Tecnologia do DNA recombinante

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PARTE I 
• Breve histórico 
 
• Engenharia genética ou Tecnologia do DNA Recombinante 
 
• Clonagem Molecular 
 
• Biblioteca de DNA 
 
• Seqüenciamento de DNA 
Alguns dos principais passos no desenvolvimento da tecnologia do 
DNA recombinante 
1949 
1977 – Genetech, Inc. 
Primeira proteína humana recombinante (somatostatina) 
produzida por uma bactéria transgênica 
• Companhia fundada por Herbert Boyer e 
Robert Swanson em 1976; 
 
• Considerado o advento da Era da 
Biotecnologia. 
•Novas características úteis podem ser alcançadas em indivíduos que não as 
possuíam, e que seriam praticamente impossíveis de serem adicionadas por 
meio de mutações espontâneas, ou induzidas, ou por recombinação genética 
clássica. 
Tecnologia do DNA Recombinante 
• Genes específicos e desejáveis podem ser introduzidos ou retirados de 
microrganismos e organismos superiores. 
 
•Conhecimento da estrutura, propriedades e seqüência do DNA são fundamentais. 
Definições importantes 
•Biotecnologia: Tecnologia que envolve seres vivos na sua aplicação. 
 
•Manipulação genética – Engenharia Genética: É a manipulação do elemento 
básico da hereditariedade (DNA) por meio da introdução de um novo gene na 
célula ou a eliminação de alguns deles. 
 
•Clonagem: É o processo de produção de cópias idênticas de uma “entidade” 
(clonagem de organismos x clonagem molecular). 
Clonagem molecular 
Tecnologia do DNA Recombinante 
•Metodologia central da tecnologia do DNA recombinante; 
•Isolamento e propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA. 
União artificial de moléculas de DNA, ou partes desta 
molécula, que não se encontram unidas na natureza 
 
 
 
 
 
DNA recombinante 
Como amplificar um gene de interesse? 
In vivo ou In vitro 
Síntese in vitro de DNA 
Amplificação de DNA pela técnica de PCR 
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) DNA 
Taq DNA polimerase 
+ 
Cofator 
 + 
tampão 
primers 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
Crescimento exponencial do 
segmento da fita de DNA entre os 
primers, após 30 – 40 ciclos 
Como produzir um DNA alvo de interesse 
Síntese de cDNA a partir de mRNA 
Como formar uma molécula de DNA recombinante? 
Etapas da Clonagem Molecular 
1) clivagem do DNA em localizações específicas; 
2) união covalente do fragmento de DNA clivado a um vetor de clonagem 
(DNA recombinante); 
3) introdução da molécula de DNA recombinante em uma célula 
hospedeira - transformação; 
4) seleção das células hospedeiras que carregam a molécula de DNA 
recombinante 
Etapas da Clonagem 
Molecular 
Requerimentos: 
 
•DNA de interesse 
 
•Vetores 
 
•Microrganismos/ Célula hospedeira 
 
•Enzimas 
Enzimas 
Endonucleases de restrição e DNA ligase são fundamentais 
•Endonucleases de restrição: apresentam papel fundamental, clivando o 
DNA em seqüências específicas, gerando um conjunto de fragmentos 
menores. 
 
