Trabalho Crispr-Cas9 RESUMOS (Genética)

Prévia do material em texto

UNIVERSO 
 
 UNIVERSIDADE SALGADO DE OLIVEIRA 
 GRADUAÇÃO MEDICINA VETERINÁRIA 3º PERÍODO - N2 
 
 
 Lavínia dos Santos Amaral Alfano 
 
 
 
 
 
 
 CRISP - Cas9 
 
 
 
 
 
 
 
 JUIZ DE FORA - MG 
 2021 
 
 
 
 
 Maria Lucia Zaidan: regulamentação do CRISPR-Cas9 
 
 Marta Lúcia Zaidan professora da faculdade de medicina veterinária e zootecnia da USP, 
faz uma palestra no simpósio de “Impactos da Nova Técnica de Edição de Genomas 
CRISPR-Cas9 na Ciência e na Sociedade”. Ela explica qual a regulamentação atual para 
técnicas de edição de genes, como o CRISPR-Cas9, no Brasil. 
 Sua palestra se inicia com ela dando uma breve retração do histórico da biossegurança 
que no seu sentido mais estrito é a “observância de procedimentos de segurança na 
manipulação de organismos geneticamente modificados com a finalidade de proteger o 
ecossistema e preservar a saúde e a vida humana” que é uma definição encontrada no 
dicionário Houaiss e em seu sentido mais amplo seria a segurança dos seres vivos 
envolvendo todas as nossas atividades laboratoriais, nos hospitais entre outros. A 
professora logo em seguida faz uma breve linha cronológica dos aspectos históricos da 
Biotecnologia, citando que seu início foi em 1865 com Gregory Mendel e as ervilhas e logo 
em 1909 o termo Gene teve seu primeiro uso pelo autor alemão Wilhem Johannsen, e em 
1952 o ano em que os autores Alfred Hershey e Martha Chase definiram que o gene é feito 
de DNA até chegar em 1953 onde foi descrito a estrutura em dupla hélice do DNA por 
James Watson e Francis Crick, ela relembra todo marco histórico da biotecnologia e suas 
técnicas de extrema importância para fazer as modificações genéticas como a criação das 
técnicas de Dna recombinante. As técnicas do DNA recombinante que ainda utilizada onde 
se corta um fragmento gênico com enzimas de restrição e se utiliza de diversos métodos 
pra inserir esse fragmento dentro de células e faze-lo expressar, são mostradas na palestra 
da professora, ela consta também que a criação dessa técnica surgiu uma preocupação 
para o químico Paul Berg, com relação a biossegurança desses organismos que estavam 
sendo criados através da técnica de DNA recombinante, então Paul escreveu uma carta 
para a revista Science dizendo que era preciso regular o uso desta técnica até que se 
compreendesse melhor, até ser confirmado se a técnica era realmente segura. Uma 
conferência que ocorreu na Califórnia em 1975 onde cientistas participaram, acabou sendo 
criado um dos os primeiros lugares para pesquisa da técnica do DNA recombinante. 
 Em entorno de sua palestra Marta faz uma explicação sobre o regulatório falando que 
sempre é um desafio desde o início, ela consta também que de forma alguma a CTNBio 
não irá bloquear o desenvolvimento científico e tecnológico, pois sua importância é 
fundamental. A professora segue explicando que há vários outros assuntos que devemos 
pensar e levar em consideração como a biossegurança do indivíduo, ambiente e aos 
animais. Em torno da palestra conseguimos visualizar um pouco mais sobre essa nova 
tecnologia chamada de CRISPR-CAS9, e sua funcionabilidade nas células. 
 
 
 
 
 
 
 Como o CRISPR Funciona? 
 
