tecnicas_modernas_de_biologia_molecular

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Brasília-DF. 
Técnicas Modernas de Biologia 
Molecular
Elaboração
Joci Neuby Alves Macedo
José Luiz de Souza Lopes 
Luis Fernando Reyes
Julio Cesar Pissuti Damalio
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração
Sumário
APRESENTAÇÃO .................................................................................................................................. 5
ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA ..................................................................... 6
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 8
UNIDADE I
BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO .......................................................................................... 11
CAPÍTULO 1
UM POUCO DE HISTÓRIA ....................................................................................................... 11
CAPÍTULO 2
A DESCOBERTA DO DNA COMO TRANSMISSOR DA INFORMAÇÃO GÊNICA E O SURGIMENTO DA 
ENGENHARIA GENÉTICA ........................................................................................................ 16
UNIDADE II
A MANIPULAÇÃO DO DNA ................................................................................................................. 19
CAPÍTULO 1
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) .......................................................................... 19
CAPÍTULO 2
SEQUENCIAMENTO DE DNA................................................................................................... 25
CAPÍTULO 3
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E LIGASE: “MONTANDO O DNA” ........................................................ 30
CAPÍTULO 4
EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE .............................................................. 35
CAPÍTULO 5
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA ............................................................................................ 39
CAPÍTULO 6
VETOR DE CLONAGEM MOLECULAR – PLASMÍDEOS ............................................................... 42
CAPÍTULO 7
BIBLIOTECA DE DNA GENÔMICO E DE cDNA ......................................................................... 45
UNIDADE III
TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO .............................................................................................................. 50
CAPÍTULO 1
SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT E WESTERN BLOT ............................................................... 51
CAPÍTULO 2
MICROARRANJOS DE DNA E DE PROTEÍNAS ........................................................................... 56
UNIDADE IV
RECENTES AVANÇOS DA BIOLOGIA MOLECULAR ................................................................................. 61
CAPÍTULO 1
DUPLO HÍBRIDO EM LEVEDURAS ............................................................................................. 61
CAPÍTULO 2
IMPRESSÃO DIGITAL DO DNA - MEDICINA FORENSE ................................................................ 65
CAPÍTULO 3
TESTE DE PATERNIDADE .......................................................................................................... 71
CAPÍTULO 4
USO DA BIOINFORMÁTICA NA ANÁLISE DE SEQUENCIAS DE DNA E PROTEÍNAS ......................... 74
CAPÍTULO 5
A ERA DAS “ÔMICAS” E A GERAÇÃO DE INFORMAÇÕES EM GRANDE ESCALA ........................ 80
PARA (NÃO) FINALIZAR ...................................................................................................................... 82
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 83
5
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem 
necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela 
atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade 
de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos 
a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma 
competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para 
vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar 
sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a 
como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
6
Organização do Caderno 
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de 
forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões 
para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao 
final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e 
pesquisas complementares.
A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos 
e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes 
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor 
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita 
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante 
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As 
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.
Sugestão de estudo complementar
Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, 
discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.
Praticando
Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer 
o processo de aprendizagem do aluno.
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a 
síntese/conclusão do assunto abordado.
7
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões 
sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o 
entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
Exercício de fixação
Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/
conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não 
há registro de menção).
Avaliação Final
Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso, 
que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única 
atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber 
se pode ou não receber a certificação.
Para (não) finalizar
Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem 
ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.
8
Introdução
Este caderno de estudos foi elaborado com o propósito de oferecer conhecimentos sobre as principais 
técnicas da Biologia Molecular e suas aplicações, além de fornecer informações sobre alguns temas 
recentes desta área da ciência.
Iniciaremos nosso curso fazendo uma rápida viagem pela história da Biologia Molecular, conhecendo 
as principais descobertas no meio científico que consolidaram esta área da Ciência. Após um pouco 
de história, vamos abordar as principais técnicas utilizadas em biologia molecular que representam 
“A tecnologia do DNA recombinante”, como por exemplo, a PCR. O que seria desta área da ciência 
sem essa ferramenta? Vocês verão que, depois desta técnica, tudo aconteceu mais rápido.
Agora já estamos prontos para aprofundarmos nossos conhecimentos com técnicas específicaspara 
a identificação de uma molécula de DNA, RNA e proteína entre milhões de moléculas, assim como 
procurar uma agulha no palheiro. Vamos introduzir os conceitos de uma técnica para identificação 
de interação entre proteínas, e o porquê da busca de parceiros proteicos. Como nós, as moléculas da 
vida convivem interagindo entre si.
Exploraremos o que veio depois da dupla hélice, a busca por informação em grande escala, não 
pensamos em um gene, mas sim no genoma; uma proteína é pouco para todo conhecimento que 
já armazenamos. Chegou a era das “ômicas”, e assim pensamos com todas biomoléculas. Vamos 
entender a importância da impressão digital do DNA, sua aplicação no teste de paternidade e na 
Medicina Forense.
Por fim, serão fornecidas informações básicas sobre Bioinformática, vamos conhecer os principais 
bancos de dados de sequências e as várias ferramentas para análises de sequências de DNA e 
proteína.
Bons estudos!
Objetivos
 » Introduzir os principais acontecimentos históricos que deram origem a biologia 
molecular.
 » Apresentar os grandes cientistas que contribuíram para o desenvolvimento da 
biologia molecular.
 » Conhecer as principais características do DNA como a molécula que armazena as 
informações da vida.
 » Introduzir os fundamentos das principais técnicas da Biologia Molecular.
9
 » Contextualizar as aplicações das técnicas.
 » Reconhecer as diferenças entre as bibliotecas de DNA genômico e de cDNA.
 » Apresentar e estabelecer diferenças entre as técnicas de hibridização e suas 
aplicações.
 » Introduzir o novo conceito de pesquisa: as “ômicas”.
 » Compreender a importância da impressão digital do DNA para a Medicina Forense 
e o teste de paternidade.
 » Entender a importância da Bioinformática para a Ciência.
 » Apreender os conceitos básicos sobre genômica e seus derivados “ômicos”.
 » Reconhecer o envolvimento do Brasil neste tipo de pesquisa.
 » Definir e classificar os bancos de dados biológicos e entender sua função.
 » Familiarizar-se com ferramentas para análise de sequencias de DNA e proteínas.
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UNIDADE I
BIOLOGIA 
MOLECULAR: BREVE 
HISTÓRICO
CAPÍTULO 1
Um pouco de história
O termo Biologia Molecular foi usado pela primeira vez por Warren Weaver em 1938, num relatório 
enviado para a Fundação Rockefeller: “Entre os estudos para os quais esta fundação dá suporte, há 
um grupo, em um campo relativamente novo, que pode ser chamado de Biologia Molecular”.
O marco inicial da história da Biologia Molecular moderna foi a descoberta do DNA por Friedrich 
Meischer em 1869, como uma nova substância química presente no núcleo de células de glóbulos 
brancos, que foi inicialmente chamada de nucleína. A partir de então, vários acontecimentos no 
meio científico contribuíram para consolidar está área da ciência, que hoje pode ser definida como 
uma forma de abordagem de um problema em nível molecular, onde a combinação de técnicas 
e teorias provindas da genética microbiana, microbiologia, bioquímica e biofísica auxiliam na 
busca das respostas. Abaixo, apresentaremos algumas das descobertas que contribuíram para a 
consolidação da Biologia Molecular como uma área das ciências biológicas: 
 » 1869 - Friedrich Miescher: bioquímico suíço que isolou do núcleo de células 
de glóbulos brancos provenientes de pus, um composto de caráter ácido que foi 
denominado de nucleína. Esse composto era constituído por hidrogênio, oxigênio, 
nitrogênio e fósforo. Mais tarde, ele conseguiu isolar o mesmo composto de células 
de esperma de salmão. Este composto era resistente à ação da enzima pepsina, uma 
protease. O próprio Miescher acreditava que as proteínas fossem as moléculas da 
hereditariedade, ele não sabia que estava dando o pontapé inicial para elucidar esta 
questão.
 » 1882 - Walther Flemming: considerado o criador da ciência da citogenética, foi o 
primeiro pesquisador a descrever o comportamento dos cromossomos durante o 
processo da divisão celular. Os termos mitose e cromatina foram primeiramente 
usados por ele. 
 » 1915 - Thomas Hunt Morgan: Biólogo norte americano que formulou a teoria 
cromossômica da hereditariedade por meio dos seus trabalhos com a mosca 
Drosophila melanogaster. Ganhou o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina 
em 1933.
12
UNIDADE I │ BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO
 » 1928 - Frederick Griffith: identificou o princípio transformante e hereditário, 
que, mais tarde, seria chamado de DNA. No clássico experimento realizado com 
Diplococcus pneumoniae, Griffith demonstrou que: 
 › Camudongos morreram após receberem uma injeção de uma estirpe virulenta 
de Diplococcus.
 › Camundongos permaneceram vivos após injeção de uma estirpe avirulenta de 
Diplococus. 
 › Camudongos conservaram-se vivos após injeção da estirpe virulenta morta por 
aquecimento. Tudo bem até aqui!
 › Camudongos morreram após injeção de uma mistura composta por estirpe 
virulenta morta por aquecimento juntamente com uma estipe avirulenta viva. 
Griffith isolou do sangue destes camudongos a estirpe virulenta da bactéria viva. 
Como isso pode acontecer, visto que a estirpe virulenta estava morta?
 › Conclusão: alguma coisa foi transferida da bactéria virulenta morta para a 
bactéria avirulenta viva, conferindo-lhe a capacidade de matar os camundongos. 
A esta “coisa”, foi dado o nome de princípio transformante. No entanto, ele não 
conseguiu responder o que seria este princípio. Por outro lado, Griffith também 
estava descobrindo a transformação bacteriana. 
