cassete de RecA digerido com EcoRI e PvuII. 
O resultado da eletroforese em gel de agarose das amostras submetidas à 
digestão permitiu observar que em “c”, não submetido a digestão, o DNA plasmidial 
obteve várias conformações uma vez que se encontrava circular. Em “d”, com a 
banda em um tamanho de sequência superior à 3kb encontra-se o plasmídeo em sua 
forma linear devido ao único sítio de EcoRI presente no vetor, confirmando seu 
tamanho de 3851 pb. Já em “e”, com o corte com PvuII, o qual apresenta dois sítios 
em pUC19, houve a liberação de dois fragmentos, um de 1502 pares de base, sendo 
o inserto e outro maior, o vetor, com cerca de 2348 pb. E por fim “f”, em que houve 
dupla digestão com EcoRI e PvuII, também houve a liberação de dois fragmentos 
também na mesma faixa de pares de base, sendo o inserto com 1403pb e o vetor 
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2348pb, confirmando a clonagem do gene recA em pUC19. A identificação “gblock4” 
para o cassete de expressão da RecA, distingue esta peça de outras construções 
proposta pelo vetor único de clonagem. 
4.5. Indução da proteína RecA e visualização em gel de poliacrilamida 
SDS-PAGE 10%. 
Através da ferramentas de bioinformática Expasy, calculou-se o peso 
molecular da proteína RecA recombinante corresponderia a 37,98 kDa que vai de 
acordo com o descrito no artigo de SANCAR et al. 1980. O gel de poliacrilamida 
realizado dos extratos bacteriano expressando e induzindo a proteína RecA é 
apresentado na figura 7. 
 
Figura 7: SDS_PAGE dos extratos bacterianos não transformados e trasnsformados 
com a construção.: A) legenda do marcador de peso molecular (kDa); B) Marcador de peso 
molecular; C) proteínas da amostra da cepa BL21DE3 não transformada e tratada com IPTG; 
D) proteínas da amostra da cepa BL21DE3 com o plasmídeo de RecA sem indução por IPTG; 
E) proteínas da amostra da cepa BL21DE3 com o plasmídeo de RecA e induzido por IPTG; F) 
proteínas da amostra da cepa DH5αF’IQ sem o plasmídeo de RecA e tratada com IPTG; G) 
proteínas da amostra da cepa DH5αF’IQ com o plasmídeo de RecA e sem indução por IPTG; 
H) proteínas da amostra da cepa DH5αF’IQ com o plasmídeo de RecA e induzido por IPTG. 
As bandas proteícas abaixo da linha laranja foram analisadas, uma vez que e 
correspondem ao peso molecular da proteína recombinante. Como observado em “C”, 
o extrato protéico de bactérias BL21 não trasnfromadas mas tratadas com IPTG, não 
apresentou expressão da banda de proteína. Entretanto, como esperado em “D” e “E”, 
bactérias transformadas com o plasmídeo apresentaram a expressão da proteína 
19	
  
	
  
RecA. Tal expressão ocorre mesmo sem a adição do indutor “D” devido ao vazamento 
natural que o promotor Lac possui, contudo a expressão foi mais baixa que 
apresentada pelas bactérias transformadas e induzidas com IPTG “E”. Para a cepa 
DH5αF’IQ, observa-se em “F”, bandas de proteínas endógenas no tamanho da 
proteína RecA. Contudo, observa-se um conteúdo superior de proteínas com peso 
molecular correspondente superior nas amostras “G” e “H”, nas quais o extrato 
consiste de bactérias transformadas com o plasmídeo de RecA. As bandas 
visualizadas na canaleta “G” parecem indicar um perfil de expressão de RecA em 
função de um possível vazamento da expressão. Na canaleta correspondente a 
amostra induzida com IPTG- “H” verifica-se que todo o perfil eletroforético desse 
grupo está proporcionalmente mais fraco do que os outros dois grupos, 
provavelmente por um erro de pipetagem. Considerando essa questão, o perfil da 
amostra parece indicar a indução e expressão de RecA também na cepa DH5αF’IQ, 
Sendo assim, nossos resultados parecem indicar a expressão e indução da proteína 
RecA, como também apresentado em ZHAO et al. 2016. 
5. Conclusão 
No presente projeto, os objetivos propostos referentes ao desenho da 
sequência gênica, a clonagem e expressão da proteína recombinase RecA foram 
alcançados. A partir destes resultados, poderemos prosseguir para a construção de 
um vetor único de clonagem baseado em CRISPR-Cas9 visando facilitar o processo 
de clonagem, e assim diminuir o tempo da aplicação desta técnica em laboratório. 
6. Referências 
BENSON DA1, CLARK K, KARSCH-MIZRACHI I, LIPMAN DJ, OSTELL J, SAYERS 
EW. 2014. GenBank.	
   Nucleic Acids Research. Disponível em: <	
  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24217914>. 
BENZINGER, Rolf; ENQUIST, L. W.; SKALKA, A. 1974. Transfection of Escherichia 
coli Spheroplasts V. Activity of recBC Nuclease in rec+ and rec- Spheroplasts 
Measured with Different Forms of Bacteriophage DNA. Journal of Virology 15: 861-
871. 	
  