Sabemos que qualquer espécie viva se dá por meio de mutações genéticas. E com o 
passar dos anos o ser humano vem buscando entender como essas mutações ocorrem e 
como determinadas características são passadas de geração a geração, essas mutações 
podem que ocorrer de forma aleatória, no qual se manifestam de modo a promover uma 
seleção de indivíduos, uma vez que os portadores de genes mais favoráveis são mais 
propensos a se reproduzir e perpetuar suas características, transmitindo-as a seus 
descendentes. 
Ou provocada pelo ser humano afim de torna-las mais resistentes como por exemplos 
certas plantas que são mais resistentes a pragas do que outras, então com a modificação 
genética pegaram plantas de um mesmo grupo com diferentes características e resistências 
a moldaram a até se tornar bem mais resistente do que antes. homem desde muito temo já 
se interessava em modificar o patrimônio genético dos seres vivos, na maior parte das 
vezes com o intuito de obter melhoramentos que os beneficiassem de alguma forma. 
Crispr/Cas9 se trata de uma técnica de correção de genes em qualquer célula viva, essa 
técnica usa a proteína Cas9 e uma molécula-guia constituída por material genético. Crispr é 
a sigla de “clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, que em português 
ficaria como “repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente Inter espaçadas”. 
No ano de 2012 as pesquisadoras Emmannuelle Charpentier e Jennifer Doudna, lançaram 
um guia completo de como usar o CRISPR na biologia molecular. O CRISPR/CAS9 
funciona como parte do sistema de imunidade em bactérias. Que através das áreas de 
repetições de nucleotídeos as bactérias poderiam reconhecer o vírus e elimina ló. 
 Ele funciona dessa forma, quando um vírus injeta um fragmento de ácido nucleico na 
bactéria, a bactéria então pega um fragmento desse material e o liga próximo ao CRISPR e 
acaba ficando guardado no DNA bacteriano como se fosse uma memória e então a bactéria 
se torna capaz de construir uma molécula chamada de CRISPR RNA, ela vai funcionar 
como um sinalizador e como um adesivo ao mesmo tempo, isso porque ela vai procurar no 
novo material genético viral que esteja invadindo as células ao mesmo tempo em que vai 
chamar moléculas que são especializadas em cortar material genético como por exemplo o 
CAS9, dessa maneira parte do material do vírus iram ser cortadas e degradadas perdendo 
assim a integridade do seu material genético o vírus já não e mais capaz de causar dado a 
célula. 
Dessa formas podemos usar essa técnica em qualquer organismo que tenha um material 
genético, como exemplo você poderia editar o material genético tanto do trigo como do ser 
humano, se você já conhece a sequência de nucleotídeos no qual você deseja trabalhar, e 
também toda sequência de ATCG e sua ordem, sendo assim você já pode construir seu 
CRISPR com sua sequência especifica e uma proteína que corte DNA chamada de CAS9, 
sendo você irá encontrar uma maneira de inserir essa construção molecular dentro da 
célula que cotem o material que queira editar 
 mecanismo ele pode ser reproduzido em qualquer organismo, incluindo o humano. 
Sequências de DNA podem ser “cortadas” e eliminadas. Usando fi lamentos de RNA, 
podem-se modificar sequências-alvo de DNA. O que se tem então é um mecanismo que 
permite a modificação de qualquer DNA. Pode-se corrigir um DNA defeituoso, cancelar 
genes, até mesmo introduzir DNA no genoma. Com essa técnica ficou muito mais fácil e 
rápido editar o DNA, e também de produzir organismos geneticamente modificados. 
 
