Aula prática 3_IF IQL HA

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AULA PRÁTICA 3 – TÉCNICAS 
IMUNOLOGICAS: IF, IQL e HA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
 São testes empregando conjugados constituídos de Ag ou Ac ligados
covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos
 Fluorocromos são moléculas que absorvem luz em comprimento de onda baixo
e elevada energia e emitem luz em comprimento de onda maior, de menor
energia, fenômeno conhecido como fluorescência (isotiocianato de
fluoresceína ou rodamina)
 Os primórdios da imunofluorescência (IF) datam de 1942, quando Albert Coons
e col. demonstraram a marcação de anticorpos antipneumococos com
fluoresceína no tecido pulmonar
IMUNOFLUORESCÊNCIA
 DIRETA:
 É a detecção direta de antígenos usando anticorpo antígeno-específico
marcado com substância fluorescente
 Detecta antígenos em tecidos biológicos (material de biópsias, vírus,
bactérias, células etc.)  raramente quantitativa
 Muito utilizada para a pesquisa de vírus respiratórios (influenza, parainfluenza,
vírus sincicial respiratório e adenovírus)
IMUNOFLUORESCÊNCIA
 INDIRETA
 O anticorpo presente na amostra do paciente reage com um antígeno
específico fixado em uma lâmina de microscopia
 Um passo de lavagem é realizado e um anticorpo anti-humano (conjugado)
marcado com substância fluorescente é adicionado
 Após um segundo passo de lavagem, para remover o conjugado não
ligado, a observação de fluorescência ao microscópio é indicativa da
presença do anticorpo em estudo na amostra do paciente
IMUNOFLUORESCÊNCIA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
 Na leitura das reações de IF, devem-se enumerar três formas distintas de
fluorescência:
 Específica  reação entre o substrato e a proteína marcada com o
fluorocromo
 Não específica  coloração dos tecidos por corante livre ou proteínas
fluoresceinadas
 Autofluorescência  fluorescência natural dos tecidos (amarela, azul),
quando expostos à luz ultravioleta
IMUNOFLUORESCÊNCIA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Toxoplasmose
Sífilis Chagas
Leishmaniose
IMUNOFLUORESCÊNCIA
(A) Padrão nuclear homogêneo, (B) nuclear pontilhado grosso, (C) centromérico, (D) 
nucleolar , (E) citoplasmático, (F) misto citoplasmático pontilhado fino e nucleolar, 
(G)fuso mitótico.
IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
 São baseados na emissão de luz produzida em algumas reações químicas de
oxidação, aqui incluídos agentes quimioluminescentes derivados
biologicamente
 A emissão de luz pode ser detectada ou medida utilizando-se luminômetros
com tubos fotomultiplicadores, diodo de silicone em estado sólido ou filme
fotográfico como detector
 As reações mais utilizadas envolvem reações de oxidação do luminol e do
isoluminol, ésteres de acridina e decomposição catalisada pela fosfatase
alcalina de adamantil 1,2-dioxetano aril-fosfato
 Altamente sensíveis e o nível de detecção é da ordem de atomol (10-19) ou
zeptomol (10-21)
IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
 Uma enzima, como a peroxidase, é usada para marcar um antígeno ou
anticorpo, após a imunorreação
 O luminol como um substrato luminescente emite luz por reação de oxidação-
redução sob a ação do complexo com a enzima e o reagente luminescente
 A presença do antígeno ou anticorpo é determinado pela intensidade
luminescente
IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
AGLUTINAÇÃO
 Aglutinação  a ligação cruzada com produção de agregados ocorre quando
um anticorpo reage com um antígeno multivalente presente em uma partícula
(insolúvel)
 A partícula insolúvel pode ser um antígeno insolúvel nativo, antígenos expressos
em células (por exemplo, antígenos eritrocitários) ou partículas cobertas com
antígenos (por exemplo, partículas de látex)
 As reações de aglutinação têm boa sensibilidade e podem ser analisadas por
inspeção visual, no entanto são mais sujeitas a resultados falso-positivos devido à
aglutinação inespecífica
AGLUTINAÇÃO
 DIRETA:
 Nesta reação utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma
íntegra ou fragmentada: hemácias, bactérias, fungos e protozoários - podem
ser aglutinados diretamente por anticorpo. São realizadas diluições em série
do anticorpo frente a uma quantidade constante do antígeno. Após um
período de incubação a aglutinação se completa e o resultado é
geralmente expresso como a máxima diluição em que ocorre a aglutinação
 Exemplos de reações de aglutinação direta: tipagem de grupos sanguíneos
(antígenos específicos), reação de PaulBunnel-Davidson (Mononucleose),
teste de Widal para salmoneloses, teste de aglutinação para toxoplasmose e
tripanossomíase
AGLUTINAÇÃO
 DIRETA:
AGLUTINAÇÃO
 DIRETA:
AGLUTINAÇÃO
 PASSIVA ou INDIRETA:
 Nas reações de aglutinação passiva ou indireta, as hemácias e as partículas
inertes podem ser sensibilizadas por adsorção passiva
 Isto pode ser feito através de contato direto com antígenos solúveis, por
adsorção via agentes químicos solúveis, por adsorção com agentes
químicos, (p. ex. ácido tânico ou cloreto de cromo) e por conjugação
através de ligações químicas covalentes
 Estes processos de adsorção fornecem reagentes estáveis. Devido à grande
diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a
aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada.
AGLUTINAÇÃO
 PASSIVA ou INDIRETA:
HEMAGLUTINAÇÃO