•DNA ligase: os fragmentos separados para serem clonados podem ser 
unidos a um vetor de clonagem apropriado usando a DNA ligase. 
Finalmente, o vetor recombinante é introduzido em uma célula 
hospedeira que o “clona / copia / replica”, a medida que a célula 
realiza muitas gerações de divisões celulares. 
•Enzimas produzidas por bactérias; 
•Mecanismo de defesa contra bacteriófagos; 
•Clivam DNA exógeno; 
•DNA bacteriano protegido: metilação do sítio de restrição. 
Bactéria restringe o crescimento do fago e protege o 
seu DNA metilando-o (modificando) 
Endonucleases de restrição 
Atividade biológica in vivo 
Fenômeno chamado restrição/modificação 
Sistema de proteção do patrimônio 
genético 
• mecanismo que monitora a entrada de 
material genético exógeno nas células 
vivas (preservação da integridade do DNA) 
• dois tipos de componentes 
– enzimas de restrição (tipos I, II e III) 
– enzimas de metilação 
• alvo  seqüências especiais de nucleotídeos 
Restrição em curso 
Uso biotecnológico 
• trata-se de uma maneira de construir 
moléculas de DNA recombinantes usando 
uma alternativa não convencional 
 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
•monômeros ou dímeros; 
•não consomem ATP; 
•clivam o DNA dentro do sítio de reconhecimento. 
Endonucleases utilizadas 
 em biologia molecular 
Especificidade 
Extremidades cegas ou abruptas 
(blunt ends) 
Extremidades coesivas (stick ends) 
Endonucleases de restrição 
Tipo II 
•Seqüência palindrômica (4 a 8 nt); 
•Específica; 
•Enzimas de corte freqüente (fragmentos menores); 
•Enzimas de corte raro (fragmentos maiores). 
5’ GAATTC 3’ 
3’ CTTAAG 5’ 
EcoRI 
5’ GGCC 3’ 
3’ CCGG 5’ 
HaeIII 
5’ GCGGCCGC 3’ 
3’ CGCCGGCG 5’ 
NotI 
Endonucleases de restrição 
Sítios de restrição 
Especificidade e resultados de clivagem 
DNA ligase 
Enzima que catalisa o fechamento covalente dos cortes na fita de DNA dupla-
hélice 
Molécula de DNA Recombinante 
Outras enzimas importantes para Engenharia genética 
Vetores de clonagem 
Fragmentos de DNA que se replicam em células vivas e foram engenheirados 
para poderem carregar um fragmento exógeno de DNA 
• São moléculas de transporte; 
 
• Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, YACs, etc; 
• ORI / Origem de Replicação, para sua replicação autônoma no hospedeiro; 
 
• Sítio múltiplo de clonagem ou polylinker; 
 
• Gene marcador: gene de resistência à antibiótico(s) que permite a seleção do 
hospedeiro recombinante. 
Características: 
Plasmídeo 
BAC – Cromossomo 
Artificial de Bactéria 
YAC – Cromossomo 
Artificial de Levedura 
Capacidade de Clonagem dos Vetores 
Vetor Inserto (pb) 
Plasmídeo 2.000 - 10.000 
Bacteriófagol 10.000 - 24.000 
Cosmídeo 40.000 
BAC 70.000 - 300.000 
YAC > 300.000 
Método de geração de um DNA plasmideal recombinante 
Hospedeiros 
Seres ou células receptoras do DNA a ser clonado 
Requisitos: 
•Aceitar o DNA exógeno e produzí-lo (replíca-lo) em maior escala; 
 
•Permitir a seleção, facilmente, das células que contêm o DNA exógeno (células 
recombinantes). 
Escherichia coli 
Hospedeiro mais comumente usado 
Hospedeiro 
Transformação: Choque térmico, Eletroporação e “gene gun” 
Hospedeiro 
Seleção dos recombinantes 
Clonagem e sequenciamento em 
vetores M13 
Sistema de seleção azul e branco 
PARTE II 
• Vetores de expressão 
 
• Produção de proteínas heterólogas 
 
• Organismos geneticamente modificados 
Vetores de expressão 
Utilizados quando se deseja obter o produto gênico utilizados quando se deseja 
obter o produto gênico 
Vetores de expressão procarióticos: 
•Promotores fortes; 
•Sítios de ligação a ribossomos; 
•Sítios de clonagem. 
 
Vetores de expressão eucarióticos: 
•Origem de replicação eucariótica; 
•Região de controle de transcrição e tradução, poliadenilação de mRNA, etc; 
•Sinais especiais para processamento e secreção. 
Componentes principais de um vetor de expressão 
OGM é um organismo cujo material genético (DNA/RNA) tenha sido 
modificado por qualquer técnica de produção/manipulação de 
DNA/RNA recombinante 
Melhoramento genético clássico X Transformação genética 
unesp 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
CÂMPUS DE JABOTICABAL 
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 
Prof. Jackson A. Marcondes de Souza 
OGMs – Organismos geneticamente modificados 
Etapas para obtenção de uma planta transgênica e sua comercialização 
Métodos de transformação 
genética vegetal 
•Transformação Direta: 
 
 Eletroporação de protoplastos 
 Biobalística 
 
 
•Transformação Indireta: 
 
 Agrobacterium tumesfaciens 
 Agrobacterium rhizogenes 
Cultura de tecidos vegetais 
•Fundamental para regeneração da planta transformada 
Aplicações agrícolas 
1) Melhoramento de características 
ambientais 
 