 Oswaldo K. Okamoto: CRISPR- Cas9 e Tratamento de Tumores 
 Oswaldo Keith Okamoto é um biólogo e professor do Instituto de Biociências da USP, ele fez 
uma palestra no simpósio "Impactos da Nova Técnica de Edição de Genomas CRISPR-Cas9 na 
Ciência e na Sociedade", sobre seus trabalhos que se concentram principalmente em células-
tronco de meduloblastoma, um tumor do Sistema Nervoso Central de origem embrionária, na 
qual ele acredita que a técnica pode levar à identificação de novos alvos para tratar essecâncer. 
 No vídeo de sua palestra ele consta que o uso do CRISP em sua pesquisa é algo 
recente, e que usa técnica para entente a função de genes e a relevância dele em 
processos biológicos, e também para fazer correções nos genes, porém seu foco é alvos 
terapêuticos para tratamentos de tumores e desenvolvimento de novas drogas para o 
tratamento do câncer, na qual se deve entender a biologia da doença, a identificação de 
mecanismos importantes para o desenvolvimento e progressão da doença, porém todo o 
processo para o desenvolvimento de novas drogas é bastante complexo, longo e incerto e 
por isso existe uma pesquisa para ajudar a aumentar eficácia dessa nova descoberta de 
drogas para algumas doenças que necessitam de algum tratamento como algumas formas 
do câncer, para essa droga ser levada ao público deve ser passada antes por uma série de 
estudos de desenvolvimento, eficaz e qualidade. 
Oswaldo K consta que usa basicamente em sua pesquisa modelos celulares para tentar 
identificar proteínas que são relevantes para iniciação, progressão ou resistência do tumor 
aos tratamentos tradicionais, e para fazer precisa interferir o gene que codifica uma 
determinada proteína. 
 O uso do Crispr nessa pesquisa é para identificar proteínas que são relevantes para 
doença, e assim que consegue isolar essa variável a eficiência em encontrar esses genes é 
maior. Como dito antes a pesquisa é feita a partir de células tumorais, porem em relação ao 
câncer sabemos que ele ou os tumores são bastante heterogêneos em relação a sua 
posição celular e a quantidade de tipos de alteração genética que essas células podem ter, 
ou seja em um mesmo tumor tem diferentes populações de células tumorais. 
 Nesse processo foram desenvolvidos algumas linhagens de células tumorais clonadas 
homogenias, essas linhagens tem características que se aproximam as células tronco, o 
pesquisador tem focado em tumores que ocorrem no sistema nervoso central, um tumor 
chamado de meduloblastoma que faz parte de um conjunto maior de tumores que são os 
embrionários do STNC que tem sua maior incidência em pacientes pediátricos, então 
conseguiram obter tumores isolados de pacientes pediátricos, linhagens de células com 
características de tronco que conseguem gerar estruturas semelhantes nas neuroesferas 
cultivadas in vitro. E essas células são tumorigênicas com características agressivas e mais 
resistentes a alguns tratamentos quimioterápicos. 
A estratégia dele se usa linhagens galonais e que são relevantes para a doença ou seja 
linhagens que tenham características de células tronco e que são relevantes pelas suas 
propriedades, em relação ao ensaio tem vários que se pode utilizar por exemplo o de 
resistência a drogas, mas no caso de sua pesquisa o foco é identificar genes que estão ou 
que conferem essas propriedades de células tronco a células tumorais, um ensaio muito 
informático desse estudo seria o ensaio de formação de neuroesferas, nos quais as células 
se dividem e com isso vai aumentando a quantidade de células na esfera e assim 
aumentando seu tamanho. 
 
