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1 BRENDA DE OLIVEIRA DA SILVA EFEITO DA ANGIOTENSINA-(1-7) NA FUNÇÃO MODULADORA DO miRNA-1914-5p E ELEMENTOS REGULADORES DO METABOLISMO DE LIPÍDIO NO PROCESSO FIBROSANTE HEPÁTICO EM CÉLULAS LX-2. OURO PRETO MINAS GERAIS - BRASIL 2017 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA EFEITO DA ANGIOTENSINA-(1-7) NA FUNÇÃO MODULADORA DO miRNA-1914-5p E ELEMENTOS REGULADORES DO METABOLISMO DE LIPÍDIO NO PROCESSO FIBROSANTE HEPÁTICO EM CÉLULAS LX-2. OURO PRETO MINAS GERAIS - BRASIL 2017 Tese apresentada à Universidade Federal de Ouro Preto como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de Concentração: Biotecnologia aplicada à saúde humana e animal. Orientadora: Profa. Dra. Karen Cristiane Martinez de Moraes 3 4 5 DEDICATÓRIA Dedico a minha irmã Ingrid e meus sobrinhos Pablo e Kaique pelo amor e companheirismo. Minha família pela força. Aos meus amigos pelo apoio. 6 AGRADECIMENTO Agradeço primeiramente a DEUS pelo Dom da vida, saúde, proteção, por me sustentar a cada dia e por permitir a concretização desse sonho. A professora Karen Moraes pelo ensinamento e por toda dedicação para que este trabalho fosse realizado. A minha irmã Ingrid, meu cunhado Maurício, meus sobrinhos Pablo e Kaique, pelo carinho, amor, dedicação e apoio, pois mesmo estando longe sempre cuidaram de mim e participaram ativamente dessa caminhada. Ao meu pai Valter, por sempre me apoiar e torcer pelo meu crescimento. A toda minha família e em especial a Dindinha, Tio Juá, Cina, minhas primas Ana Carolina e Camila, por sempre abrirem as postas de suas casas e me proporcionarem estadias maravilhosas em Mariana e Conselheiro Lafaiete. Aos meus grandes amigos, pelo respeito, torcida e por me apoiarem na busca dos meus sonhos. Em especial a Débora Valadares e Kessia que não mediram esforços para me visitar em Rio Claro e a Lorena Lima pelo companheirismo. Aos parceiros e amigos de laboratório, pela ajuda, confiança e grande contribuição para meu trabalho, afinal ninguém é bom sozinho. Obrigada Andrea, Marina, Juliana, Caio, Letícia Scarinci, Murilo, Amilcar, Franco e Profa. Márcia Brochetto Braga. Um agradecimento especial para Kelvin Lima, pela amizade, companheirismo e belas risadas. Também de forma especial a Letícia Rocha, uma pessoa guerreira e companheira, obrigada pela amizade. E também em especial a Letícia Ramos, sempre disponível para ajudar, menina de poucas palavras mas grandes atitudes, obrigada pela amizade e companheirismo. Aos meus novos amigos de Rio Claro e em especial ao grupo de Jovens Águias, que contribuiu para meu amadurecimento e sustento. A todos do departamento de Biologia da UNESP/Rio Claro por me acolherem bem e proporcionarem um ambiente agradável para realização dos experimentos. Agradeço a professora Dra. Maria Aparecida Marin-Morales por disponibilizar o laboratório/equipamentos para realização de alguns ensaios. 7 A professora Dra. Luciane Carla Alberici e seu aluno Carlos R.P Dechant da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/USP/Ribeirão Preto; professora Dra. Kumiko Koibuchi Sakane do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba/São José dos Campos/SP e professor Dr. Carlos Ferreira dos Santos da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo, pela colaboração e contribuição na realização de alguns ensaios. Ao processo FAPESP 2013/21186-5. A Capes pelo auxílio financeiro e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Ouro Preto pela oportunidade. 8 RESUMO A fibrose hepática é o mecanismo de cicatrização e reparo do fígado quando este sofre algum tipo de lesão. Entre os elementos que atuam metabolicamente no desenvolvimento da fibrogênese hepática temos a célula estrelada hepática e esta pode ser encontrada em dois fenótipos: quiescente e ativado. Atualmente existem poucas opções eficazes na reversão do quadro fibrótico e além disso, os detalhes dos mecanismos moleculares da fisiopatologia da fibrose não são bem conhecidos. Assim, elucidar particularidades moleculares, bioquímicas e fisiológicas deste processo torna-se crucial no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Particularmente, a linhagem celular humana, LX-2, vem sendo utilizada como um modelo de estudo da fibrose hepática e, interessantemente, o peptídeo Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] se desponta como um importante regulador da pressão arterial, da homeostasia dos fluidos e alguns estudos apontam o seu efeito modulador no processo fibrosante hepático. Dentro do contexto, miRNAs vêm se tornando um novo alvo de investigação e representam uma nova possibilidade de terapia. Diante do exposto, o presente trabalho investigou elementos moduladores do metabolismo de lipídio e da transdiferenciação da célula hepática estrelada LX-2cultivadas sob diferentes condições em diferentes condições: quiescente, ativada, tratadas com Ang-(1-7) e transfectadas com inibidor e mímico do miR-1914-5p. As análises de microscopia e de expressão gênica apontam uma forte conexão dos efeitos moduladores da Ang-(1-7) para regulação do processo fibrosante, via atuação sistêmica no metabolismo lipídico, pela funcionalidade do miR- 1914-5p. Em resumo, os resultados reforçam a contribuição da Angiotensina-(1-7) na reversão do processo fibrosante hepático LX-2 com destaque-se para o miR-1914-5p como uma molécula expoente nesse controle. Palavras-chave: Angiotensina-(1-7), Célula Estrelada Hepática, Fibrose hepática, linhagem celular LX-2, miR-1914-5p. 9 ABSTRACT Hepatic fibrosis is the mechanism of healing and repair of the liver when it suffers some kind of injury. Among the elements that metabolically act in the development of hepatic fibrogenesis, we have the hepatic stellate cell, and this cell can be found in two phenotypes: quiescent and activated. Actually there are few effective options in reversing fibrotic conditions and the molecular details of the pathophysiology of fibrosis mechanisms are not well known. Thus, elucidating molecular, biochemical and physiological particularities of this process becomes crucial in the development of new therapeutic strategies. Particularly, the human cell line, LX-2, has been used as a model for the study of liver fibrosis, and, interestingly, the peptide Angiotensin- (1-7) [Ang- (1-7)] points as an important regulator of blood pressure, the body homeostasis fluid and some studies indicate its modulatory effect in the hepatic fibrosing process. Considering such aspects, miRNAs have become a new target for research representting a new possibility of therapy. Thus the present work investigated lipid metabolism modulators and relevant elements in the transdifferentiation process in the hepatic stellate cells, LX-2, cultivated under different conditions: quiescent, activated, activated treated with Ang-(1-7) and transfected with miR-1914-5p. Microscopy and gene expression analysis points a strong connection between the systemic effect of the Ang- (1-7) and the regulation of the fibrosing process, through a systemic effect of the heptapeptide in the lipid metabolism, correlated with the functional activity of the miR- 1914-5p. In summary, the results reinforce the contributionof Angiotensin-(1-7) in the reversion of the hepatic fibrosing process and the miR-1914-5p as an exponent molecule in this control. Key words: Angiotensin-(1-7), Hepatic Stellate Cell, Hepatic Fibrosis, LX-2 cell, miR-1914-5p. 