2) Propagação 
 
 
3) Resistência à pragas 
 
 
4) Melhoramento pós-colheita 
 
 
5) Melhoramento de traços 
nutricionais 
 
6) Plantas como biorreatores 
Genes de resistência a seca, salinidade 
 
 
Esterilidade masculina para sementeshíbridas 
 
Tolerância a herbicidas, resistências a 
vírus, bactérias, fungos e insetos 
 
Atraso no amadurecimento de frutos, 
vegetais “adoçados” 
 
Sementes ricas em lisina 
 
 
Produção de plásticos, óleos, drogas, 
vacinas 
http://www.ctnbio.gov.br/ 
Aprovações comerciais no Brasil 
29 de outubro de 2003 
OGMs – Organismos geneticamente modificados 
Derivados de OGMs ? 
Frankfood 
unesp 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
CÂMPUS DE JABOTICABAL 
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 
Prof. Jackson A. Marcondes de Souza 
Melhoramento Genético Animal Clássico ou 
Tradicional 
Cruzamentos específicos e seleção de reprodutores: 
 
• Processos demorados e onerosos, mas bem sucedidos; 
• Novas características em prejuízo das anteriores. 
 
 
Objetivos: 
 
• Rendimento de leite 
• Característica de lã 
• Taxas de crescimento 
• Frequencia das posturas de ovos 
Transformação genética de animais ou 
Transgênese 
Possibilidade de gerar novas características com preservação das 
precedentes: 
 
• Gene clonado inserido no núcleo de ovo fertilizado 
• Ovos fertilizados inoculados em fêmeas receptivas 
• Seleção dos membros da descendência que possuam a nova característica 
• Estabelecimento de novas linhas genéticas 
 
Objetivos: 
 
• Melhoramento animal específico 
• Modelos animais para doenças humanas 
• Pharming (produtos farmacêuticos no campo (Pharmaceuticals / Farm) 
• No leite 
• Nos ovos 
Ganho de função – adição de genes (Knock-in) 
• Expressão gênica aumentada 
• Expressão de um gene novo 
Perda de função – inativação / eliminação de genes (Knock-out) 
• Silenciamento gênico – alteração do gene endógeno 
OGMs 
Alteração de genes (fenótipos) na linha germinativa 
Metodologias para transgênese 
Inserção de novo gene no patrimônio genético das células da 
linhagem germinativa 
1) Vetores retrovirais em embriões; 
 
2) Microinjeção de DNA em pronúcleos, após fertilização 
 
3) Recombinação in vitro de células estaminais e reintrodução 
no blastocisto; 
 
4) Transferência de núcleos de células somáticas em ovos 
anucleados. 
Microinjeção pronuclear de DNA exógeno em zigotos 
Microinjeção em um embrião 
unicelular de camundongo 
Injeção de células embrionárias previamente modificadas 
em blastoceles 
Vetores retrovirais 
• Transfere naturalmente seu DNA 
para o hospedeiro; 
 
• Deleção da sequência viral; 
 
• Inserção do gene de interesse. 
 
• Porém tamanho de sequência é 
limitado!!! 
Seleção de células-tronco embrionárias corretamente modificadas 
Seleção positiva: 
•Neomicina 
 
Seleção negativa: 
•Ganciclovir 
Inserção aleatória do transgene no genoma 
hospedeiro 
 
 
• expressão transgênica imprevisível 
 
• efeito knock-out não intencionado 
• elementos de controle transcricional; 
• regiões de heterocromatinas não-transcritas; 
• outras regiões silenciadas 
 
• duplicação, deleção ou rearranjo da seqüência de DNA 
adjacente ao transgene incorporado. 
Questões técnicas 
• Local de inserção do transgene: 
• Tumorigênese 
• Indução de provírus (vetores retrovirais) 
• Rompimento de outros genes 
 
• Número de cópias inseridas 
 
• Genética para a expressão 
 
• Expressão nos tecidos adequados 
Sistemas heterólogos de expressão de proteínas 
Expressão procariótica: Bactérias 
 
Expressão eucariótica: Leveduras; Células de Mamíferos, Insetos ou de Plantas 
Animais transgênicos como 
fábricas de drogas 
(Scientific American, 
 Jan/1997) 
Alguns produtos 
biotecnológicos pelo DNA 
recombinante na medicina