Isolamento de bactérias aeróbias e anaeróbias

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IMPORTÂNCIA DO ISOLAMENTO 
Trabalho com cultura bacteriana de forma 
individualizada. Quando coletamos uma amostra 
clínica com suspeita de infecção bacteriana, essa 
amostra pode estar contaminada com outras 
bactérias que podem não estar relacionados com a 
infecção. Por isso o isolamento, para fazer testes de 
detecção. 
 
Crescimento em caldo 
 
Isolamento primário – 1° meio de cultura que é 
utilizado para inocular a amostra que foi coletado e 
esse isolamento varia de acordo com o 
objetivo/bactéria que estamos procurando. Existem 
bactérias que chamos de bactérias fastidiosas que 
possui uma exigência nutricional complexa, são 
bactérias competitivas, quando a isolam precisa-se de 
um meio de cultura pré enriquecido para tentar a 
estimulação/multiplicação dessa bactéria fastidiosa e 
tentar inibir o crescimento de outras bactérias que 
não são de interesse naquele momento. Também 
pode usar meios bastante enriquecidos para estas 
bactérias competitivas, pois esses nutrientes que vão 
ajudar na recuperação dessas bactérias “mais 
sensíveis”. 
Antigamente se usava bastante meios líquidos e 
dificultava muito o isolamento em cultura pura, de um 
único microrganismo, porque nos caldos não se tem 
muita distinção de aspecto do crescimento das 
colônias bacterianas, podendo observar desde uma 
turvação à formação de sedimentos, ou um 
crescimento na superfície do caldo sobre que pode 
observar a formação de flóculos que ficam dispersos 
na coluna desse meio líquido. Então, com o uso dos 
meios sólidos as placas, os mesmos tubos de ensaios 
contendo meios de culturas sólidos com presença do 
 
 
 
Àgar, consegue fazer a diferenciação bem visível, 
pelas características das colônias e também o uso de 
algumas técnicas para chegar na identificação dessas 
colônias, na recuperação ou no isolamento dessas 
colônias bacterianas. 
Como são essas técnicas e como 
são usadas? 
Temos 3 técnicas que podem ser usadas para a 
inoculação da amostra em um meio de cultura sólido. 
1. Esgotamento por estrias – a mais usada não só 
para bactérias, mas também para fungos, usa-se alça 
de platina, um instrumento metálico que é 
reutilizável, tem uma haste metálica com a parte final 
revestida por isolante para que se possa segurar ali e 
não se queimar, e na outra ponta um fio metálico com 
a ponta arredondada onde vai ficar depositado o 
fragmento essa amostra. Existem também alças de 
platina descartáveis, tem uma grande vantagem por 
ser calibrada, ou seja, tem volume fixo, podendo ser 
usada em análise quantitativa já que depois fará uma 
conta para extrapolar o crescimento do n° de colônias 
com o volume que foi aferido com essa alça calibrada. 
Vai ser dado em microlitros e transfere-se para 
mililitros, essa transferência precisa dividir por 
x1000. 
 
• Flambagem – momento importante para a 
ealização desse método. A flambagem é 
método de esterilização, feito na chama do 
bico de Bunsen: 
- Passa a ponta da alça primeiro pela chama redutora 
e depois pela chama oxidante para ele evitar a 
formação dos aerossóis, a alça depois fica próxima ao 
redor desse bico de Bunsen, mas não encosta essa 
alça nem no bico e nem na bancada, tem que manter 
suspensa. Depois coleta o fragmento da amostra. 
 
 
 
Após coletar um fragmento da amostra, encosta a 
pontinha da alça de platina na placa, próximo a borda, 
e com movimentos fortes em zig zague até chegar ao 
meio da placa. Quando chega no centro da placa, leva 
novamente a alça para o bico de Bunsen para 
flambagem e depois novamente esfrega na placa, 
puxando pelas estrias e novamente em zig zague, leva 
até o centro da placa (quadrante lateral). Depois a 
placa é encubada e observará o crescimento, no 3° 
grupo, a formação das colônias isoladas. 
• As colônias são junções de milhares de células 
que levam à formação desses pontos visíveis 
na placa, a olho nu. A partir dessas colônias, 
iremos caracterizá-las. 
• Estriamento em quadrantes – ou 
estriamento composto, porque existe um 
processo de formar divisões, tendo a 
flambagem entre as divisões/quadrantes. 
 
 
• 4 grupos de estrias com flambagem da alça de 
platina entre elas, e puxando as últimas 
estrias e afasta do grupo anterior. Tem que 
ocupar toda a superfície da placa. 
• Estriamento simples – não feito flambagem, 
é estriamento contínuo do início ao fim. Faz-
se em um material com n° de células 
bacterianas pequenas. Por exemplo, pegando 
o grupo 1 da placa e indo até a outra ponta 
final, em zigue zague. 
Pode semear mais de uma amostra na placa: 
 
2. Semeadura em superfície (Spread plate) - o 
 
 
 