10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................15 1.1 Características gerais do fígado.............................................................................15 1.2 Célula estrelada hepática e fibrose hepática.........................................................16 1.4 O papel dos Sistema Renina/Angiotensina na fibrose hepática.........................21 1.4 miRNAs e a regulação do processo fibrosante hepática......................................27 1.5 Metabolismo lipídico como elemento indutor da transdiferenciação das células estreladas hepáticas.......................................................................................................35 1.6 Biotecnologia e a terapêutica do RNA........................................................................41 2. JUSTIFICATIVA....................................................................................................43 3. OBJETIVO GERAL...............................................................................................44 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...............................................................................44 4. METODOLOGIA....................................................................................................45 4.1 Cultura celular, curva de crescimento e tratamentos..........................................45 4.2 Análise microscopia.................................................................................................45 4.2.1 Microscopia de Fluorescência.............................................................................45 4.2.2Microscopia de campo claro – análise de gotículas lipídicas Red...................................................................................................................................46 4.3 Reação de PCR quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR) .................................47 4.3.1 Extração de RNA total e obtenção do cDNA..................................................47 4.3.2 Reação de PCR quantitativa em Tempo Real....................................................48 4.4 Análise de expressão de miRNAs por Real Time-PCR ........................................49 4.4.1 Extração de miRNA..............................................................................................49 4.4.2 Análise da expressão diferencial e validação de miRNA..................................51 4.5 Ensaios de transfecção celular................................................................................54 4.6 Ensaio de oxidação de palmitato marcado com 14C na célula estrelada hepática...........................................................................................................................55 4.7 Ensaios Imunoenzimáticos: a mensuração de TGF-β1 na célula estrelada hepática...........................................................................................................................56 4.8 Validação da interação miRNA-mRNA – os ensaios de luciferase.....................56 4.8.1 Clonagem e seleção dos clones .........................................................................56 4.8.2 Ensaio Luciferase...............................................................................................59 4.9 Mensuração de proteína em análises de Western blot..........................................60 4.10 Análises de bioinformática...................................................................................62 4.11Análise estatística...................................................................................................63 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................64 5.1 Análises da Morfofisiologia Celular......................................................................64 5.1.1Curva de crescimento da linhagem celular LX-2...............................................64 5.1.2 Análise de Microscopia........................................................................................65 5.1.2.1 Análise morfológica do núcleo e citoesqueleto e elementos correlatos.........65 5.1.2.2 Identificação das gotículas de lipídio em LX-2...............................................66 11 5.1.2.3 Análise de microscopia de α-SMA...................................................................70 5.2 miRNAS como Elementos Moduladores na Célula Estrelada Hepática............72 5.2.1 Expressão diferencial de miRNAs nas culturas LX-2.......................................72 5.2.2 Análises de bioinformática...................................................................................77 5.3 Análise funcional do miR-1914-5p na Morfofisiologia da célula LX-2 - as análises de Microscopia.................................................................................................82 5.3.1 Análise morfológica de filamentos de actina e núcleo...................................................82 5.3.2 Análise morfológica e quantitativa de α-SMA...................................................84 5.4 Efeito modulador do miR-1914-5p em elementos correlatos a vias de sinalização reguladora do processo fibrosante.....................................................86 5.5 Efeito miR-1914-5p na transdiferenciação e metabolismo de lipídio na LX-2..88 5.5.1 Análises de red oil e expressão gênica..............................................................88 5.6 Efeito miR-1914-5p sobre metabolismo de lipídio nas células LX-2..................93 5.7 Efeito miR-1914-5p no processo da metabolização lipídica nas células LX- 2......................................................................................................................................95 5.8Efeito miR-1914-5p sobre proteínas marcadoras do processo fibrosante hepático..........................................................................................................................99 5.9 Ensaios de luciferase: a validação da interação miR-mRNA............................101 5.10 Efeito do silenciamento de MLYCD na célula LX-2........................................102 6. DISCUSSÃO .........................................................................................................107 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................135 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................136 12 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Esquema da histologia normal do fígado........................................................16 Figura 2 Diferenças fenotípicas da célula estrelada hepática........................................18 Figura 3 Liberação de fatores pré-inflamatórios por células vizinhas...........................18 Figura 4 Arquitetura normal do fígado e associada a fibrose...............................................20 Figura 5 Via metabólica de produção da Ang II e Ang-(1-7).................................................23 Figura 6 Esquema do mecanismo de ação da Ang II e Ang (1-7) em seus respectivos receptores.........................................................................................................................27 Figura 7 Biogênese dos miRNAs.....................................................................................28 Figura 8 Mecanismo de regulação da expressão gênica pelo miRNA endógenos.................33 Figura 9 Síntese de ácido graxo de