 Irene Yan: Desafios de CRISPR-Cas9 no Embrião 
 
 A doutora Yan começa sua apresentação contando um pouco sobre o Crisp cas 9, ela 
consta o porquê esse método é fácil e também o mais utilizado hoje em dia em relação aos 
outros instrumentos com a mesma finalidade, como o TALEM e ZFN, porém, nele requer 
uma proteína nova a cada gene, o que seria algo difícil e demorado a de se fazer, mas já o 
CRISP Cas9 você não precisa mudar a proteína pois nele você dá um pedaço do RNa guia 
do sitio alvo que você quer modificar a enzima pega o Rna guia e ia procurara no genoma o 
sitio correspondente. 
 Você pode fazer um Cas9 original para fazer Indels, uma nuclease que faz uma pequena 
direção e pela junção não homologa se pode criar uma direção pontual no qual muitas 
vezes vai gerara um produto fora do quadro de leitura e portanto você tem uma interrupção 
na codificação daquele gene, e a partir da ai vemos modificações como o cas9 é uma 
nuclease nicasse, ela corta apenas uma fita de Dna em vez de cortar ambas as fitas e 
podendo causar um erro, isso faz com que você possa acoplar e a utilizar de outra forma, 
por exemplo por inserção ou substituição por recombinação homologa, a utilização do Cas9 
é uma ferramenta extremamente poderosa para detectar de forma rápida onde você quer o 
sitio no genoma para você poder fazer o que quiser. As modificações por exemplo já estão 
sendo feitas. 
Yan consta que se você já tem um laboratório que faça biologia molecular fazer o processo 
do Crispr Cas9 não é difícil contanto que tenha os materiais. 
 Seu interesse é no desenvolvimento de tubo neural cedo, de quando de progenitores e 
estão começando se diferenciar, são dois pontos principais, mas o próprio Tubo neural e 
células Crista neural que migram para formar o sistema nervoso periférico, essas células 
migratórias são identificadas por anticorpo chamado de HNK-1, é um anticorpo que funciona 
no embrião de galinhas entre outras espécies exceto camundongos, e a pergunta seria, já 
temos fatores de transcrição que sabemos que são importantes para esse processo de 
migração de células crista neural, então a hipótese é, se tirar esse fator de transcrição 
chamado Slug iria matar a migração de crista neural, e tirar geneticamente que já foi 
removido de várias formas o RnI, mas se removermos ele completamente do genoma no 
qual usaremos Crispr para fazer essa edição, então um Rna guia no início da sequência 
codificante de Slug pra fazer um Indel, então fizeram um plasmídeo contendo um gene de 
Rna que queremos junto com Cas9 e com o restante do TrcRna que é um elemento 
constante desse sistema, a forma que se faz o plasmídeo ser incorporado nas células 
embrionárias é um procedimento que se chama eletroporação em ovo no qual é injetado o 
Dna que tem carga negativa dão um micro choque que faz com que essas células sejam 
permeabilizadas e apenas o tubo neural que está no polo positivo vai receber o Dna 
injetado no tubo neural, então temos um Mtubo com plasmídeo e outro Mtubo sem 
plasmídeo, que seria como um controle, a eletroporação com sua forma de entregar 
produtos gênicos não é 100%. 
 
 
 
 
 
 
 Perspectivas para o futuro da GenÉTICA Mayana Zatz (CEGH-CEL IBUSP) 
 
 Mayana Zatz é uma doutora, graduada em ciências biológicas, pela universidade de São 
Paulo tem pôs doutorado em genética humana e medica pela faculdade da Califórnia e 
também professora titular do instituto de Biociências, ela fez uma palestra no "I Simpósio de 
Aconselhamento Genético Multidisciplinar: Atuação e Perspectivas". 
 Sua palestra se inicia com ela agradecendo o convite do simpósio no qual ela se 
apresentou dando uma série de questões sobre as perspectivas futuras, Mayana escreveu 
um livro chamado de Genética: Escolhas que nossos avós não faziam, publicado em 2011, 
no qual ela faz a seguinte questão, “Nós podemos fazer escolhas ou seremos guiados por 
algoritmos “de acordo com o Yuval Harari que escreveu o livro Homo Deus, para ele esses 
algoritmos que decide por nós, como por exemplo o waze um aplicativo de Gps, que muitas 
vezes nos levam para um lugar errado como também o local certo, e nós confiamos nesse 
aplicativo ou seja em um algoritmo que decide nosso destino de viagem, outro exemplo foi 
sobre a atriz Angelina Jolie na qual fez uma mastectomia preventiva mesmo não estando 
doente, sua família tem histórico de câncer e por isso optou em fazer a cirurgia, ela tinha 
uma mutação no gene BRCA1 que representa um risco de alto de desenvolver câncer de 
mama e de sofrer câncer de ovário. Yuval usa o caso dela para nos mostrar que as 
decisões não se baseiam em mais sensações em sim em algoritmos, afinal Angelina fez 
uma cirurgia baseada na porcentagem de chances de poder ter um câncer. 
 Mayananos mostra em como os testes genéticos estão cada vez mais avançadas e 
importantes para o diagnóstico, mas as questões como a ética e os testes em pessoas 
clinicamente normais e até onde vai nossa responsabilidade e o direito de interferir. Em seu 
livro ela cita vários casos como este no qual ela cita em sua palestra, como o caso de uma 
família com vários afetados por doença recessiva, ligados ao X, no qual a mulher queria 
saber se era portadora da mutação, porem por ser uma doença recessiva já sabemos que 
pula uma geração então é bem provável que o filho dela tenha a doença, mas mesmo assim 
ela queria saber, a doutora entra com a questão se seria ético fazer o teste mesmo sabendo 
que a doença é recessiva, mas se não for ético como deve ser informado, ela chega na 
conclusão que deveria explicar a mulher como funciona essa doença. 
 Outro ponto que a doutora citou foi que testes preditivos são algo bem complexos, afinal 
temos várias doenças de início tardio sem tratamento, onde o indivíduo saudável tem risco 
de vir a manifestar uma doença e se tiver uma mutação, de transmitir aos descendentes, 
então a cada caso é discutido se vale apena ou não e quando informar, ela entra em uma 
questão de será que todos nós queremos passar por testes para descobrir ou não se é 
propenso a ter ou transmitir uma doença sem cura ou com tratamento muito oneroso, ela 
entra na questão se nós podemos impedir ou não já que nosso Dna tem informações 
contidas e é muita mais acessível do que pensávamos, ela faz a pergunta se é ético usar ou 
não material genético descartado para estudar nosso genoma sem o conhecimento da 
pessoa, afinal em seu Dna cotem sua identidade, quem é você, seus descendentes, se tem 
alguma doença ou é propenso a ter, se tem tendencia a engordar ou não, enfim uma 
infinidade de coisas. 
 