A semeadura é feita com movimentos 
circulares/uniforme, logo depois espalhamos esse 
0,1ml por toda a superfície da placa, para que, usando 
a placa for encubada e ter o crescimento das colônias, 
as colônias não terão aspectos concentrados no início 
e depois dispersos, e sim, estarão distribuídas 
uniformemente em toda a placa. É mais utilizado em 
testes quantitativos, importante para a microbiologia 
de alimentos. 
inóculo previamente 
diluído, é espalhado 
na superfície do ágar 
com auxílio da alça de 
Drigalsky 
Essa alça tem a opção 
descartável, de vidro e de metal. 
Sua diferença com a alça de 
platina, é que sua superfície de 
contato é bem maior, em forma 
de L, e sua inoculação é através 
do deposito de um pequeno 
volume na superfície do meio de 
cultura. Usa-se uma micro 
pepeta, uma amostra em 
suspensão líquida (se fosse sólida 
teríamos que preparar uma 
suspensão antes), e deposita no 
centro da placa 0,1ml dessa 
suspensão líquida. 
3. Vazamento em Placa (Pour Plate) – não usa 
meio de cultura pronto, e sim, usa-se uma placa vazia 
e estéril. Depositará nesta placa, um volume múltiplo 
de 10: 0,1 ou 1ml com auxílio de uma pepeta. 
Transfere da suspensão esse volume que 
estabelecemos, e logo em seguida acrescenta-se um 
meio de cultura favorável para o tal objetivo de 
estudo, o isolamento da bactéria. 
 
sólido e por último coloca a placa na estufa para 
aguardar o crescimento das colônias. Esse método o 
crescimento de colônias pode ser na superfície e ou 
dentro do no meio de cultura, e essas colônias que 
crescem dentro do meio de cultura, são bactérias 
anaeróbias (podem ser facultativas, presença ou 
ausência de O2, ou anaeróbias estritas). 
• Diluição seriada – a partir do inóculo de 
diluição da amostra. Proporção 1:10. Diluições 
escolhidas para contagem devem ter no 
mínimo 2- 30 colônias e no máximo 200 – 300 
colônias. 
 
Cada passagem de tubo, dilui-se 10x a suspensão da 
diluição anterior. O cálculo é feito em relação ao 
inóculo original, ou seja, o ultimo tubo está 
1.000.000x em relação ao inóculo original, o primeiro. 
Conforme vai diluindo, reduz o n° de células daquela 
suspensão por ml. Com as diluições sendo feitas, 
incubamos cada placa e observar as progressões. 
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE 
COLÔNIAS BACTERIANAS 
 
 
 
CLASSIFICAÇÃO DOS 
MICRORGANISMOS EM RELAÇÃO AO 
OXIGÊNIO 
exemplos de gasosa atmosférica ideal para diferentes 
grupos microbianos: 
 
1. Aeróbio estrito – só cresce na presença do oxigênio 
atmosférico; 
2. Anaeróbio estrito – só cresce na ausência do 
oxigênio atmosférico, somente CO2; 
O volume que a placa 
comporta é de 20 - 25 ml, e o 
meio de cultura tem que está 
aquecido a 45° C, para que o 
àgar esteja liquido para 
homogeneizar depois o meio 
de cultura junto com o 
inóculo da amostra. Essa 
homogeneização são 
movimentos em 8 da placa, 
na superfície da bancada, 
girando. Conforme a 
temperatura do ambiente 
abaixa, ele se torna 
 
3. Anaeróbio facultativo – cresce tanto na presença 
quanto na ausência de O2 (quando há presença de 
oxigênio, a multiplicação de células é muito maior por 
conta da carga de ATP que é gerada na respiração 
aeróbia); 
4. Microaerófilo – cresce na presença de 5% dooxigênio (aeróbios estritos na faixa dos 19%); 
5. Anaeróbio aerotolerante – bactéria que cresce em 
condições anaerobiose, mas tolera a presença do O2. 
 
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS 
AERÓBIAS 
Como é feito incubação de bactérias aeróbias. 
 
Placas posicionadas com a tampa para baixo para 
evitar a formação da água de condensação que pode 
contaminar as superfícies do meio de cultura. O 
crescimento é acompanhando ao longo dos dias, 
algumas formam colônias em um dia. 
 
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS 
ANAERÓBIAS – TÉCNICA GASPAK 
Para geração de CO2 que é usado para bactérias 
anaeróbias. É um sistema comercial, um envelope que 
serve para gerar Hidrogênio e CO2. Esse envelope 
vem dentro de uma embalagem de alumínio, fechado, 
é colocado dentro de uma jarra de acrílico, onde na 
jarra terá um suporte de aço inoxidável, onde irão 
empilhar a placa de Petri para isolamento de uma 
bactéria anaeróbia. 
 
 
 
 
Quando abrimos essa extremidade desse envelope, o 
contato com o ar faz com que os reagentes que estão 
na composição, gerem CO2 e Hidrogênio. Essa reação 
é catalisada pelo paládio (C) e nisso, o H vai se ligar 
ao O que está dentro da jarra e formar água. E o CO2 
é o gás que precisamos para isolar a bactéria 
anaeróbia, por isso mantem-se jarra vedada. Tem 
uma fita indicadora de anaerobiose que pode ser 
colocada dentro dessa jarra, muda de cor a medida 
que o ambiente se torna reduzido. 
 
 
A) Cultura bacteriana 
B) Placas de ágar 
C) Câmara do catalisador paládio 
D) Tampa 
E) Parafuso de fixação 
F) Junta de vedação de borracha 
G) Fita indicadora de anaerobiose 
H) Envelope GasPak 
 
 
Precisa-se de estufa 
para ajustar a 
temperatura ideal 
para a bactéria que 
pretende isolar. Ex.: 
Micobactéria que 
causa a tuberculose, 
sua temp. ideal é 37°C.