novo.......................................................................36 Figura 10 Esterificaçãodo retinol pelas enzimas LRAT e ARAT........................................38 Figura 11 Esquema das quatro reações de β-oxidação............................................................40 Figura 12 Mapa do vetor pGL3-Control............................................................................58 Figura 13 Tempo de duplicaçao da linhagem celular LX-2 nas diferentes condições de cultivo 2%, 10% de soro e tratada com Ang-(1-7)...........................................................................64 Figura14 Análise de microscopia de Fluorescência em LX-2 cultivada em diferentes condições, análise de núcleo (DAPI) e citoesqueleto (Faloidina –TRICT)..............................66 Figura 15 Análise de expressão gênica utilizando qPCR (FEZ1, Chk2, MICAL1, MICAL2, MICAL3)..........................................................................................................................67 Figura 16 Esquema do possível mecanismo de ação da Ang-(1-7) na célula estrelada hepática ativada na despolarização do citoesqueleto e na morfologia do núcleo..............................................................................................................................68 Figura 17 Análise de microscopia de campo claro da LX-2 cultivada em diferentes condições, análise de gotículas de lipídios (red oil)...............................................................................70 Figura 18 Análise de microscopia de Fluorescência em LX-2 cultivada em diferentes condições, análise de α-SMA..............................................................................................71 Figura 19 Análise dos níveis proteicos de α-SMA por western blot....................................................................................................................................72 13 Figura 20 Validação dos níveis de expressão de miRNA em LX-2 nas três condições estudadas..........................................................................................................................75 Figura 21 Mapa dos treze miRNAs e respectivas vias de sinalização que estão relacionados......................................................................................................................79 Figura 22 miR-1914-5p e seus putativos alvos.........................................................................81 Figura 23 Análise de microscopia de Fluorescência em LX-2 cultivada em meio contendo 10% SBF e transfectada com mímico ou inibidor miR-1914-5p - análise de citoesqueleto e núcleo................................................................................................................................83 Figura 24 Análise de microscopia de Fluorescência em LX-2 cultivada em meio contendo 10% SBF análise α-SMA.............................................................................................................84 Figura 25 Análise dos níveis proteicos de α-SMA por western blot nas condições estudadas.......................................................................................................................................84 Figura 26 Análise de expressão gênica utilizando qPCR (A, C, D, E) e níveis proteicos de TGF-β1 por ELISA......................................................................................................................87 Figura 27 Análise microscopia campo claro em célula LX-2 crescida em 10% de SBF...............................................................................................................................................88 Figura 28 Análise de expressão gênica utilizando qPCR (PPAR-α, PPAR-γ, SREBP1C)........90 Figura 29 Análise de expressão gênica utilizando qPCR FASN, ACSL4, DGAT1, DGAT2, LRAT............................................................................................................................92 Figura 30 Análise de expressão gênica utilizando qPCR MAGL, ATGL, GPAT1, PAP, HSL, HMGCR, HMGCS1........................................................................................................95 Figura 31 Análise de expressão gênica utilizando qPCR (ACADM, EHHADM, HADHB, ACAT1, ACACA1, MLYCD, CPT1, CPT2, ACSS1, CS, ACACB) e níveis de proteína de ACACA1 e MLYCD ...................................................................................98 Figura 32 Ensaios de β-oxidação..............................................................................................99 Figura 33 Análise de expressão gênica utilizando qPCR Col1A1 e α-SMA...........................100 Figura 34 Regulação da expressão de MLYCD pela interação física de miRNA-RNAm.....101 Figura 35 Silenciamento de MLYCD..............................................................................103 Figura 36 Silenciamento de MLYCD e seu efeitos sobre marcadores de fibrose hepática....104 Figura 37 Silenciamento de MLYCD no processo de β-oxidação .....................................105 Figura 38 Efeito do silenciamento de MLYCD sobre as gotículas de lipídio.......................106 14 Figura 39 Esquema da transdiferenciação da célula estrelada e o fator de transcrição PPAR-γ como elemento importante neste processo.........................................................................108 Figura 40 Entrada do acil-CoA na mitocôndria para processo de β-oxidação............117 Figura 41 Esquema do silenciamento de MLYCD e o efeito no metabolismo de lipídio e elementos de ativação da célula estrelada .........................................................................122 Figura 42 Esquema do efeito de miR-19145-p e Ang-(1-7) sobre a via de sinalização de TGF-β.......................................................................................................................127 Figura 43 esquema representa uma possível reorganização dos filamentos de α-SMA pela Ang-(1-7).........................................................................................................................129 Figura 44 Mical utiliza sua atividade redox para alterar a dinâmica da F-actina e auxiliar na reorganização do citoesqueleto da actina...................................................................................132 Figura 45 Esquema do efeito da Ang-(1-7) sobre o metabolismo de lipídio na LX-2............133 Figura 46 Esquema do efeito do miR-1914-5p sobre o metabolismo de lipídio na LX-2.......134 15 1. INTRODUÇÃO 1.1 Características gerais do fígado O fígado é a maior glândula e o segundo maior órgão do corpo humano, sua localização é na parte mais alta da cavidade abdominal, embaixo do diafragma no hipocôndrio direito é constituído por quatro lobos: direito (maior), esquerdo, quadrado e caudado (Bogdanosa et al. 2013). O fígado funciona como uma glândula endócrina e exócrina e desempenha várias funções importantes no organismo como: síntese e secreção de bile, gliconeogênese, síntese de proteínas, metabolização de substâncias tóxicas, armazenamento de vitamina A entre outras (Duarte et al. 2015). Histologicamente o fígado é dividido em células parenquimatosas e não parenquimatosas. Os hepatócitos (células do parênquima) são as principais células do fígado que correspondem a 80% do volume total do órgão. Estes estão organizados em unidades denominadas lóbulos hepáticos e são responsáveis pela atividade metabólica e pela secreção de componentes da bile. As células não parenquimatosas compreendem as células de Kupffer, células endoteliais sinusoidais e células estreladas hepáticas (CEHs) (FIG. 1) (Senoo et al. 2010; Hernandez e Friedman, 2011). As células endoteliais sinusoidais são frenestradas e não apresentam uma membrana basal, o que torna mais rápido a absorção dos nutrientes da dieta e a secreção de metabólitos sintetizados nos hepatócitos. Entre os capilares sinusóides e oshepatócitos existe um espaço denominado Espaço de Disse, caracterizado por uma camada de tecido conjuntivo frouxo, onde se localiza as CEHs, a principal célula envolvina no processo de fibrose hepática. As células de Kupffer são macrófagos teciduais, localizados na luz dos capilares sinusóides e desempenham função fagocítica e na resposta imune inata (Raff e Levitzky, 2012). 