 › Fiquem atentos, pois este enigma começa a ser elucidado em 1944.
 » 1941 - George Beadle e Edward Lawrie Tatum: foram os primeiros a fazer a relação 
[um gene → uma enzima] a partir de trabalho com o fungo Neurospora. Eles 
observaram que a mutação em um gene alterava a atividade de uma enzima. Este 
trabalho resultou nas bases da Genética Bioquímica. Juntos, ganharam o prêmio 
Nobel em Fisiologia e Medicina em 1958.
 » 1944 - Frederick Sanger: Bioquímico inglês que desenvolveu um método de 
sequenciamento de proteínas e determinou a sequência completa de aminoácidos 
da insulina. Em 1958, recebeu o prêmio Nobel em Química graças a este trabalho. 
Sanger aparecerá em nosso histórico mais uma vez ganhando um prêmio, agora em 
trabalhos com o DNA.
 » 1944 - Oswald Avery, Colin McLeod e Maclyn McCarty: apresentaram as primeiras 
evidências de que as informações hereditárias estariam armazenadas no DNA e 
não nas proteínas, como ainda se pensava na época. Dessa forma, responderam 
a pergunta que Griffith não tinha elucidado em 1928: o princípio transformante 
é o DNA. Eles demonstraram que o princípio transformante era degradado pela 
ação de uma desoxirribonuclease pancreática (DNAse), mas não pela atividade 
13
BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO │ UNIDADE I
de ribonuclease pancreática (RNAse) ou de enzimas proteolíticas (proteases). O 
mundo já começava a relacionar o DNA com a hereditariedade, mas mesmo assim, 
ainda havia os que não acreditavam nesta proposição.
 » 1950 - Rosalind Franklin: biofísica britânica que obteve o primeiro padrão de 
difração de raios-X para o DNA, o qual foi fundamental para a proposição da 
estrutura em dupla hélice para o DNA por Watson e Crick. Muitos dizem que ela 
foi negligenciada por Watson e Crick, que não a mencionaram por este feito em seu 
trabalho sobre a estrutura do DNA, visto que, a imagem por ela obtida do DNA foi de 
fundamental importância para que eles chegassem à estrutura de dupla hélice para 
o DNA. Independente do que a história relata, aqui nós daremos a ela a importância 
merecida pelo seu trabalho.
 » 1950 - Erwin Chargaff: bioquímico austríaco demonstrou uma razão constante entre 
as bases nitrogenadas adenina/timina e citosina/guanina no DNA, independente 
do DNA analisado.
 » 1951 - Linnus Pauling: Propôs as estruturas de alfa hélice e folha beta para proteínas.
 » 1952 - Alfred Hershey e Martha Chase: provaram que o DNA, e não a proteína, é o 
material genético. Colocaram um ponto final nesta questão no experimentoconhecido 
como experimento do liquidificador. Eles adicionaram o isótopo radioativo P32 
(fósforo) em uma cultura de bacteriófagos (um tipo de vírus que infecta bactérias), 
e em outra cultura adicionaram o isótopo radioativo S35 (enxofre). Lembre-se que o 
DNA não possui enxofre e que as proteínas não possuem o elemento fósforo. Após 
infecções de E. coli com os bacteriófagos marcados, as amostras foram agitadas em 
um liquidificador para separar os bacteriófagos das bactérias. Eles observaram que 
no precipitado formado pelas bactérias havia apenas P32, enquanto no sobrenadante, 
onde se encontravam os bacteriófagos, estava presente apenas S35. Dessa forma 
Hershey e Chase constataram que o DNA dos bacteriófagos tinha sido transferido 
para o interior das bactérias.
 » 1953 - James Watson e Francis Crick: determinaram a estrutura tridimensional 
do DNA. Este é o marco principal da Biologia Molecular. No próximo capítulo, 
discutiremos esta descoberta. Estes pesquisadores receberam o prêmio Nobel em 
Medicina e Fisiologia em 1962.
 » 1957 - Francis Crick: postulou o “dogma central” da Biologia Molecular: [DNA 
→ RNA → Proteína]. Maiores detalhes já foram apresentados no curso: “Dogma 
Central da Biologia Molecular e Introdução à Bioinformática”.
 » 1957 - Arthur Kornberg: bioquímico americano que isolou a enzima DNA polimerase 
e foi o primeiro pesquisador a sintetizar DNA in vitro. Foi agraciado com o prêmio 
Nobel em Medicina e Fisiologia em 1959. As ferramentas da tecnologia do DNA 
recombinante começam a surgir.
14
UNIDADE I │ BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO
 » 1958 - Matthew Meselson e Franklin Stahl: demonstraram que o DNA se duplica de 
forma semiconservativa, em um experimento considerado um dos mais bonitos da 
Biologia Molecular. Assim como já visto detalhadamente no curso: “Dogma Central 
da Biologia Molecular e Introdução à Bioinformática”.
 » 1961 - François Jacob e Jacques Monod: biólogos franceses que decifraram os 
mecanismos de regulação gênica em procariotos – o operon. Atualmente, a 
expressão de proteínas heterólogas em bactérias tem como fundamentos os operons. 
Receberam o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em 1965.
 » 1966 - Marshall Nirenberg e Phil Leder: biólogos americanos que juntos decifraram 
o código genético. Nierenberg ganhou o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia 
em 1968, com estudos que culminaram na descoberta de que cada aminoácido é 
codificado por pelo menos uma trinca de nucleotídeos.
 » 1966 - Bernard Weiss e Charles Richardson: pesquisadores americanos que 
isolaram a enzima DNA ligase do bacteriofago T4, uma ferramenta essencial para a 
tecnologia do DNA recombinante.
 » 1968 - H.O. Smith, K.W. Wilcox, e T.J. Kelley: isolaram a primeira endonuclease 
de restrição específica. Tal fato permitiu o início da consolidação da tecnologia do 
DNA recombinante, pois as endonucleases são uma das principais ferramentas 
nessa área.
 » 1971 - David Baltimoree e Howard Temin: identificaram uma transcriptase reversa 
viral – enzima capaz de sintetizar DNA a partir de um molde de RNA. A partir de 
então, houve uma reavaliação do dogma central e novas expectativas para a Biologia 
Molecular: [DNA↔RNA→Proteína]. Receberam o prêmio Nobel em Medicina e 
Fisiologia em 1975.
 » 1972 - David Jackson, R.H. Symons e P. Berg: produziram a primeira molécula de 
DNA recombinante. Estaria o homem começando a brincar de “deus”?
 » 1975 - Edwin Southern: desenvolveu um método de detecção de sequência específica 
de DNA – Southern blot. Assim começavam a surgir as técnicas da Biologia 
Molecular.
 » 1976 - Robert Swanson e Herber Boyer: fundaram a empresa Genentech de 
biotecnologia na Califórnia. A Biologia Molecular começa a se tornar rentável.
 » 1977 - Frederick Sanger e Walter Gilbert: independentemente, desenvolveram 
métodos para determinar a sequência exata do DNA. Olha o Sanger retornando ao 
nosso histórico e, junto com Gilbert e Berg (DNA recombinante), ganhou mais um 
prêmio Nobel, agora em Química, em 1980.
 » 1985 – Kary Mullis: inventou a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase – PCR, 
fato pelo qual foi agraciado com prêmio Nobel em Química em 1993. Podemos 
15
BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO │ UNIDADE I
dizer que, as pesquisas em engenharia genética e biologia molecular só chegaram 
ao nível de complexidade em que estamos atualmente graças a esta técnica. É difícil 
imaginar a manipulação do DNA sem a PCR.
 » 1986 - Leroy Hood: desenvolveu o sequenciamento automático. A partir de então se 
podia pensar em projetos genomas.
 » 1988 - NIH (National Institutue of Health) e DOE (Department of Energy): lançam 
nos EUA o consórcio do projeto genoma humano (PGH).
 » 1995 - TIGER (EUA): finalizam o sequenciamento do primeiro genoma sequenciado: 
Haemophilus influenzae.
 » 1996 - Ian Wilmut: criador do primeiro clone de um mamífero adulto, a ovelha 
Dolly. Aqui fica novamente a questão: será que o homem está brincando de “deus”?
 » 2000 - Consórcio PGH: publica um rascunho do genoma humano com 30 mil genes.
 » 2003 - Consórcio PGH: conclui o sequenciamento do genoma humano.
 » 2003 - Pesquisadores brasileiros concluem o sequenciamento do genoma da 
bactéria Xylella fastidiosa, a causadora da doença do amarelinho em cítricos.
 » 2009 - O genoma bovino é publicado em um trabalho conjunto de cientistas de 25 
países.
 » 2010 - Criação da primeira célula controlada por DNA sintético
A doença do amarelinho é causada devido à oclusão de vasos do xilema por 
agregados da bactéria Xylella fastidiosa. Isso impede a passagem de água e sais 
minerais até as folhas, causando um estresse hídrico. O sequenciamento do genoma 
da Xylella envolveu 192 pesquisadores em 34 laboratórios distintos. O resultado 
desse sequenciamento foi capa da revista científica Nature, aliás, foi a primeira vez 
que um trabalho desenvolvido nos laboratórios brasileiros foi capa dessa prestigiada 
revista. 
Este histórico ilustra a corrida científica na área da Biologia Molecular para elucidar 
os mecanismos moleculares que governam a vida, inclusive vários deles receberam o 
prêmio Nobel por isso. Há 60 anos não se conhecia a estrutura do DNA, na atualidade 
manipulamos está molécula com uma facilidade inimaginável naqueles tempos. 