20	
  
	
  
CHEN, Y. J. LIU, P.; NIELSEN, A.A.; BROPHY, J.A.; CLANCY, K.; PETERSON, T.; 
VOIGT, C.A. 2013. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and 
quantification of their design constraints. Nature Methods 10: 659 – 664. 
CHEN, Zhucheng; YANG, Haijuan; PAVLETICH, Nikola, P. 2008. Mechanism of 
homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures. Nature 453: 489-
496. 
COHEN, S. N.; CHANG, A. C. Y.; HSU, L. 1972. Nonchromosomal Antibiotic 
Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA. 
Proc. Nat. Acad. Sci 69. 
GREEN, M.R. e SAMBROOK, J. 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold 
Spring Harbour Laboratory Press 4ª Ed. 
HSU, Patrick D.; LANDER, Eric S.; ZHANG, Feng. 2015. Development and 
Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Elsevier 157: 1262 -1278. 
JIANG, Wenyan; BIKARD, David; COX, David; ZHANG, Feng; MARRAFFIN, Luciano 
A. 2013. RNA-guided editing of bacterial genomes using crisPr-cas systems. Nature 
biotechnology 31: 233 – 241. 
KHORANA, H. G; AGARWALS,K. L.; BESMER, P. et al.1975.Total Synthesis of the 
Structural Gene for the Precursor of a Tyrosine Suppressor Transfer RNA from 
Escherichia coli. The Journal Of Biological Chemistry 251. 
LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., COX, M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. 
7th ed. New York: Freeman, W. H. & Company, 2015. 
NEALE, M. J.; KEENEY, S. 2006. Clarifying the mechanics of DNA strand exchange in 
meiotic recombination. Nature. 442: 153–158. 
NG, I-Son; HUNGC, Ying-Hsin; KAOA, Pei-Hsun; ZHOUD, Yunli; ZHANG,Xia. 2016. 
CRISPR-Cas9 nuclease cleavage enables marker-free genome editing in Escherichia 
coli: A sequential study. Nature 68: 31-39. 
SANCAR, A.; STACHELEKA, C.; KONIGSBERG, W.; RUPP, W.D. 1980. Sequences 
of the recA gene and protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the 
United States of America. 5: 2611 – 2615. 
21	
  
	
  
SHETTY, R. P.; ENDY, D.; KNIGHT, T. F. 2008. Engineering BioBrick vectors from 
BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 
VINCZE, Tamas; POSFAI, Janos; ROBERTA, Richard J. 2003. NEBcutter: a program 
to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 13: 3688–3691. 
WANG, Yueju; YAU, Yuan-Yeu; BALDING, Donna Perkins; THONSON, James G. 
2010. Recombinase technology: applications and possibilities. Plant Cell Report 30: 
267-285. 
ZHAO, Dongdong; YUAN, Shenli; XIONG, Bin; SUN, Hongnian; YE, Lijun; LI, Jing; 
ZHANG, Xueli; BI, Changhao. 2016. Development of a fast and easy method. 
Microbial Cell Factories 15:205-214.
22	
  
	
  
 7. Cronograma 
Nº Descrição Ago 
2017 
Set Out Nov Dez Jan 
2018 
Fev Mar Abr Mai Jun Jul 
1 Revisão de Literatura OK OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
   OK	
  
2 Análise in silico das ORFs de RecA de diversas linhagens de 
Escherichia coli; 
 OK	
   OK	
   OK	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
3 Desenho e síntese química do cassete de expressão do gene 
RecA; 
 	
   	
   	
   OK	
   OK	
   OK	
   	
   	
   	
   	
   	
  
4 Confecção do relatório parcial do projeto de iniciação 
científica 
 	
   	
   	
   OK	
   OK	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
5 Indução e avaliação da expressão de RecA 
recombinante 
 	
   	
   	
   	
   	
   OK	
   OK	
   	
   	
   	
   	
  
6 Subclonagem e fusões gênicas dos cassete de expressão de 
RecA e do gene que codifica a 
proteína GFP (Green 
Fluorescent Protein) no vetor 
único de sistema CRISPR-
Cas9; 
 	
   	
   	
   	
   	
   	
   OK	
   OK	
   OK	
   	
   	
  
7 Avaliação da eficiência da recombinação homóloga 
catalisada pela RecA através 
da inserção do gene repórter 
Green Fluorescent Protein 
(GFP) em genoma de E. coli 
utilizando o maquinário 
CRISPR-Cas9. 
 	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   OK	
   OK	
   OK	
   	
  
8 Confecção de um manuscrito de revisão da metodologia de 
CRISPR-CAS9 e resumos para 
submissão em congressos 
científicos da área. 
 	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   OK	
   OK	
  
 
 
9 
- Elaboração do Resumo e 
Relatório Final (atividade 
obrigatória) 
- Preparação da Apresentação 
Final para o Congresso 
(atividade obrigatória) 
 OK OK	
  
 
 
	Formulario Relatorio Final_IC_ PIBIC_Juliana
	Relatorio final juliana_final