16 Figura 1. Esquema da histologia normal do fígado. A) organização do lóbulo hepático, com destaque para hepatócitos (seta); B) esquema de alta resolução das células estreladas (seta) situada no espaço de Disse. Adaptado de (Friedman 2008). 1.2 Célula estrelada hepática e fibrose hepática As doenças hepáticas crônicas são consideradas graves problemas de saúde pública, atingem uma grande parte da população mundial e causam a morte de mais de 1,5 milhões de pessoas por ano, segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) (OMS 2012). Em geral, o consumo de álcool e a hepatite C crônica têm sido as principais etiologias responsáveis pelo desenvolvimento de complicações hepáticas. Nos últimos anos, houve crescentes casos de internações em decorrência das doenças do fígado, ocasionando elevados gastos públicos e alto índice de mortalidade (Mokdad et al. 2014; Deleuran et al. 2015). Agentes químicos e biológicos podem promover condições patológicas no fígado como: esteatose hepática alcoólica e não alcoólica, carcinoma hepatocelular, hepatite, cirrose, entre outras. A resposta patológica da lesão hepática é a fibrose, que se caracteriza como aumento da síntese dos componentes da matriz extracelular, na tentativa de cicatrização do tecido (Li et al. 2014). É caracterizada por hiperplasia anormal do tecido conjuntivo fibroso (Li et al. 2013), sendo resultado do aumento da síntese e diminuição da degradação da matriz extracelular (Elpek, 2014). A fibrose é um processo patológico comum a todas as doenças do fígado e na permanência da lesão hepática, evolui para um grau mais elevado de comprometimento que pode acarretar na perda da arquitetura do órgão, conhecido como cirrose e que se caracteriza como um estágio terminal de funcionamento do fígado (Czaja, 2014). Embora o fígado apresente a capacidade de regeneração e reversão da fibrose, as opções específicas de tratamento A B 17 são escassas, sendo a principal forma de tratamento a retirada do estímulo agressor (Kong et al. 2013; Tsuchida e Friedman, 2017). Embora várias células e substâncias estejam relacionadas com o processo de fibrose hepática, a principal célula responsável por este processo é a CEH. As células estreladas foram descritas primeiramente em 1876 pelo neuroanatomista Kupffer, que inicialmente as chamou de ‘Sternzellen’ (Wake et al. 1986; Senoo et al. 2010). Após receber várias nomenclaturas (células granulares, pericitos, células que armazenam gordura, células intersticiais, células de transmissão, células mesenquimais, lipocítica, células espaço Disse) em 1996 ficou determinado que o termo mais apropriado seria células estreladas hepáticas (Senoo et al. 2010). As células estreladas correspondem a 15% do total de células do fígado e 30% das células não parenquimatosas (Bitencourt, 2012). As células estreladas se caracterizam por acumular gotículos de lipídios ricas em vitamina A (retinol) no citoplasma (Tacke e Weiskirchen, 2012; Sharvit et al. 2013). Interessantemente, aproximadamente 80% do retinol presente na circulação é captado, armazenado e metabolizado na CEH (Senoo et al. 2010). No fígado normal as células estreladas encontram-se no estado quiescente, apresentando gotículas de gordura no citoplasma e morfologia de estrela. As gotículas são compostas por lipídios neutros, principalmente por triglicerídios e ésteres de colesterol, envolvidos por uma monocamada de fosfolipídio. Associados aos lipídios encontra-se éster de retinil, a principal forma de armazenamento de vitamina A (Testerink et al. 2012). O retinil palmitato é o éster de retinil mais abundando nas gotículas de lipídio, seguido de retinil oléico e retinil linoléico. Coletivamente os ésteres de retinil são encontrados em aproximadamente 95% nas gotículas de lipídio (Povero et al. 2015). No momento em que a lesão hepática ocorre, citocinas e quimiocinas são liberadas por células do tecido hepático, resultando na ativação das células estreladas. Caracteristicamente a ativação das CHE podem ser observadas pela alteração do seu fenótipo da forma estrelar para o estado ativado (miofibroblasto), e pela perda das gotículas de gordura, além do aumento na síntese de componentes da matriz extracelular (FIG. 2) (Mannaerts et al. 2013; Seki e Schwabe, 2015). 18 Figura 2. Diferentes fenótipos da célula estrelada hepática, quiescente (esquerda) com gotículas de gordura no citoplasma (seta) e miofibroblasto (direita) com grande síntese de componentes da matriz extracelular. Fonte: adaptado (Senno, 2004). A ativação das células estreladas pode ser dividida em duas fases: iniciação e perpetuação (Puche et al. 2013). A iniciação, também conhecida como fase pré- inflamatória, resulta de estímulos parácrinos de célula vizinhas, como células do endotélio sinusoidal, hepatócitos e célula de Kupffer, de fatores pró-inflamatórios e fatores pró-fibrinogênicos. Essa fase caracteriza-se por mudanças na expressão gênica, que garante a alteração do fenótipo e resposta a diversas citocinas (Elpek, 2014). O Fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) e o Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) são fatores pró-fibrogênicos, sendo o TGF-β1 considerado o principal fator indutor da fibrose, apresentando elevada expressão após lesão do fígado (FIG. 3) (Meurer et al. 2013). Figura 3. A liberação de fatores pré-inflamatórios por células vizinhas inicia ativação da célula estrelada, induzindo a fibrose. A célula estrelada ativada libera elementos que contribuem para Fenótipo Quiescente Fenótipo Miofibroblasto 19 manutenção do processo de fibrose, além de promover mudanças em seu comportamento (contratilidade e proliferação, por exemplo) Fonte: adaptado (Mormone et al. 2011) Após ativação, a célula estrelada assume o fenótipo de miofibroblasto e também passa a liberar citocinas e quimiocinas que contribuem para a permanência no estado ativado (Puche et al. 2013). A perpetuação da ativação das células estreladas envolve pelo menos sete mudanças no comportamento da célula: proliferação, quimiotaxia, fibrogênese, contratilidade, degradação da matriz, perda de retinóide e liberação de citocinas/quimiocinas. O resultado dessas modificações é o aumento da acumulação da matriz extracelular, pricipalmente de colágeno 1 (Lee et al. 2015). O PDGF é o principal fator responsável pela proliferação da célula estrelada, promovendo o aumento do número de células produtoras de colágeno e a liberação de citocinas pelas células estreladas que aumenta a resposta inflamatória e fibrogênica, além de acelerar a substituição da matriz normal para uma típica de cicatrização (Chen et al. 2014). A proteína quimiotática