Muitas perguntas ainda estão sem respostas, mas os conhecimentos acumulados 
pelos biologistas moleculares na atualidade são essenciais para futuras descobertas.
vanessa.pereira
Nota
Marked definida por vanessa.pereira
16
CAPÍTULO 2
A descoberta do DNA como transmissor 
da informação gênica e o surgimento 
da Engenharia Genética
A história da Biologia Molecular tem como marco inicial a descoberta do DNA em 1869. Desde então, 
várias perguntas foram a motivação para elucidar a importância desta molécula para o ser vivo e 
a conservação de suas características ao longo de gerações. Essas perguntas só começaram a ser 
respondidas há sete décadas, com o clássico experimento de Oswald Avery, Colin McLeod e Maclyn 
McCarty, onde eles demonstraram que o chamado princípio transformante era o ácido nucléico. 
E o ponto culminante das descobertas, que enfim forneceram os conhecimentos necessários para 
entender como a informação genética era armazenada e transmitida, foi a elucidação da estrutura 
do DNA, há quase 60 anos. 
O evento considerado o mais importante da biologia do século passado, foi a elucidação da estrutura 
do DNA por Watson e Crick em 1953. A simplicidade das palavras dos autores no início da publicação 
dos dados não mensurava a importância de tal feito: “We wish to suggest a structure for the salt 
of deoxyribose nucleic acid [DNA]. This structure has novel features which are of considerable 
biological interest” (Nós queremos sugerir uma estrutura para o sal de ácido desoxirribonucleico 
[DNA]. Esta estrutura tem novas características que são de considerável interesse biológico). 
É importante ressaltar que outros pesquisadores contribuíram com informações importantes para 
este feito, como Maurice Wilkinse Rosalind Franklin, entre outros. Assim, hoje sabemos que o 
DNA (ácido desoxirribonucleico) é a molécula da vida, na qual toda a informação necessária para o 
desenvolvimento de um organismo está armazenada na forma de um código formado por 4 unidades, 
chamadas de desoxinucleotídeos (nucleotídeos). Esses nucleotídeos são simplificadamente 
abreviados pelas letras A (adenina), T(timina), C(citosina) e G (guanina) e são constituídos por 
um grupo fosfato ligado a uma pentose (desoxirribose – açúcar de cinco carbonos) que por sua vez 
encontra-se ligada a uma das quatro bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina). 
A estrutura do DNA foi então demonstrada ser formada por duas cadeias de nucleotídeos que se 
polimerizam por meio de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos. Essas cadeias encontram-se pareadas 
em uma orientação antiparalela e unidas por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas 
complementares (A/T e C/G). Essas duas cadeias formam uma hélice que lembra uma escada em 
espiral onde os degraus são as bases nitrogenadas e o corrimão é formado pelas desoxirriboses e os 
grupos fosfatos (figura 1). 
Os autores fazem uma importante observação no texto que será mais tarde confirmada: “It has not 
escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggest a possible 
copying mechanism for the genetic material” (Não nos passou despercebido que o pareamento 
específico, que nós postulamos imediatamente sugere um possível mecanismo de cópia para o 
17
BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO │ UNIDADE I
material genético). Logo em seguida, o mecanismo de replicação semiconservativa do DNA foi 
descrito por Matthew Meselson e Franklin Stahl (1958), mostrando assim que a informação contida 
em uma molécula de DNA era passada para novas moléculas. 
Com todos esses eventos, surgiu a Engenharia Genética, que podemos dizer ser toda manipulação 
do DNA que resulte em uma molécula de DNA recombinante, por este motivo é também conhecida 
por tecnologia do DNA recombinante. 
Mas, o que é esse tal de DNA recombinante? O DNA recombinante é o termo utilizado para definir 
uma molécula de DNA que sofreu alguma modificação quando comparada com a molécula de 
origem, seja uma clivagem com endonucleases de restrição, inserção em um plasmídeo, substituição 
ou inserção de um ou mais nucleotídeos, entre outras. Desta forma, as técnicas que permitem gerar 
um DNA recombinante constituem a tecnologia do DNA recombinante ou a engenharia genética. 
Figura 1. Estrutura do DNA. (A) Representação das duas cadeias da molécula de DNA interligadas por ligações 
de hidrogênio entre as bases nitrogenadas complementares (A/T e C/G). S corresponde à pentose e P ao grupo 
fosfato. (B) Estrutura da molécula de DNA na forma de uma hélice, como descrita por Watson e Crick.
Fonte: Figura modificada do site: <http://www.guianet.com.br/vegetarianismo/era10.html>, retirada em 17/9/2011.
Várias descobertas favoreceram a manipulação do DNA, como por exemplo, a descoberta de 
enzimas tais como as endonucleases, a DNA polimerase, a T4 DNA ligase; o desenvolvimento de 
protocolos para extração de DNA de vários organismos, a manipulação de bactérias como vetores 
de propagação de DNA recombinante, a descoberta dos plasmídeos bacterianos (moléculas de DNA 
circular), a invenção das técnicas de PCR e de sequenciamento do DNA, entre outras. 
Hoje, a Engenharia Genética é essencial para os estudos na grande área da Biologia que em algum 
momento envolvam a molécula de DNA. Por mais simples que sejam as análises, alguma ferramenta 
da Engenharia Genética será aplicada para auxiliar nas investigações, seja na simples análise 
do padrão de restrição de uma molécula de DNA, seja nas mais complexas formas de clonagem 
molecular em plasmídeo. Esse último, sempre tem início com a busca do gene de interesse dentro 
do genoma de um determinado organismo, a identificação de sua sequência de nucleotídeos até a 
inserção no plasmídeo, gerando assim uma molécula de DNA recombinante. 
18
UNIDADE I │ BIOLOGIA MOLECULAR: BREVE HISTÓRICO
Enriqueça seus conhecimentos lendo o artigo “O modelo de DNA e a Biologia 
Molecular: inserção histórica para o Ensino de Biologia” de Mariana Soares de 
Andrade e Ana Maria de Andrade Caldeira, disponível em: <http://www.abfhib.
org/FHB/FHB-04/FHB-v04-05-Mariana-Andrade-Ana-Maria-Caldeira.pdf> e o artigo 
“History of Molecular Biology”, disponível em: <http://www.biology-nation.com/
History_of_Molecular_Biology.html>.
19
UNIDADE IIA MANIPULAÇÃO 
DO DNA
CAPÍTULO 1
Reação em Cadeia da Polimerase 
(PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi inicialmente desenvolvida 
por Saiki e colaboradores em 1985, e em seguida foi aprimorada por Kary Mullis, que tentou publicar 
seus experimentos nas duas revistas científicas mais importantes do mundo, a Science e a Nature, 
as quais não reconheceram a importância de tal conquista. Desta forma, Kary Mullis publicou 
seus dados sobre a amplificação do gene da β-globina humana em uma revista de fator de impacto 
imensamente menor, a Methods in Enzymology, e mais tarde, em 1993, sua criação foi reconhecida 
e ele foi agraciado com o premio Nobel em Química. Mullis é conhecido como o criador da técnica 
de PCR, pois ele a idealizou da forma que é realizada atualmente, introduzindo o uso de uma enzima 
termoestável e os conceitos de oligonucleotídeos (primers) e consequentemente de especificidade 
do produto amplificado. 
O fator de impacto de uma revista é uma medida que reflete o número médio 
de citações de artigos científicos publicados naquela revista. É empregado 
frequentemente para avaliar a importância de uma dada revista em sua área, 
sendo que aqueles com um maior fator de impacto são considerados mais 
importantes.
Saiki, que descreveu a técnica precursora da PCR, a realizava de forma “rústica” e onerosa, 
adicionando a enzima DNA polimerase de Escherichia coli, que possui ótima atividade a 37oC, a 
cada ciclo da reação. Pois a mesma era inativada durante as etapas de elevação de temperatura 
para 94oC. 
Com Mullis duas mudanças fundamentais foram adicionadas a técnica, tornando a viável do ponto 
de vista científico e econômico:
1. O uso da enzima, recém-identificada, Taq, uma DNA polimerase termoestável 
isolada da bactéria de fontes termais, Thermus aquaticus, que se mantém estável 
em temperaturas próximas a 117oC e tem como ótima temperatura 72oC. 
20
UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
2. E as pequenas sequências de DNA, conhecidas como oligonucleotídeos, que 
delimitam a região a ser amplificada do DNA alvo, tornando assim o produto 
amplificado específico. 
Logo em seguida, o interesse comercial pela técnica resultou no desenvolvimento dos 
termocicladores, máquinas que variam a temperatura e controlam o tempo, repetindo o 
ciclo por várias vezes, permitindo assim automatizar a técnica, eliminando as exaustivas 
etapas de transferência dos tubos com a reação por vários banhos-maria de temperaturas diferentes.
A técnica de PCR veio para resolver um grande problema nas análises de DNA, a baixa quantidade 
de DNA nas células, pois ela visa amplificar uma região específica do DNA a partir de uma única 
molécula, de tal forma que após inúmeros ciclos de amplificação tenhamos quantidade de DNA 
suficiente para ser detectado e manuseado para diversos fins (tabela 1).
A PCR é um processo de replicação do DNA in vitro, com uma diferença básica em relação a este 
processo na célula, apenas uma região desejada do DNA é amplificada, diferente do que acontece na 
célula que a replicação é de todo o DNA celular. 
Tabela 1. Componentes necessários para a PCR. 
Componentes Função
DNA Alvo a ser amplificado.
Temperatura: 94oC. Temperatura para separação das fitas do DNA alvo.
Um par de oligonucleotídeos. Delimitar a região a ser amplificada. 
Temperatura: 58 a 66ºC Temperatura para o pareamento dos oligonucleotídeos no DNA alvo.
Nucleotídeos* (C, G, A e T), Taq etemperatura: 72oC. Polimerização da nova fita de DNA.