 
 
A doutora menciona se seria ético novamente ou não fazer testes sem consentimento da 
pessoa, e usa alguns exemplos como o da china no qual seus cidadãos ficaram registrados 
no banco de dados do Sistema de credito social e sua vida profissional e pessoal será 
invadida e dependendo poderá ser considerado um cidadão ruim e isso ser exposto ao 
público, e seria dessa mesma forma com o nosso Dna, porem ele seria exposto a pessoas 
especificas, como cientistas. 
 Em torno de sua palestra ela fala em como nosso dna é importante e no que podemos 
fazer com ele e cita também a nova técnica chamada de CRISPR-CAS9 uma nova 
ferramenta para editar genes, ela o cita dizendo queria uma ideia usar ele para editar uma 
doença de um indivíduo e assim fazer sua prole não ter risco de pegar. 
 Mayana em sua palestra nos mostra uma perspectiva do futuro da genética com uma 
infinidade de casos, como resolve-los e evita-los. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Referências 
 
Maria Lucia Zaidan, Regulamentação do CRISPR-Cas9, 18 de maio 2017. Disponível 
em > https://www.youtube.com/watch?v=E3eNycO1lE4&t=6s < Acesso em: 30/03/2021 
Pedro Loos em Ciência Todo Dia, Como o CRISPR Funciona?, 19 de fev. 2021. 
Disponível em > https://www.youtube.com/watch?v=EGgOpyKm6oQ&t=2s < Acesso em: 
30/03/2021 
Oswaldo K. Okamoto, CRISPR- Cas9 e Tratamento de Tumores, 18 de maio 2017. Disponível 
em > https://www.youtube.com/watch?v=zh_3O7__zgU&t=5s < Acesso em: 30/03/2021 
Irene Yan, Desafios de CRISPR-Cas9 no Embrião, 18 de maio 2017. Disponível em > 
https://www.youtube.com/watch?v=Xbjp1irZYZc&t=2s < Acesso em: 30/03/2021 
Mayana Zatz (CEGH-CEL IBUSP), Perspectivas para o futuro da Genética, 7 de jul. 2018. 
Disponível em > https://www.youtube.com/watch?v=fiIwR_Dlq0Q&t=6s < Acesso em: 
31/03/2021 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.youtube.com/watch?v=E3eNycO1lE4&t=6s
https://www.youtube.com/watch?v=EGgOpyKm6oQ&t=2s
https://www.youtube.com/watch?v=zh_3O7__zgU&t=5s
https://www.youtube.com/watch?v=Xbjp1irZYZc&t=2s
https://www.youtube.com/watch?v=fiIwR_Dlq0Q&t=6s