de monócito 1 (MCP-1), destaca-se no processo de migração, apresentando elevada expressão pela célula estrelada após sua ativação (Shah et al. 2013). No processo de fibrogênese, o colágeno tipo 1 é o principal componente no processo de cicatrização hepática, cuja expressão é regulada transcricionalmente e pós- transcricionalmente em células estreladas por um número crescente de estímulos (Liu et al. 2013). A contratilidade das células estreladas é um determinante importante na resistência do fígado durante a fibrose. Nas células ativadas, a expressão da proteína alfa actina de músculo liso (α-SMA) é aumentada, o que confere um maior potencial contrátil, além de sua expressão ser comumente utilizada como marcador de CEH ativada (Rockey et al. 2013). No fígadonormal, ocorre um equilíbrio entre síntese e degradação da matriz extracelular, promovido pelas enzimas que degradam as proteínas da matriz denominadas metaloproteinases (MMP) e das proteínas TIMP que inibem a atividade das MMP (Koneru et al. 2017). Na presença da lesão hepática, uma rede de sinalização altera essa dinâmica, havendo predomínio da síntese e uma redução na degradação da matriz (FIG. 4) (Elpek, 2014). 20 Figura 4. Arquitetura normal do fígado e associada a fibrose. Após o dano os hepatócitos e as células de Kupffer se ativam, liberando mediadores inflamatórios que contribuem para ativação da célula estrelada. As célula estreladas hepáticas entram em um processo de ativação, proliferam e secretam grandes quantidades de proteínas da matriz extracelular. Fonte (daptado Bataller e Brenner 2005). Outra característica da perpetuação da ativação da célula estrelada é perda das gotículas de lipídios com vitamina A (Sharvit et al. 2013). O principal fator de transcrição envolvido neste processo é o receptor ativador proliferador de peroxissomo γ (PPARγ), que se encontra em baixa expressão em células ativadas. Ele inibe a expressão de genes pro-fibróticos, inibe a proliferação celular e a expressão de elementos da matriz extracelular. PPARγ também é um dos principais fatores relacionados com o processo de reversão do fenótipo da célula estrelada do estado ativado para o estado quiescente (Elpek, 2014). Em se tratando de reversão da fibrose, a grande questão é como resolver a ativação das células estreladas. Apesar de estudos in vitro demonstrarem que as células estreladas podem reverter seu fenótipo, nenhum estudo comprovou que o mesmo acontece in vivo. Não está clara se a regressão da fibrose acontece quando as células estreladas sofrem apoptose ou quando retornam ao seu fenótipo quiescente (Troeger et al. 2012; Zhang et al. 2016). Na tentativa de minimizar a fibrose, a apoptose é considerada o processo mais importante. No fígado, é considerada um processo complexo, que na maioria das vezes é desencadeada por receptores de morte que são altamente regulados em células estreladas ativadas (Wang et al. 2016). A medida que a lesão hepática persiste, a célula estrelada fica mais suscetível a apoptose e a sinalização pro-apoptótica através de sinalização extracelular, como por exemplo morte de hepatócitos (Lee et al. 2015). 21 Outro processo que vem contribuindo para redução da fibrose, após retirada do estímulo que promove a lesão é a senescência da CEH (Hubackova et al. 2012). Este processo está sendo considerado um mecanismo que colabora com o controle da fibrose pela redução no número de células que produzem os componentes da matriz extracelular, pelo aumento na degradação de elementos da matriz por meio do fenótipo secretório de senescência (SASP), que se caracteriza pelo aumento da expressão de substâncias tais como interleucinas, quimiocinas, fatores de crescimento e proteases (Acosta et al. 2013) e pela remoção dos miofibroblastos pela ação das células Natural Killer (Jun e Lau, 2011). A remoção de agentes causadores da lesão hepática reverte o fenótipo de aproximadamente 50% das CEHs ativados para um estado inativo, semelhante ao fenótipo quiescente (Kisseleva et al. 2012). Neste processo de reversão ocorre uma expressão gênica diferencial, com redução na expressão de genes correlacionados a fibrogênese e aumento na expressão de genes lipogênicos (Sharvit et al. 2013). O tratamento químico de CEHs ativadas com diferentes compostos, que promovem a diferenciação dessas células em adipócitos, aumentou o nível de expressão do fator de transcrição da proteína de ligação do elemento regulador de esterol (SREBP-1c). Este elemento ativa os processos transcricionais de genes adipogênicos, causando reversão bioquímica e morfológica da célula estrelada ativada em células quiescentes (Pettinelli e Videla, 2011; Mahdy et al. 2016). Logo o metabolismo lipídico assume uma posição importante na modulação do processo fibrótico hepático em células estreladas, tornando-se um alvo em potencial para investigação. 1.3 O papel do Sistema Renina/Angiotensina na fibrose hepática O sistema renina-angiotensina (SRA) é um regulador essencial do sistema vascular, responsável pelo controle da pressão arterial e homeostasia dos fluidos corporais. Dois peptídeos se destacam nesse controle, o primeiro é o octapeptídeo Angiotensina II (Ang II), considerado como maior efetor do SRA, apresentando um potente efeito vasoconstrior e mitogênico. O segundo é o heptapeptídeo Angiotensina- (1-7) (Ang-(1-7)), que apresenta efeito antagônico a Ang II, promovendo vasodilatação 22 e com propriedades anti-proliferativas e anti-angiogênicas (Gironacci et al. 2011; Pessôa et al. 2015). Embora este sistema apresente efeito sistêmico, também existe uma produção local descrita em vários órgãos, com sinalização autócrina e parácrina. O sistema local responde a vários estímulos fisiológicos e patofisiológicos que geralmente implicam na modulação de crescimento e proliferação celular, produção de espécies reativas de oxigênio, sereção de hormônio, controle local da inflamação e fibrose (Sukumaran et al. 2012; Cao et al. 2016). A sinalização celular do SRA, inicia-se com a degradação de angiotensinogênio em Angiotensina I (Ang I) pela enzima renina. Em seguida a enzima conversora de angiotensina (ECA) converte Ang I em Ang II. Dois receptores são alvo de ligação da Ang II, o receptor de angiotensina II tipo-1 (AT1) e receptor de angiotensina II tipo-2 (AT2). Os diversos efeitos cardiovasculares do SRA estão inicialmente associados à distribuição dos receptores, especialmente do subtipo AT1. Estes são expressos no pulmão, no fígado, nos rins, no coração, na aorta e em outros vasos, no cérebro e nas adrenais e várias outras glândulas endócrinas (Sukumaran et al. 2011) e são encontrados de forma abundante em adultos. A ativação dos receptores AT1desencadeiam diversos efeitos incluindo vasoconstrição, participação no processo inflamatório, produção da matriz extracelular e homeostasia de sódio. O receptor de angiotensina II tipo-2 (AT2), embora esteja presente na vida fetal, são encontrados na vida adulta em vários tecidos, incluindo glândulas adrenais, coração, aorta, rins, ovários, útero e sistema nervoso central, e desencadeia efeitos contrários ao recpetor AT1 (vasodilatação, diminuição da proliferação celular, diminuição da angiogênese, aumento excreção renal de sódio) (Gava et al. 2012). A produção de Ang-(1-7) ocorre principalmente pela atuação da enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2), que atua na Ang II. Uma via alternatina de produção também pode acorrer a partir da Ang I