*Na PCR utilizamos a nomenclatura dNTPs para a mistura dos quatros nucleotídeos.
Os oligonucleotídeos são pequenos fragmentos de DNA de aproximadamente 17 a 35 pares de bases 
que são complementares as regiões que delimitam a sequência de DNA de interesse. Cada nucleotídeo 
pareia com uma das fitas do DNA. Estes podem conter além da sequência complementar ao DNA 
alvo, pequenas sequências de DNA que caracterizam sítios de reconhecimento para enzimas (como 
endonucleases). Estas sequências serão incorporadas nas novas moléculas de DNA amplificadas 
(figura 2).
Figura 2. Exemplos de oligonucleotídeos. (A), Sequência de DNA alvo. (B) e (C) Oligonucleotídeos (em negrito) 
pareados na sequência alvo. (C) Oligonucleotídeos contendo sequência adicional (letras minúsculas). 
vanessa.pereira
Nota
Marked definida por vanessa.pereira
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A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
A PCR ocorre em três etapas de forma automatizada em um equipamento chamado de termociclador:
1. Desnaturação: corresponde à separação da dupla fita de DNA por elevação da 
temperatura para 94oC durante 1 a 5 minutos.
2. Anelamento: com as fitas de DNA separadas a temperatura é reduzida para valores 
entre 58 e 66oC, favorecendo o pareamento dos dois oligonucleotídeos nas fitas 
complementares do DNA, desta forma delimitando a região do DNA a ser amplificada.
3. Extensão: a 72oC a enzima Taq posiciona-se próximo aos oligonucleotídeos e recruta 
os nucleotídeos para a síntese da nova fita de DNA.
Finalizado o ciclo da reação composto por estas três etapas, o ciclo é repetido por aproximadamente 
35 vezes até que se obtenha o DNA amplificado em quantidades suficientes para as futuras análises 
(figura 3). A quantidade de DNA amplificado segue uma função exponencial: 
N= N0 x 2
n, 
onde
N = quantidade final de DNA amplificado
N0 = quantidade inicial de DNA molde
n = números de ciclos da reação
Desta forma, para uma molécula de DNA alvo teremos, no final de 35 ciclos, 235 moléculas. 
Figura 3. Reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação inicia com uma molécula de DNA que no final de 
dois ciclos originam 4 moléculas de DNA idênticas a molécula molde.
Fonte: Figura modificada do site <http://acccn.net/Bio/book/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/lec24.html>.
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Uma variável da técnica de PCR é a RT-PCR, que é composta por duas partes: a 
primeira corresponde à reação da transcrição reversa, e a segunda a PCR. A diferença 
básica entre a PCR e a RT-PCR é que na última sintetiza-se moléculas de DNA a partir 
de moléculas de RNA mensageiro (mRNA) como molde, diferente do PCR que o 
molde é DNA. Desta forma, podemos obter apenas a região codificadora de um 
gene eucarioto. Ou seja, a sequência que tem a informação final para a codificação 
de uma proteína.
Recordando: 
1. O gene eucarioto é formado por sequências de DNA codificantes chamadas de éxons 
e por sequências não codificantes chamadas de íntrons. No processo de transcrição 
do gene, teremos um mRNA chamado de transcrito primário. Este transcrito 
passará por algumas etapas de processamento, sendo uma delas a retirada dos 
íntrons originando o mRNA maduro, o qual será responsável pela codificação de 
uma proteína no processo de tradução (figura 4). A partir do mRNA maduro que 
ocorre a síntese da molécula de DNA na RT-PCR.
2. A descoberta da enzima transcriptase reversa resultou na reavaliação do “dogma 
central”, o qual postulava que o fluxo da informação genética era unidirecional: 
[DNA → RNA → Proteína]. Após tal descoberta, observou-se que [DNA ↔ RNA→ 
Proteína].
Figura 4. Transcrição do gene eucarioto e o processamento do mRNA.
Fonte: Modificado a partir de: <http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/acidos-nucleicos/acidos-nucleicos-8.php>. 
Na primeira etapa da RT-PCR, moléculas de mRNA são moldes para a síntese de uma fita de DNA 
complementar a sua sequência, chamada de cDNA. Nesta etapa, utiliza-se apenas um oligonucleotídeo 
que geralmente não é tão específico quanto no PCR, pois este é formado por uma sequência de 
Timinas (oligo-dT) que irá anelar na cauda poli-A presente nos mRNAs. A polimerização da cadeia 
de cDNA é realizada pela adição dos nucleotídeos (dNTPs) complementares a fita de mRNA pela 
enzima transcriptase reversa. Após a síntese do cDNA, o mRNA molde é degradado pela ação da 
enzima RNAse-H e o DNA fita simples fica disponível para iniciar a PCR (figura 5).
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A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
Figura 5. Primeira etapa da RT-PCR. Síntese da fita de cDNA a partir de mRNA como molde pela ação da enzima 
transcriptase reversa. Após esta etapa o cDNA está disponível para iniciar a PCR. A segunda etapa da reação 
é uma PCR, onde dois oligonucleotídeos específicos para o gene determinarão a região a ser amplificada. 
No primeiro ciclo da reação, temos apenas DNA fita simples, logo, apenas um dos nucleotídeos terá sua fita 
complementar para parear. No final deste ciclo teremos como produto DNA fita dupla. Nos próximos ciclos a 
reação ocorre seguindo uma progressão exponencial, como já descrita anteriormente.
Fonte: Modificado a partir de: <http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliocdna_frame.htm>.
Mas qual o porquê de se obter DNA a partir de RNA? 
Como já mencionado acima, esta é a forma que temos de obter apenas a sequência codificadora de 
um gene eucarioto. Mas você poderia perguntar: e daí? 
Em primeiro lugar, este é um dos motivos mais importante para o uso desta técnica, pois grande 
parte dos estudos em biologia molecular é realizado em bactérias, expressando-se proteínas de 
eucariotos neste organismo e subsequentemente purificando-as. Bactérias, diferente de eucariotos, 
não possuem íntrons em seu DNA, e desta forma, não possuem a maquinaria necessária para, após 
a transcrição, retirar os íntrons do mRNA. Por isso a RT-PCR veio para resolver este problema, pois 
agora conseguimos obter apenas a sequência codificante dos genes eucariotos para então expressá-
los em bactérias. 
Mas você ainda poderia questionar: não se pode expressar genes em organismos eucariotos? Sim, 
mas muitos genes eucariotos são muito grandes para serem manipulados de forma a gerarem DNA 
recombinante para este fim.
Em segundo lugar, os cDNAs nos permitem avaliar o padrão de expressão dos genes, de um 
organismo ou de partes deste organismo, em diferentes condições ambientais ou de estresse, por 
exemplo. 
A técnica de PCR continua tendo como uso principal o processo de amplificação de sequências 
específicas de DNA, mas atualmente várias novas aplicações são dadas a esta técnica, tais como: 
sequenciamento de DNA, análise de polimorfismo, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, é 
aplicada nos testes de paternidade e na Medicina Forense, como também na criação de organismos 
transgênicos.
24
UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Se a PCR é um processo de replicação do DNA in vitro, então:
 » Na célula, quem é responsável pela função da elevação da temperatura 
para 94oC?
 » Quem é o análogo dos oligonucleotídeos na célula e qual a diferença 
básica entre eles?
 » Compare as etapas da PCR e a replicação do DNA na célula, e você 
entenderá o quanto foi merecido o prêmio Nobel que Mullis recebeu.
Animações para o melhor entendimento da PCR:
<http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk&feature=related>
<http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html>
<http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ>
<http://www.youtube.com/watch?v=rd1-QpJNTF8&feature=related>
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CAPÍTULO 2
Sequenciamento de DNA
A primeira pergunta que deve ser respondida neste capitulo é: o que é o sequenciamento de DNA? 
É uma técnica que tem por finalidade determinar com fidelidade a sequência dos nucleotídeos que 
compõem um determinado DNA, independente de sua origem e, desta forma, dando as moléculas 
de DNA uma marca digital, ou seja, um registro que pertence só a ela.
Trabalhando independentemente, Frederick Sanger e Walter Gilbert desenvolveram as primeirastécnicas de sequenciamento do DNA. O primeiro método de sequenciamento de DNA foi desenvolvido 
em meados da década de 1970 e é conhecido como sequenciamento químico ou Maxan-Gilbert. 
O segundo, e mais utilizado, é o sequenciamento enzimático também conhecido como método de 
Sanger, método dideoxi ou método de terminalização. Sanger utilizou sua técnica para sequenciar o 
genoma do bacteriófago φX174 (5.375 nucleotídeos), podendo ser considerada a primeira descrição 
do genoma completo de um organismo. Já Gilbert sequenciou um operon de um genoma bacteriano. 
Juntos Gilbert e Sanger compartilharam com Paul Berg o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina, 
em 1980.
A metodologia do sequenciamento de DNA, nos dias atuais, tem como fundamentos o método de 
Sanger, com várias modificações que permitiram automatizar a técnica. 
Para explanarmos o sequenciamento automático do DNA baseado no método de Sanger, é necessário 
relembrarmos alguns conceitos importantes referentes ao DNA. Na síntese do DNA, temos como 
precursores os desoxinucleotídeos ou nucleotídeos (dNTP) que possuem a seguinte estrutura (figura 6).
Figura 6. Esquema ilustrativo da estrutura de um desoxinucleotídeo ou nucleotídeo (dNTP). P corresponde ao grupo 
fosfato; BN, base nitrogenada que pode ser adenina ou timina ou guanina ou citosina. E no centro a pentose na 
qual os carbonos estão numerados de 1’ a 5’. 
Estes nucleotídeos polimerizam por meio de ligação fosfodiéster entre a hidroxila na posição 3’ de 
um nucleotídeo e o grupo fosfato na posição 5’ do nucleotídeo a ser adicionado. A nova fita de DNA 
é estendida a partir da hidroxila 3’ (figura 7).