pela ação das enzimas neprilisinas, prolilendopeptidase e oligopeptidase thimet (Silva et al. 2013) (FIG. 5). A Ang-(1-7) apresenta vários efeitos fisiológicos, tais como: ação antihipertensiva, antiarrítmica e com propriedades cardioprotetoras. Em contraste a Ang II, o peptídeo também possui propriedades antinflamatória, antifibrótica e antitrombótica. Dessa forma a Ang-(1-7) 23 tem sido proposta para atuar como equilíbrio do SRA, capaz de se opor as ações da Ang II (Xue et al. 2012). O mecanismo de ação da Ang-(1-7) se da pela ligação do peptídeo ao seu receptor de superfície celular denominado receptor mas, acoplado a proteína G, que desencadeia vários efeitos fisiológicos característicos da Ang-(1-7) (Silva et al. 2013). A literatura também sugere que alguns dos efeitos da Ang-(1-7) possa ser mediado pela estimulação de receptores AT1 e AT2 da Ang II, pelo fato dos antagonistas destes receptores serem capazes de inibir a ação da Ang-(1-7) (Jin et al. 2012). No entanto, a baixa afinidade da Ang-(1-7) para receptor AT1 (aproximadamente, 150 vezes menor que a Ang II) e para o receptor AT2 (aproximadamente 1000 vezesmenor que Ang II), é difícil atribuir essas ações para a ligação direta da Ang-(1-7) a estes receptores (Xu et al. 2013). É provável que alguns órgãos, tais como os rins e algumas células vasculares, apresentem subtipos de receptores da Ang-(1-7) sensíveis aos antagonistas de Ang II (Cao et al. 2014). Figura 5. Via metabólica de produção da Ang II e Ang-(1-7). A enzima conversora de angiotensina (ECA) produz Ang II a partir da clivagem de Ang I. A produção de Ang-(1-7) ocorre principalmente pela ação da enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2) na Ang II. Outra via de produção de Ang-(1-7) pode ocorrer pela ação das enzimas neprilisina (NEP), prolilendopeptidase (PEP) e carboxipeptidase (CBP) sobre a Ang I (Pereira et al. 2009). Embora existam vários estudos sobre a fibrose hepática, ainda não está claro os mecanismos fisiopatológicos que desencadeiam a patologia. Sabe-se que muitos mediadores podem participar deste processo como: componentes do SRA, o sistema 24 nervoso simpático (SNS), a vasopressina, os peptídeos natriuréticos, a endotelina e o óxido nítrico. Inúmeras evidências indicam o SRA como participante no processo de fibrose hepática (Pereira et al. 2009; Santos et al. 2013; Mak et al. 2015). A alteração nos níveis dos componentes do SRA tem sido observada em várias patologias hepáticas. Na insuficiência hepática crônica, é observado um aumento na atividade de renina plasmática e em portadores de cirrose, especialmente naqueles com síndrome hepatorenal, os níveis de aldosterona circulante encontram-se elevados (Grace et al. 2013; Herath et al. 2013). Em se tratando do desenvolvimento da fibrose, evidências suportam a ideia que a Ang II promove a ativação e diferenciação das células estreladas em miofibroblasto, além de estimular a produção de TGF-β1, via receptor AT1 (McCollum et al. 2012). Embora haja uma expressão dos receptores AT1 e AT2 nas células hepáticas, ocorre um predomínio do receptor AT1, que estimula contração de miofibroblasto, proliferação, liberação de citocinas inflamatórias e deposição de componentes da matriz extracelular (Santos, 2014). Alguns estudos com modelo animal, utilizando inibidores da ECA e bloqueadores do receptor de angiotensina evidenciam o papel do SRA na fibrose hepática (Bilman et al. 2012; Mario et al. 2012). O estudo com camundongos knockout do receptor AT1 mostrou uma atenuada fibrose e inflamação hepática. A análise de imuno-histoquímica, revelou redução da infiltração de células inflamatórias, redução nos produtos da peroxidação de lipídios e redução na fosforilação de c-Jun e p42/44 MAPK em comparação com animais tipo selvagem para AT1 (Cao et al. 2016). Por outro lado, camundongos knockout para o receptor AT2, apresentaram um agravo na fibrose induzida por CCl4 estimulando o estresse oxidativo, que leva a ativação das CEH. Enquanto que os receptores AT1 desempenham um papel importante no desenvolvimento de fibrose, o receptor AT2 apresenta efeito antifibrogênicas no fígado (Herath et al. 2013). O principal efeito fibrogênico do SRA no fígado é a expressão de TGF-β1 via receptor AT1. No estudo de Yoshiji e colaboradores (2001), investigaram o efeito dos medicamentos candesartan, bloqueador do receptor AT1 e perindopril inibidor da ECA, sobre o desenvolvimento da fibrose em ratos. A partir da avaliação de marcadores de fibrose no soro, observaram que houve uma redução no desenvolvimento da mesma. O efeito inibitário dos dois medicamentos também reduziu expressão de RNAm e níveis 25 proteicos de TGF-β1 no fígado. Dessa forma, essas drogas podem ser uma nova estratégia para tratamento da fibrose. Alguns estudos utilizando captopril, um medicamento inibidor da ECA amplamente utilizado no tratamento da hipertensão arterial, evidenciaram redução nos níveis de RNAm de TGF-β1 e procolágeno α1 no fígado de ratos submetidos a ligadura do ducto biliar, reforçando a hipótese de ação da Ang II nas céulas estreladas (Wu et al. 2014). Outros estudos têm relatado possível efeito antifibrótico de bloqueadores do SRA em pacientes com hepatite C. Em um estudo com 30 pacientes infectados pelo vírus, com quando leve de fibrose, foram tratados com losartan 50 mg/dia e ácido ursodesoxicólico (ursacol®) 600 mg/ dia, uma substância normalmente presente na bile humana em pequenas quantidades indicada para aumentar a capacidade da bile em dissolver o colesterol, enquanto os controles receberam apenas o ácido ursodesoxicólico. Houve reduções significativas nos marcadores séricos de fibrose hepática, inclusive TGF-β1 e colágeno tipo IV no grupo tratado com losartan e ursodesoxicólico, mas não houve mudanças significativas na pontuação da fibrose entre a grupos (Bataller et al. 2005). O tratamento com inibidores da ECA e bloqueadores do receptor AT1 tem mostrado efeitos benéficos nas doenças do fígado. Estes resultados demonstram como a Ang II/AT1/TGF-β1 atuam no fígado como agentes mediadores da fibrose (Mak et al. 2015; Patel et al. 2015). Souza e colaboradores (2001) indicam que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre aumento da expressão gênica da ECA e AT1, acompanhada do aumento da expressão de ECA2 e mas e dos níveis plasmáticos de Ang II e Ang-(1- 7). O fígado cirrótico apresenta grande capacidade de converter Ang II em Ang-(1-7), a partir dos elevados níveis de ECA2. Em adição, a produção hepática de Ang-(1-7) aumenta na presença de inibidor da ECA. Estudos evidenciam o efeito benéfico da Ang-(1-7) sobre a fibrose hepática utilizando antagonista do receptor mas [7-D-Ala]-Ang-(1–7) (A779). O tratamento do fígado fibrótico com A779 aumenta os níveis de TGF-β1, demonstrando que a estimulação do receptor mas apresenta um papel protetor contra fibrose (Silva et al. 2013). A infusão de Ang-(1-7) em ratos com ducto biliar ligado, reduziu a expressão de RNAs mensageiros (RNAm) de colágeno 1 e reduziu também os níveis transcricionais e 26 proteicos de α-SMA, promovendo uma redução da fibrose e indicando uma inibição das células estreladas pela Ang-(1-7) (FIG. 6) (Lubel et al. 2008). Apesar da descoberta da Ang-(1-7) e do reconhecimento de que muitas de suas ações são opostas a Ang II, o mecanismo de regulação deste peptídeo sobre a fisiopatologia da fibrose hepática ainda precisa ser melhor estudado. É claro que, no fígado doente, os