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Figura 7. Esquema ilustrativo da polimerização da cadeia de DNA. A seta indica ligação fosfodiéster entre a OH 3’ 
e o grupo fosfato 5’.
No método de sequenciamento automático de DNA, utiliza-se desoxinucleotídeos (dNTP) e os 
análogos, chamados de didesoxinucleotídeos (ddNTP), que se diferenciam dos dNTPs pela ausência 
da hidroxila na posição 3’ (figura 8). O que acarreta essa alteração veremos a seguir.
Figura 8. Esquema ilustrativo da estrutura de um didesoxinucleotídeo (ddNTP). P corresponde ao grupo fosfato; BN, 
base nitrogenada que pode ser adenina, timina, guanina ou citosina. E no centro, a pentose na qual os carbonos 
estão numerados de 1’ a 5’. A seta indica a ausência da hidroxila no carbono 3’.
Neste método de sequenciamento de DNA realiza-se uma reação de PCR onde são adicionados os 
componentes básicos da PCR (enzima, DNA molde, os quatros dNTPs e apenas um oligonucleotídeo). 
Além dos dNTPs são adicionados em quantidades menores (1%) os quatros ddNTPs. Estes ddNTPs 
encontram-se marcados com sondas fluorescentes distintas, que permitem distingui-los um dos 
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A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
outros quando excitados com laser. Durante a reação de PCR, de forma aleatória, um ddNTP é 
inserido na cadeia no lugar do respectivo dNTP e a polimerização da cadeia é finalizada, parando 
assim a reação (figura 9). 
Figura 9. Esquema ilustrativo da interrupção da polimerização da cadeia nucleotídica devido a adição de um 
ddNTP. A seta indica a ausência da hidroxila na posição 3’, sendo assim impedindo a formação de uma ligação 
fosfodiéster com o próximo dNTP.
Logo, é fácil imaginar que se temos quantidades iguais dos ddNTPs competindo com os dNTPs para 
serem inseridos durante a polimerização da cadeia, o resultado da amplificação após os ciclos da 
reação, será uma mistura de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos e que foram finalizados 
pela adição de um ddNTP. Ou seja, os fragmentos diferenciam-se por um nucleotídeo até atingir o 
tamanho total do fragmento de DNA molde (figura 10).
Concluída a PCR, a próxima etapa é a separação dos fragmentos de DNA amplificados por 
tamanho em eletroforese em gel de poliacrilamida em placa (sequenciadores mais antigos) ou em 
microcapilares (sequenciadores modernos). À medida que os fragmentos de DNA migram pelo gel 
eles são separados por ordem de tamanho crescente. A sonda fluorescente presente no ddNTP, que 
finaliza o fragmento, é excitada por um feixe de laser e então emite uma fluorescência específica que 
o caracteriza. Esta fluorescência será capturada por um sistema de detecção que converte esse sinal 
em um gráfico chamado de eletroferograma (figura 11). 
Um eletroferograma é composto por uma sequência de picos de quatro cores diferentes e cada cor 
corresponde a um dos quatros ddNTPs que foram adicionados durante a polimerização da molécula 
de DNA. 
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Figura 10. Fragmentos de DNA produzidos após a adição de ddNTPs na PCR. As letras minúsculas e em negrito 
correspondem ao oligonucleotídeo utilizado na PCR. As letras maiores e em negrito no final de cada fragmento 
correspondem ao ddNTP introduzido, interrompendo assim a polimerização.
O maior progresso na técnica de sequenciamento automático é a utilização do laser e o uso de 
programas de computadores específicos para converter o sinal da fluorescência para uma linguagem 
por nós compreendida.
O desenvolvimento do sequenciamento automatizado do DNA foi essencial para o surgimento da 
era dos genomas, na qual vários projetos de sequenciamento de genomas de organismos diferentes 
foram desenvolvidos, entre eles o humano. Antes de o sequenciamento ser automatizado, o 
sequenciamento de DNA manual era utilizado apenas em pequena escala e era inimaginável decifrar 
um genoma tão complexo quanto o humano. Novos aperfeiçoamentos foram adicionados à técnica 
de sequenciamento automático, como o Shotgun e o pirosequenciamento, tornando-a mais eficaz e 
rápida.
O sequenciamento do DNA e os projetos genomas foram os responsáveis pelo crescimento de uma 
nova área da ciência biológica, a Bioinformática. A partir de então, surgiram os bancos de dados 
de sequências, várias ferramentas para análises de sequências foram desenvolvidas e toda está 
tecnologia encontra-se disponível para qualquer pessoa em sites na web. 
29
A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
Figura 11. Etapas do sequenciamento automático do DNA, baseado no método de Sanger.
Fonte: Figura modificada do site: <http://www.papociencia.ufsc.br/bio5.htm>.
Pesquise as diferenças entre o método de Sanger e o método automático de 
sequenciamento de DNA.
Animação sobre o sequenciamento de DNA:
<http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html>
<http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM&feature=related>
30
CAPÍTULO 3
Enzimas de restrição e ligase: 
“montando o DNA”
Enzimas de restrição
Um processo de defesa das bactérias contra infecções virais é chamado de restrição/modificação. 
Neste processo, os vírus bacterianos (bacteriófagos), ao invadirem a bactéria, têm seu DNA 
reconhecido por nucleases (enzimas) bacterianas e estas clivam o DNA viral de maneira específica, 
interrompendo o ciclo de replicação viral, que causaria a lise ou destruição da bactéria. Mas, por que 
o DNA da bactéria não é picotado? Simples, para cada enzima de restrição as bactérias produzem 
uma enzima modificadora, que protege seu DNA da ação das nucleases, marcando-o para diferenciá-
lo do DNA do vírus, geralmente por metilação. A enzima modificadora adiciona um grupo metil em 
uma ou duas bases, geralmente dentro do sítio de reconhecimento da enzima de restrição. Desta 
forma a molécula de DNA “camuflada” não é reconhecida pelas nucleases (figura 12). Este processo 
ocorre em diferentes espécies e linhagens de bactérias. 
Figura 12. Nucleases clivando DNA viral em um processo de proteção da célula bacteriana contra a infecção 
viral.
Fonte: Figura modificada do site: <http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/ pages/Lecture2/Lecture2.html>.
Estas nucleases são conhecidas como enzimas de restrição ou endonucleases (endo= dentro, 
nuclease=quebra) de restrição, são proteínas que reconhecem uma sequência específica dentro da 
dupla hélice do DNA e clivam em um ponto específico. As enzimas de restrição são classificadas em 
trêstipos, I, II e III:
 » Tipo I - reconhecem uma sequência específica assimétrica e bipartida e clivam o 
DNA a mais de 1000 pares de bases depois.
 » Tipo II - São as mais importantes para a Engenharia Genética e possuem algumas 
características interessantes: 
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A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
1. não precisam de ATP para realizar sua função;
2. reconhecem uma sequência simétrica (palíndroma) específica de 4, 6 ou 8 
nucleotídeos. Sequencias palíndromas são lidas simetricamente, ou seja, em ambas 
as direções se ler a mesma coisa, como exemplo: OVO, ANA, ARARA, RADAR, e 
REVIVER;
3. clivam dentro do sítio de reconhecimento;
4. clivam a ligação fosfodiéster;
 » Tipo III – reconhecem uma sequência assimétrica de 5 a 7 nucleotídeos e clivam 
aproximadamente 24 a 26 pares de bases depois.
Após reconhecer as sequências específicas, as enzimas do tipo II fazem dois cortes na molécula de 
DNA, um em cada fita. 
Existem dois tipos de cortes (figura 13):
1. Os dois cortes são feitos no eixo de simetria da sequência específica, gerando 
extremidades chamadas de abruptas.
2. Os dois cortes são feitos assimetricamente, mas no mesmo local, nas duas fitas do 
DNA, resultando em extremidades coesivas.
Figura 13. Tipos de extremidades produzidas no DNA pela ação de endonucleases do tipo II. (A) Extremidades 
coesivas geradas pela ação da endonuclease EcoRI. (B) Extremidades abruptas produzidas após clivagem com 
a endonuclease EcoRV. Em negrito a sequência de reconhecimento das endonucleases. 
Atualmente, já foram isoladas mais de 1000 enzimas de restrição de diferentes bactérias (tabela 2). 
Padronizou-se uma nomenclatura para as enzimas baseada na abreviação do nome do microrganismo 
do qual a enzima foi identificada e isolada:
 » Primeira letra maiúscula = gênero;
 » Segunda e terceira letras = espécie;
 » Letra adicional = cepa da bactéria.
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Número em algarismo romano = número da enzima descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada:
Por exemplo: HindIII é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III
 » EcoRI é isolada de Escherichia coli, linhagem RY13 e foi a primeira enzima de 
restrição identificada nesta espécie.
 » EcoRV é isolada de Escherichia coli, linhagem RY13 e foi a quinta enzima de 
restrição identificada nesta espécie.
Tabela 2. Enzimas de restrição comumente utilizadas na engenharia genética. 
Visto que o DNA é formado por 4 nucleotídeos (A, T, G e C) e assumindo que estes nucleotídeos 
são distribuídos ao acaso dentro da sequência, a frequência de reconhecimento de uma enzima 
de restrição é 4n, onde n é igual ao número de nucleotídeos que a enzima reconhece, desta forma, 
enzimas que reconhecem:
 » 4 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 44= 256 nucleotídeos;
 » 6 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 46= 4096 nucleotídeos;
 » 8 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 48= 65536 nucleotídeos.
Porém, estes valores podem sofrer variações significativas, dependendo principalmente da 
composição de bases do DNA analisado.