componentes "clássicos" do SRA tais como a renina, ECA, Ang II e o receptor AT1 estão superexpresso, mas, o mais importante, é que os componentes "alternativos" do SRA, tais como a ACE2, Ang-(1-7) e o receptor mas também são positivamente regulados (Passos-Silva et al. 2013; Santos, 2014). Em análise geral os componentes da via "clássica" contribuem para o processo fibrótico enquanto que os componentes da via "alternativa" apresentam uma tentativa de restaurar o quadro de fibrose. Os possíveis benefícios da Ang-(1-7) sobre a fibrose hepática representa um alvo em potencial para desenvolvimento de futuras terapias voltadas para doeças crônicas do fígado (Silva et al. 2013; Feltenberger et al. 2013; Cao et al. 2016). A formulação oral hidroxipropil-ciclodextrina [HPβCD/Ang-(1-7)], que aumenta os níveis de Ang-(1-7) na corrente sanguínea, foi testada na função hepática, avaliando a esteatose e expressão de marcadores inflamatórios em fígado de ratos tratados com uma dieta rica em gordura. Os resultados mostraram uma redução na gordura hepática, diminuição do colesterol total e triglicérides plasmático, no grupo tratado com HPβCD/Ang-(1-7). Houve também uma redução significativa na expressão do fator de necrose tumoral-α e interleucina-6 no fígado e nos genes relacionados à adipogênese hepática: acetil-CoA carboxilase, PPAR-γ e SREBP-1c. Esses resultados demonstraram que Ang-(1-7) reduziu o perfil proinflamatório e alterou o metabolismo de lipídio, no fígado de camundongos tratados com dieta rica em gordura(Feltenberger et al. 2013). 27 Figura 6. Esquema do mecanismo de ação da Ang II e Ang (1-7) em seus respectivos receptores. O mecanismo regulatório promovido por ECA/Ang II/AT1 produz efeitos fisiológicos que favorecem aumento da pressão arterial, fibrose, proliferação celular entre outros. O mecanismo promovido por ECA2/Ang (1-7)/mas produz efeitos contrários aos da Ang II. Adaptado (Pereira et al. 2009). 1.4 miRNAs e a regulação do processo fibrosante hepático Nos últimos anos os miRNAs tornaram-se alvo de pesquisas, na tentativa de conhecer a regulação da expressão gênica em condições homeostáticas e nas patologias. Essas moléculas foram descobertas por Ambros e colaboradores em 1993 (Ambros, 2004; Deiuliis, 2016) e se caracterizam como pequenos elementos de 23 a 25 nucleotídeos de RNA que modulam a regulação da expressão gênica, pelo processamento pós-transcricional (Jiang et al. 2010). Os genes que codificam miRNAs, produzem inicialmente um transcrito primário (pri-RNA) a partir da enzima RNA polimerase II/III. Ainda no núcleo o transcrito primário sofre ação do complexo Drosha – DGCRB originando o pré-miRNA de aproximadamente 70 nucleotídeos. Estes são transportados para o citoplasma via complexo exportina-5, chegando lá, o pré-miRNA sofre clivagem pelo complexo DICER (atividade RNAse III)/ TRBP (proteína ligadora de RNA), originando miRNA maduro (miRNA duplex) com aproximadamente 21-23 nucleotídeos (Ambros, 2004). Em seguida o miRNA duplex associa-se ao complexo RNA indutor de silenciamento (RISC) - Argonauta (Ago2) e GW182 (RISC/Ago2/GW182) que seleciona uma das fitas para torna-se madura. A clivagem, dissociação do duplex, ocorre pela ação de 28 Ago2, considerada o motor catalítico do complexo indutor de silenciamento. A fita madura de miRNA juntamento com RISC/Ago2/GW182, liga-se ao RNAm, na sua exptremidade 3´ou 5´dependendo da sua complementariedade, promovendo a regulação da expressão gênica por diferentes mecanismos (clivagem do RNAm, repressão da tradução ou ativaçao da tradução). A fita não selecionada é degradada (FIG. 7) (Szabo e Bala, 2013; Portius et al. 2017). Figura 7. Biogênese dos miRNAs. Fonte: adaptado (Szabo e Bala, 2013). O nível de expressão, dos miRNAs pode sofrer alterações nas células de acordo com as condições fisiológicas das mesmas. Cada miRNA pode regular até 200 genes alvos diferentes demonstrando a intrincada rede de conexões moleculares entre essas moléculas e o equilíbrio celular (Jiang et al. 2010). Sendo assim alterações positivas ou negativas nos níveis homeostáticos de miRNAS podem ter amplos efeitos fisiopatológicos na célula, onde muitos genes terão sua expressão alterada (Guo et al. 2009). A ligação do miRNA a seu alvo regula processos biológicos essenciais em diversos tipos celulares, incluindo as células do fígado. Vários estudos evidenciam alterações intracelulares de miRNAs e sua relação com várias patologias hepáticas 29 incluindo hepatites, esteatose hepática alcoólica e não alcoólica, doença autoimune do fígado e fibrose (Szabo e Bala, 2013). A fibrose sendo um processo comum a todas as patologias hepáticas, torna-se um foco importante para estudo de miRNAs que estejam envolvidos neste processo (He et al., 2012). Foram descritos miRNAs que apresentam efeito pro-fibrogênico e anti- fibrogêncio e que atuam na regulação da expressão de citocinas e fatores de crescimento chaves no desenvolvimento da fibrose, além de regular a ativação da CEH (Szabo e Bala, 2013). Os miRNAs desempenham um papel essencial na diferenciação, proliferação, apoptose, metabolismo de lipídio e produção da matriz extracelular na CEH. Os miR- 15b e miR-16 atuam aumentando a apoptose das células estreladas, reduzindo o número de células ativadas e atenuando a fibrose (Shen et al. 2012). A baixa expressão de miR- 27a e 27b aumentada a expressão do receptor retinóide X-α e permite que as células estreladas ativadas apresentem o fenótipo quiescente (Ji et al. 2014); a superexpressão de miR-150 e miR-194 inibiu a ativação da célula estrelada e a produção de componentes da matriz extracelular via inibição da expressão de c-myb e rac (Venugopal et al. 2010); a baixa expressão de miR-29 em CEH ativada inibiu diretamente a produção de colágenio tipo I (Ogawa et al. 2010; Roderburg et al. 2010). A comparação dos níveis de expressão do miR-335 em CHE no fenótipo quiescente e ativado evidenciou que este miRNA encontra-se em baixa expressão durante ativação da célula estrelada. A regulação positiva do miR-335 in vitro na célula estrelada ativada mostrou o papel desse miRNA na regulação da migração celular, inibição da expressão de α-SMA e colágeno tipo 1 (Chen et al. 2011). He e colaboradores (2012) relataram que a expressão de miR-146a foi regulada negativamente na CEH, em resposta a estimulação por TGF-β1. Além disso, verificaram que a hiperexpressão de miR-146a suprimiu a proliferação da célula estrelada e aumentou a apoptose via inibição de SMAD4. Durante ativação da célula estrelada ocorre aumento de TGF-β1 e depósito de colágeno 1, dois elementos fundamentais no processo de fibrose. A inibição de TGF-β1 pelo miRNA-19b foi confirmada pela baixa expressão de elementos que participam dessa via de sinalização, tais como receptor de TGFβ1 II (TGF-βRII) e SMAD 3, e a 30 redução na expressão de RNAm de colágeno α1 (I), α2 (I) e pro-colágeno (Lakner et al. 2012). Na via de sinalização por TGF-β1, a proteína SMAD3 é considerada como um receptor (R-Smad), SMAD4 como co-estimulador (Co-Smad), enquanto SMAD7 funciona como um regulador negativo de TGF-β1 (anti-Smad). O miR-21 está sendo classificado como um agente pro-fibrótico, pois inibe a proteína SMAD7, o que favorece a indução da fibrose (Vettori et al. 2012; Kwiecinski et al. 2012). O miR-122 atua na homeostasia do fígado normal e possui seus níveis reduzidos em situações de lesão hepática. Camundongos com deficiência do miR-122 desenvolvem esteatose