Uma importante consequência da ação destas enzimas é que quando uma determinada molécula 
de DNA é clivada com uma endonuclease, ela vai clivar sempre nos mesmos pontos, gerando assim 
sempre o mesmo conjunto de fragmentos de DNA, ou seja, terá um padrão de restrição específico, 
permitindo, desta forma, o isolamento de fragmentos de DNA de interesse. Os sítios das enzimas 
de restrição são distribuídos de forma randômica dentro da molécula, implicando na geração de 
fragmentos de DNA de vários tamanhos após a sua ação.
33
A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
Outra consequência que é de fundamental importância é o fato que após a clivagem do DNA, este 
passa a ter extremidades de fita simples (coesivas) que permitem a ligação de outra molécula de 
DNA que possua extremidade de fita simples e complementar. Ou seja, se tivermos dois fragmentos 
de DNA produzidos pela ação da mesma enzima de restrição, estes fragmentos podem ser unidos 
gerando uma molécula de DNA recombinante. Estas duas características, junto com a facilidade 
de se obter estas enzimas, fazem com que as enzimas de restrição sejam um dos pilares do 
desenvolvimento da Engenharia Genética. Esta é uma das ferramentas que permitiu manipular o 
DNA com extrema precisão.
Além da construção de moléculas de DNA recombinantes, estas enzimas são utilizadas nos testes 
de paternidade, na Medicina Forense, na construção de bibliotecas genômicas como as usadas nos 
projetos genomas. 
Poderíamos estudar alterações na sequência do DNA por análise do seu padrão de 
restrição?
Conhecendo melhor as enzimas de restrição:
<http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html>
Ligases
E agora que já mencionamos anteriormente que podemos ligar dois fragmentos de DNA gerando 
um DNA recombinante, estudaremos como isso acontece no laboratório.
Vamos primeiro lembrar qual a molécula na célula é responsável pela ligação de fragmentos de DNA 
durante o processo de replicação. No processo de replicação do DNA, uma das fitas é sintetizada de 
forma contínua e a outra descontínua. Nesta última, são sintetizados fragmentos de DNA, chamados 
de fragmentos de Okazaki, que serão ligados pela ação da enzima DNA ligase.
Da mesma forma que ocorre na célula, nós realizamos a ligação de moléculas de DNA no laboratório 
(in vitro), utilizando a enzima DNA ligase, só que neste caso, a enzima é codificada pelo bacteriófago 
T4 e é conhecida como T4 DNA ligase. Esta enzima catalisa a ligação fosfodiéster entre a hidroxila 
3’ de um nucleotídeo e o grupo fosfato 5’ do próximo nucleotídeo. Ela pode ligar fragmentos de 
DNA com extremidades coesivas ou abruptas, porém extremidades abruptas são ligadas com baixa 
eficiência. 
Os requisitos necessários para a ação da T4 DNA ligase são (figura 14):
 » uma hidroxila livre na extremidade 3’ de um dos fragmentos do DNA;
 » um grupo fosfato livre na extremidade 5’ do outro fragmento de DNA;
34
UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
 » temperatura baixa (de 16 a 22 °C) para favorecer o encontro das moléculas de DNA 
e o pareamento das bases nitrogenadas complementares.
Figura 14. Reação de ligação promovida pela T4 DNA ligase. Em negrito, os nucleotídeos que foram unidos por 
ligação fosfodiéster promovida pela ligase.
Estamos agora montando um quebra cabeça, pois moléculas de DNA com 
extremidades coesivas só podem ser unidas se as extremidades forem 
complementares. Porém, moléculas com extremidades abruptas não são tão 
seletivas para se unirem, basta a hidroxila 3’ e o grupo fosfato 5’ e tudo pode 
acontecer. Pensando em construir uma molécula de DNA recombinante, qual é 
a melhor opção, extremidades coesivas ou abruptas? E por quê? Pensem nesta 
questão como se estivessem montando um LEGO®.
Enzimas de restrição e DNA ligase trabalhando juntas:
<http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0&feature=related>
35
CAPÍTULO 4
Extração, purificação de DNA e 
eletroforese
Até o momento, já aprendemos que podemos:
 » amplificar um fragmento de DNA por meio da técnica de PCR;
 » clivar o DNA em regiões específicas; e
 » unir fragmentos de DNA. 
Mas nos falta saber como obter a amostra de DNA para iniciarmos qualquer estudo. Sendo esta 
molécula alvo de análises em exames de paternidade, em projetos genomas, em Medicina Forense, 
em estudos evolutivos, na Engenharia Genética. E, lembrando que há diferentes fontes de DNA, 
desde pequenos microrganismos, até os diversos tecidos e secreções de organismos superiores, além 
de fósseis, seria difícil a existência de apenas um protocolo para a extração do DNA. Independente da 
fonte, alguns princípios são válidos para todos os procedimentos de purificação, mas não podemos 
deixar de mencionar que algumas particularidades são adicionadas ao procedimento dependendo 
da fonte do DNA. Abaixo estão descritas as etapas básicas da extração de DNA (figura 15):
1. Primeiro, o DNA tem que ser liberado de dentro da célula para ser purificado, desta 
forma, aprimeira etapa é a lise das membranas plasmáticas e nucleares. Para este 
fim, utilizam-se agentes, como detergentes, que rompam interações hidrofóbicas 
e destruam a bicamada lipídica. Para organismos que possuem parede celular, é 
necessário o uso de enzimas associadas a processos mecânicos para destruí-la.
2. Degradação das proteínas, inclusive nucleases que possam degradar o DNA. 
Geralmente utiliza-se proteinases (enzimas que degradam proteínas), ou até mesmo 
alteração do pH deixando-o muito alcalino para assim inativar as enzimas.
3. Isolamento do DNA, esta etapa pode ser realizada de diversas formas, desde a 
mais antiga e eficiente, que consiste na precipitação do DNA na presença de sal e 
álcool (etanol ou isopropanol), até com o uso dos diversos kits de purificação que se 
encontram no mercado. Estes kits têm como principio o uso de uma resina, que por 
afinidade, o DNA se liga a ela e depois é liberado pela passagem de uma solução (por 
exemplo, água) a qual o DNA é mais afim.
Figura 15. Etapas da purificação de DNA. (1) Rompimento das células com liberação do material celular. (2) 
Precipitação de proteínas e outros componentes celulares. (3 e 4) Precipitação do DNA após adição de sal e álcool. 
36
UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Estas etapas também são realizadas nos procedimentos de purificação de RNA, mas com alguns 
cuidados adicionais, pois a molécula de RNA é muito instável e de fácil degradação.
DNA, sal e álcool = precipitação do DNA. Por quê?
Eletroforese 
Já extraímos e manipulamos o DNA. Agora chegou a hora de apresentarmos a vocês a técnica que 
nos permite monitorar tanto a qualidade do DNA extraído, como confirmamos que a amplificação 
do DNA foi eficiente, ou então, que a ação das enzimas de restrição resultou no padrão de restrição 
esperado.
A eletroforese do DNA em gel é a técnica mais utilizada dentro de um laboratório de biologia 
molecular, pois com ela todas as etapas do processo de clonagem molecular são monitoradas. A 
técnica tem como base o fato das moléculas de DNA serem carregadas negativamente devido aos 
grupos fosfatos presentes ao longo da cadeia. 
Recordando: um corpo com carga (negativa ou positiva) quando submetido a uma diferença de 
potencial, por exemplo, os polos de uma bateria conectados à solução contendo este corpo, ele irá 
migrar no sentido do polo com carga contrária a sua. Desta forma, um corpo com carga negativa 
migrará para o polo positivo e um corpo com carga positiva, para o polo negativo. Então, quando 
submetemos moléculas de DNA a uma diferença de potencial elétrico, elas irão migrar para o polo 
positivo do campo elétrico.
A essa migração de moléculas quando submetidas a uma diferença de potencial chamamos de 
eletroforese.
Vários são os problemas que não tornam viável a realização de eletroforese em solução, como a 
migração das moléculas dispersamente durante o processo, perturbações mecânicas e movimentos 
do líquido durante o processo. Atualmente, para contornar estes problemas, as eletroforeses são 
realizadas em sistemas que utilizam um suporte que, geralmente, é formado por uma matriz rígida 
de papel ou gel que permite a migração da molécula.
Na eletroforese do DNA utiliza-se como suporte um gel de agarose e, em algumas análises mais 
específicas, gel de poliacrilamida. A escolha da matriz de agarose ou de poliacrilamida depende do 
tamanho dos fragmentos de DNA a serem analisados. Géis de agarose formam poros maiores que o 
de poliacrilamida. Desta forma, ele é ideal para fragmentos que variam de 200 pares de bases (pb) 
a 50.000 pb (50 Kpb). Já o gel de poliacrilamida tem ótima resolução para fragmentos de até 1.000 
pb. A desvantagem em utilizar a acrilamida como rotina para eletroforese de DNA é o seu caráter 
neurotóxico quando em solução, e por ser mais laborioso o preparo do gel.
37
A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
A agarose é um polissacarídeo que forma uma malha cuja porosidade é dependente da sua 
concentração. O tamanho dos poros desta matriz é inversamente proporcional à concentração de 
agarose e diretamente proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar 
(tabela 3).
Tabela 3. Concentração de agarose em eletroforese de DNA 
Concentração de agarose (% P/V) Tamanhos de fragmentos separados com boa 
resolução (pares de bases)
1 500 – 10.000
1,2 400 – 6.000
1,5 200 – 3.000
2,0 100 - 200
Fonte: Tabela adaptada de Sambrook, 2001.
Após o preparo do gel, as amostras de DNA são aplicadas em pequenos poços presentes em uma 
das extremidades do gel, onde será aplicada a carga negativa. Na extremidade oposta temos o 
polo positivo. Assim, o DNA irá migrar na direção do polo positivo. A malha de agarose funciona 
como uma barreira para as moléculas de DNA, de forma que as moléculas menores migram mais 
rapidamente pelo gel e as maiores são parcialmente retidas e migram mais lentamente. Logo neste 
procedimento o DNA é separado por seu tamanho em pares de bases. 
Alguns fatores influenciam na mobilidade das moléculas de DNA durante a eletroforese:
 » Intensidade da voltagem aplicada: quanto maior for a intensidade, maior será a 
velocidade com que as cargas se dirigem para o polo com carga oposta a sua.
 » Quanto maior for a carga total da molécula, maior será a atração eletrostática da 
molécula pelo polo de carga oposta, dessa forma mais rápida será sua migração.
 » Por outro lado, quanto maior for a molécula, mais lenta será sua migração devido a 
barreira que será imposta pela malha do gel. 
Para finalizar, é necessário visualizar o DNA. Para este fim o gel é corado com uma solução de 
brometo de etídio que se intercala entre as bases nitrogenadas do DNA. Em seguida, o gel é exposto 
à luz ultravioleta e o brometo de etídio emite fluorescência. Neste procedimento, utiliza-se uma 
amostra de DNA composta por fragmentos de tamanho conhecido como padrão para comparação 
com as amostras em análises (figura 16).
38
UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Figura 16. Eletroforese de DNA em gel de agarose. (A) Estrutura do polímero de agarose e da molécula de 
brometo de etídio intercalada na no DNA. Cargas negativas do DNA e malha do gel de agarose. (B) Foto de um 
gel de eletroforese de DNA após excitação do brometo de etídio com luz ultravioleta.
Fonte: Figura modificada do site: <http://2008.igem.org/Team:Heidelberg/Human_Practice/ Phips_the_Phage/Technical_
Backround>.
Vídeo que expõe todo o procedimento de eletroforese no laboratório.
<http://www.youtube.com/watch?v=6mQGNDnOyH8&feature=related>
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CAPÍTULO 5
Transformação bacteriana
O processo de transformação consiste em inserir um DNA recombinante ou não na célula de 
bactéria. Este processo normalmente confere novas características às bactérias, como por exemplo, 
a resistência a antibiótico. Griffith em 1928 foi o primeiro a observar este processo em bactérias. 
Os principais procedimentos de transformação bacteriana são: choque térmico e eletroporação.
Transformação de bactéria por choque 
térmico
O método mais antigo e ainda mais utilizado para “persuadir” a bactéria a recolher o DNA exógeno 
é o método da transformação por choque térmico descrito por Mandel e Higa em 1970. Desde 
então, o método já sofreu algumas modificações visando maior eficiência, mas os fundamentos 
permaneceram. Estes pesquisadores observaram que células de Escherichia coli, quando tratadas 
com solução de cloreto de cálcio e, em seguida, submetidas a um curto choque térmico, a eficiência 
da transformação era maior.
Nesse processo, as células precisam ser tratadas para se tornarem cálcio-competentes. As células na 
fase de crescimento exponencial (log) passam por etapas de lavagens para eliminar as impurezas e em 
seguida passam por pelo menos uma etapa de incubação em solução de cloreto de cálcio (CaCl2) e no 
final do processo são mantidas nesta solução a baixa temperatura. A mistura de células e DNA que se 
encontra incubada em gelo é então submetida a um rápido choque térmico, aproximadamente 1 minuto 
a 42oCpara promover a entrada do DNA na célula. Finalmente as células são colocadas em meio de 
cultura para se recuperarem do choque e em seguida são distribuídas em meio de cultura contendo o 
agente seletivo (antibiótico) para a seleção das células que foram eficientes em receber o DNA exógeno.
O mecanismo pelo qual o DNA é captado pela célula ainda não é bem conhecido, mas uma das 
hipóteses que tenta explicá-lo sugere que:
1. as moléculas do DNA passem através de canais situados nas zonas de adesão, que 
são locais onde as membranas interna e externa da célula bacteriana unem-se 
formando poros. A necessidade das células na fase exponencial é justamente porque 
estes poros só estão presentes nesta fase de crescimento; 
2. a entrada do DNA nas células é dificultada pela repulsão eletrostática entre as cargas 
negativas dos grupos fosfatos do DNA e as cargas negativas dos fosfolipídeos que 
compõem a membrana bacteriana. Os íons de cálcio (Ca2+) estariam interagindo 
com as cargas negativas criando um ambiente eletrostaticamente neutro;
3. a baixa temperatura (0oC, banho de gelo) congela os lipídeos resultando na perda da 
fluidez da membrana celular. Quando as células são submetidas ao choque térmico 
geram um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula provocando a 
dilatação dos poros da zona de adesão e o DNA passa através deles.
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Transformação de bactéria por eletroporação
A eletroporação tem como fundamentos a aplicação de pulsos elétricos que aumentam a capacidade 
de transporte através da membrana pela formação de poros transitórios na bicamada lipídica 
permitindo a migração de macromoléculas através destes poros. 
Está técnica é rápida e amplamente utilizada para introduzir moléculas de DNA recombinantes 
tanto em bactéria quanto em leveduras. 
As células devem inicialmente ser tratadas para se tornarem eletrocompetentes, ou seja, tem que se 
tornarem capazes e eficientes na formação dos poros após a submissão a pulsos elétricos de forma a 
permitir a entrada do DNA. Este procedimento é muito simples e consiste em obter as células na fase 
de crescimento exponencial e em seguida submetê-las a várias etapas de lavagem para eliminação 
principalmente de íons e impurezas provindas do cultivo. 
Para transformar as células por eletroporação basta aplicar o choque elétrico a uma mistura contendo 
as células e o DNA, as membranas serão então desestabilizadas e o DNA penetra na célula (figura 
17). Em seguida, as células são transferidas para o meio de cultura sob as melhores condições de 
temperatura, para que as mesmas possam se recuperar do choque e, finalmente, serem selecionadas. 
O choque elétrico é dado em um equipamento chamado de eletroporador.
Após toda a explicação acima vocês poderiam questionar: qual a importância da transformação 
bacteriana para a biologia molecular? Esta técnica esta entre as mais usadas na biologia molecular, 
pois as bactérias funcionam como “máquina” para a multiplicação de moléculas de um DNA 
recombinante e em outra situação como “máquina” para a síntese de proteínas exógenas. Em ambas 
as situações são necessárias inserir moléculas de DNA na bactéria. 
Figura 17. Princípios da transformação de bactéria por eletroporação. Após um choque elétrico poros são 
formados na membrana plasmática favorecendo a entrada das moléculas de DNA.
Fonte: Figura modificada do site: <http://www.byreginatorres.com/2011/08/eletroporacao.html>.
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A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
Animação sobre a transformação bacteriana:
<http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html>
42
CAPÍTULO 6
Vetor de clonagem molecular – 
plasmídeos
O objetivo inicial da tecnologia do DNA recombinante é gerar um grande número de uma molécula de 
DNA recombinante. Mas para isso não é suficiente apenas ligar duas moléculas, ou alterar a sequência 
de uma molécula de DNA. Para que se possa alcançar este objetivo, é necessário propagar este DNA 
em células hospedeiras. Mas como fazer isso? Inicialmente, precisamos inserir o DNA de interesse 
em um vetor de clonagem, que nada mais é do que moléculas de DNA que funcionam como um 
veículo que transporta um fragmento de DNA de interesse para o interior de uma célula hospedeira, 
que geralmente é uma bactéria, embora outras células possam ser utilizadas, como leveduras. 
Estas moléculas de DNA possuem duas características principais para sua função como vetores de 
clonagem: 
 » multiplicam-se dentro da célula hospedeira, gerando várias cópias idênticas; e
 » propagam durante a divisão das células hospedeiras para as novas gerações. 
Abaixo citaremos as características do principal vetor de clonagem utilizado na atualidade:
 » Os plasmídeos são moléculas de DNA circular que se encontram separadas do DNA 
cromossômico da célula. Este DNA circular geralmente ocorre naturalmente em 
células bacterianas e leveduras. Ele geralmente representa uma pequena fração do 
DNA total da célula hospedeira, mas que pode ser facilmente separado devido seu 
pequeno tamanho. Como o DNA cromossomal, o plasmídeo também é replicado 
durante a divisão celular, mas de forma independente do cromossomo, garantindo 
a propagação do mesmo através das gerações da célula. 
 » Os plasmídeos mais comumente utilizados na Biologia Molecular são oriundos de 
bactérias e foram modificados para atuarem mais efetivamente como veículo de 
propagação. Por exemplo, o tamanho foi reduzido quando comparado ao plasmídeo 
selvagem para facilitar sua manipulação. Desta forma, eles carregam, quase sempre, 
pouco DNA a mais que o necessário para sua função.
Estes plasmídeos possuem:
1. uma origem de replicação (ORI), que lhes confere a capacidade de se replicarem 
dentro da célula hospedeira;
2. um ou mais genes que conferem resistência a antibióticos. As células hospedeiras 
passam a ter resistência ao antibiótico (por exemplo, ampicilina, cloranfenicol, 
canamicina) quando carregam estes plasmídeos. Estes genes são conhecidos como 
marca de seleção, pois são essenciais para a seleção das células que contém o plasmídeo;
43
A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
3. outra forma de seleção, o sistema azul e branco da β-galactosidase. Quando 
um fragmento de DNA é inserido no plasmídeo, ele quebra o gene lacZ da 
β-galactosidase não permitindo que a bactéria expresse esta enzima. Se o processo 
de clonagem não for eficiente, o gene da β-galactosidase não será interrompido. 
Logo, a bactéria produzirá esta enzima que, quando entrar em contato com seu 
substrato que é incolor, ela o degradará e gerará um produto azul. Sendo assim, 
neste sistema, a presença de colônias de bactérias azuis significa que o fragmento 
de DNA de interesse (inserto) não foi clonado, e nas colônias brancas, o inserto foi 
inserido no plasmídeo.
Devem possuir um ou mais sítios de reconhecimento para enzimas de restrição. Normalmente, 
os plasmídeos possuem uma pequena região onde são encontradas sequências para enzimas de 
restrição, a esta região dá-se o nome de múltiplo sítio de clonagem (MSC). Neste local, o plasmídeo 
será clivado por endonucleases, tornando-se linear de forma a permitir a inserção de um fragmento 
de DNA, que após a ação da DNA ligase retorna a condição circular.
Origem de replicação (ORI) – região específica de 50 a 100 pares de bases que 
determina o ponto de início da replicação do DNA. Uma vez que a maquinaria 
de replicação da célula reconhece a ORI, a replicação do DNA inicia e segue 
continuamente, independente do restante da sequência de nucleotídeos. Desta 
forma, qualquer sequência que for inserida no plasmídeo será replicada com ele.
Os plasmídeos são de fácil introdução na célula hospedeira e podem carregar fragmentos de DNA 
de até 10.000 pares de bases. Eles podem ser propagados em diferentes células hospedeiras, como 
bactérias e leveduras, para isto eles carregam as marcas de seleção adequadas para cada organismo 
e a capacidade de se replicarem (figura 18). 
Figura 18. Plasmídeo de clonagem.Esquema representativo de uma plasmídeo com seus componentes 
essenciais, onde: (ori), origem de replicação; (MSC), múltiplo sítio de clonagem; (ampR) gene que confere 
resistência ao antibiótico ampicilina e (lacZ’), gene da β-galactosidase, para o sistema de seleção branco-azul. 
Em destaque o múltiplo sítio de clonagem identificando as sequências de reconhecimento para algumas 
endonucleases.
Fonte: Figura adaptada do site: <http://www.engenhariageneticabioq.page.tl/Sequencia%E7%E3o-de-DNA.htm>.
44
UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
Os plasmídeos podem ser apenas vetores para a manutenção de uma informação genética na sua 
composição, com o propósito de armazená-la e propagá-la dentro da célula hospedeira. Sendo assim, 
os nomeados plasmídeos de propagação. Além destes, há também os plasmídeos de expressão que, 
além da função primordial, também atuam como vetores para a expressão de um gene de interesse 
na célula hospedeira. Os vetores de expressão podem ser: plasmídeos de expressão procarioto, cuja 
célula hospedeira para expressão do gene é a bactéria, ou plasmídeo de expressão eucarioto, podendo 
ser células hospedeiras de expressão leveduras, células de mamíferos, vegetais, entre outras.
Para este fim, além das características já mencionadas anteriormente os plasmídeos de expressão 
devem possuir:
1. uma região promotora facilmente reconhecida pela RNA polimerase, para assim 
iniciar o processo de transcrição;
2. sítio de ligação do ribossomo (RBS); 
3. sítios que determinam o início e o término do processo de tradução;
4. um sistema de indução da expressão, que geralmente ocorre pela adição de um 
agente indutor. 
Normalmente, nestes plasmídeos o gene de interesse encontra-se fusionado a uma sequência 
codificadora para uma cauda (por exemplo: resíduos de histidina) que facilitará a purificação da 
proteína de interesse. 
Para recordar, leia sobre os processos de transcrição e tradução e fique atento às sequências de 
reconhecimento para a realização destes processos.
45
CAPÍTULO 7
Biblioteca de DNA genômico e de 
cDNA
Em humanos, existem aproximadamente 35.000 genes distribuídos entre bilhões de pares de bases 
do complexo genoma. Os genes podem originar um ou mais tipos de mRNA, cujas as informações 
neles contidas serão traduzidas em proteínas. Além disso, alguns genes podem representar uma 
pequena fração do DNA total, como, por exemplo, os genes que possuem apenas uma cópia dentro 
do genoma. Para estudar qualquer um destes genes, é necessário identificá-lo e isolá-lo dos demais 
genes do organismo. As bibliotecas de DNA e cDNA surgiram para solucionar este problema.
As bibliotecas são coleções de fragmentos de DNA de organismos clonados num vetor e propagados 
em células hospedeiras, que devem ser representativas para aquele organismo ou tecido. De acordo 
com a origem do DNA, essas bibliotecas recebem nomes distintos:
1. Biblioteca de DNA genômico: como o próprio nome indica, os fragmentos de DNA 
são oriundos do DNA genômico do organismo.
2. Biblioteca de cDNA: o DNA origina-se do mRNA (por meio da transcriptase reversa), 
geralmente de tecidos do organismo, sendo assim representativa para aquele tecido. 
Um gene pode representar apenas um pequeno fragmento de 3000 pb dentro de um genoma de 
aproximadamente 3x109 pb e, por outro lado, um mRNA raro pode constituir apenas 1 entre 106 
mRNAs. Assim o maior problema na criação de uma biblioteca é gerar uma população enorme de 
clones, suficiente para garantir a representatividade destas espécies raras. Abaixo, abordaremos 
pontos importantes no preparo das bibliotecas que garantam essa representatividade.
Biblioteca genômica
É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um organismo. Como os 
genomas, em geral, são muito grandes, estas bibliotecas são montadas em vetores que permitam 
a clonagem de fragmentos grandes de DNA, por exemplo: fago, cosmídeo, YAc e BAC. Espera-se 
que uma biblioteca genômica contenha todas, ou quase todas, as sequências do genoma alvo. Logo, 
estas bibliotecas são preparadas pela fragmentação do DNA alvo e pela inserção dos fragmentos em 
um vetor de clonagem. A fragmentação do DNA genômico foi a solução encontrada para resolver 
o problema de como estudar e montar genomas tão grandes. Mesmo os mais simples possuem um 
tamanho incompatível com qualquer vetor de clonagem.
A fragmentação do DNA tem algumas características:
1. é aleatória;
2. contém cópias representativas de todo o genoma; e
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
3. gera fragmentos sobrepostos.
As regiões que se sobrepõem aos fragmentos e determinam a posição deles dentro do genoma, 
consequentemente permitindo a montagem do genoma (figura 19). 
Figura 19. Fragmentação do DNA gerando fragmentos sobrepostos.
Basicamente, são dois os métodos de fragmentação do DNA:
» Quebra mecânica: 
 › Sonicação: o DNA é quebrado pela ação de ondas sonoras de alta frequência.
 › Nebulização: a quebra do DNA é realizada pela ação do gás de nitrogênio.
» Quebra enzimática: a quebra do DNA é realizada pela ação de enzimas de restrição. A 
fragmentação geralmente é parcial, de forma que nem todos os sítios para uma determinada 
enzima sejam cortados. Isso é possível controlando a quantidade da enzima e o tempo da 
reação. A digestão parcial é importante para gerar os fragmentos sobrepostos, o que não 
acontece se a digestão for completa (figura 20).
Figura 20. Digestão completa e parcial do DNA genômico.
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A MANIPULAÇÃO DO DNA │ UNIDADE II
Uma biblioteca genômica de boa qualidade tem que conter essencialmente todas as sequências 
do DNA genômico. Para garantir a representatividade de um determinado gene de interesse, é 
necessário produzir milhares de clones. Mas como determinar a quantidade suficiente de clones?
Supondo que todas as sequências de DNA têm chances iguais de serem inseridas em um vetor de 
clonagem, após a fragmentação do DNA, a probabilidade (P) de uma sequência específica estar 
presente é dada por:
In(1 P)N
IIn 1
G
−
=
 −  
onde:
N: número necessário de clones; 
I: tamanho médio dos fragmentos clonados (pares de bases); e
G: tamanho do genoma do organismo (pares de bases).
Logo, para uma probabilidade de 99% de isolar um gene do genoma de um mamífero que possui 
3x109 pares de bases usando um vetor fago (capacidade para fragmentos de até 2x104), será 
necessário 690.000 clones. 
4
9
In(1 0,99)N
2x10In 1
3 x10
−
=
 
− 
 
Em geral, esta equação mostra que para alcançar 99% de chance de isolar uma sequência específica, 
o número total de clones deverá corresponder, em pares de bases, a um total de 4,6 vezes o tamanho 
do genoma. Este corresponde à cobertura mínima do genoma para se identificar uma sequência 
específica.
Basicamente, os passos para montagem de uma biblioteca são 4:
1. Purificação do DNA genômico.
2. Fragmentação do DNA genômico.
3. Ligação dos fragmentos em vetor de clonagem (fago ou cosmídeo ou BAC ou YAC).
4. Propagação dos DNAs recombinantes em células de bactéria.
Finalmente, você pode se perguntar: Qual a utilidade prática para a montagem de bibliotecas 
genômicas?
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UNIDADE II │ A MANIPULAÇÃO DO DNA
As bibliotecas genômicas são as fontes das informações dos projetos genomas. Nestes projetos, 
monta-se a biblioteca e, após a propagação em bactéria, extraem-se os DNAs recombinantes das 
células transformantes para então serem sequenciados. Em seguida, com o uso da bioinformática, 
monta-se o genoma identificando todos os genes que o constitui, incluindo as regiões não codificantes. 
A sobreposição dos fragmentos permite a montagem do genoma.
Quando se quer estudar uma região não codificante do DNA, mais importante para a regulação 
da transcrição, por exemplo, estas bibliotecas são a fonte para o material de estudo. Pois, a partir 
deste tipo de biblioteca, pode-se identificar e isolar sequências de interesse por meio de técnicas de 
hibridização e PCR.
Biblioteca de cDNA
As bibliotecas de cDNA, diferentemente das genômicas,