hepática e fibrose. O fator pro-fibrogênico KLF6, fator de transcrição que apresenta vários genes como alvo inclusive TGF-β1 e seus receptores, foi identificado como alvo do miR-122, apresentando um papel no processo de fibrose. A utilização crônica de álcool pode modular a expressão do miR-122, e a diminuição da expressão deste miRNA foi encontrado no fígado de ratos submetidos ao tratamento com álcool. Sabe-se que o uso crônico de álcool pode levar a fibrose hepática, uma diminuição do miR-122 sugere um papel direto ou indireto desse miRNA na fibrose induzida pelo álcool. O miR-122 também foi observado com baixa expressão em células estreladas ativadas, em fígado fibrótico de rato (Li et al. 2013). A expressão de miR-221/222 aumenta durante a progressão da fibrose do fígado e estão significativamente correlacionados com a expressão de colágenio 1 (COL1A1) e α-SMA em fígados humanos fibróticos. Os miR-221/222 estão altamente expressos na linhagem celular de célula estrelada humana, LX-2, e a sua expressão induziu a ativação das células estreladas. A expressão de miR-222 em células estreladas, pode ser regulada, pela ativação do fator nuclear kappa B (NF-kB), que atua como um fator de transcrição envolvido na resposta celular a estímulos de citocinas inflamatórias durante o processo de fibrose. A elevada expressão dos miR-221/222, torna estes miRNAs uma opção a mais como marcador para ativação de CEH e progressão da fibrose (Ogawa et al. 2012). Os miR-199a, miR-200 e miR-200b são encontrados com níveis elevados e associados a progressão da fibrose hepática em pacientes com hepatite C e em camundongos que tiveram a fibrose induzida pelo CCl4. Eles promovem o aumento da expressão de vários genes relacionados a fibrose (Murakami et al. 2011). 31 Além da localização intracelular, os miRNAs também são descritos na corrente sanguíneae espaços extracelulares (Zhang et al. 2015). Os miRNAs circulantes são distribuídos em microvesículas e exossomos e atuam como mensageiros que apresentam o potencial de influenciar as funções de células e tecidos em locais distantes de origem. Embora mais estudos precisam esclarecer o mecanismo de atução desses miRNAs, estes estão sendo utilizados como biomarcadores para várias patologias, devido sua grande estabilidade no soro e plasma (Starkey et al. 2011). Alguns miRNAs estão sendo descritos como biomarcadores importantes para doenças hepáticas. Estudos têm relatado o aumento de níveis circulantes no soro de alguns miRNAs, que parecem ser um marcador em potencial de lesão do fígado em geral e/ou indicando uma etiologia específica de doença hepática (Roderburg et al. 2012). O potencial terapêutico dos miRNAs está recebendo cada vez mais atenção em diversas patogenias, incluindo as doenças hepáticas. Um grande desafio para muitas doenças do fígado é identificar tratamentos clinicamente eficazes e biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico (Szabo e Bala, 2013). O conhecimento sobre miRNA em doenças do fígado humano poderá contribuir com a identificação de biomarcadores, subsidiando aplicações clínicas. O uso dos miRNAs têm muitas vantagens como modalidade terapêutica, as sequências maduras de miRNAs são curtas e muitas vezes completamente conservadas em múltiplas espécies de vertebrados (Rooij e Kauppinen, 2014), além disso, os miRNAs apresentam um efeito pleiotrópico, ou seja, a capacidade de regular um grande número de genes dentro de redes celulares diferentes (Otsuka et al. 2017). Em se tratando de novas formas terapêuticas, uma alternativa é a regulação de miRNAs que se apresentam com expressão diferencial nas diversas patologias, na tentativa de se normalizar o seu padrão de expressão (Szabo e Bala, 2013). O nível de expressão de um determinado miRNA identificado como alterado, poderá ser normalizado, quer seja inibindo um miRNA sobre-expresso quer seja induzindo a expressão de um miRNA sub-expresso (Rooij e Kauppinen, 2014). Na tentativa de identificar não somente genes regulados por miRNAs mas também processos celulares afetados por miRNAs específicos, o cultivo celular é um modelo muito utilizado por permitir uma análise do comportamento celular isolado da multiplicidade de processos biológicos que ocorrem in vivo (Shah e Calin, 2014). O uso 32 da cultura celular pemite identificar a expressão de miRNAs e a validação da interação entre um miRNA e seus alvos previstos, através da análise de expressão gênica e de proteínas (Szabo e Bala, 2013; Bertoli et al. 2015). Dentro deste contexto a cultura de células 2D é bastante utilizada, pois apresenta facilidade em ser manipulada e é particularmente adequada quando um pequeno número de miRNAs que devem ser estudados (Nguyen et al. 2012). Já a cultura de célula 3D, utiliza uma matriz específica capaz de suportar o crescimento celular, apresentando uma abordagem mais completa das condições observadas in vivo. As interações célula-célula e célula-matriz estabelecem uma rede de comunicação complexa, através de mecanismos bioquímicas e mecânicos, que contribuem para uma melhor caracterização da morfogênese, modulações fisiológicas e perfis de miRNA (Li et al. 2012; Yao et al. 2015). Duas abordagens são empregadas para modular a atividade do miRNA, utilizando a cultura celular como modelo: (I) restaurar a função de um miRNA usando miRNA de cadeia dupla sintética ou baseado em um vetor viral de superexpressão e (II) inibição da função de um miRNA usando oligonucleótidos antimiR modificados quimicamente (Rooij e Kauppinen, 2014; Shah e Calin, 2014). Na estratégia de restabelecer a função do miRNA, os miRNAS mímicos estão sendo amplamente utilizados (Pritchard et al. 2012; Rooij e Kauppinen, 2014; Steinkraus et al. 2016). Essas moléculas se caracterizam como duplexes de RNA sintético em que uma das cadeias (cadeia guia) é idêntica à sequência de miRNA maduro e tem como função mimetizar a função endógena do miRNA (Zhang et al. 2016). Já, os vetores virais são utilizados para transportar miRNA de interesse para dentro de células alvo (Davidson e Paul, 2011). Assim uma alternativa terapêutica direcionada para algumas condições patológicas, é a utilização de miRNA mímicos ou vetores virais, visando equilibrar os níveis endógenos de miRNAs nas patogenias, na tentativa de contribui como controle ou inibir a progressão da doença (Steinkraus et al. 2016) (FIG. 8). Pararalelamente, miRNAs sintéticos e complementares a sequência de moléculas maduras (miRNAS inibidores) também vem sendo utilizados nos estudos funcionas das pequenas moléulcas. Esses miRNAs inibidores, também denominados de moléculas antimiR são capazes de se ligarem ao miRNA selvagem e bloquear a função dos mesmos (Ebert e Phillip, 2010; Shah e Calin, 2014) (FIG. 8). Para obter um eficiente silenciamento de um miRNA in vivo, o oligonucletídeo antimiR deve ser 33 quimicamente modificado promovendo afinidade de ligação (Hassan et al. 2013). O Miravirsen, por exemplo, é uma molécula de RNA modificada e aplicada por injeção intravenosa ou subcutânea para o tratamento contra hepatite C. Ao chegar no fígado, miravirsen liga seletivamente ao microRNA miR-122; atuando como um molécula antimiR. O vírus da hepatite C precisa do miR-122 para se multiplicar, mas não pode utilizá-lo se vinculado ao miravirsen (Van Der Ree et al. 2014). Essa estratégia pode reduzir os níveis de miRNAs considerados como indutores de patologia ou cuja sobre-expressão é aberrante (Mugat et al. 2015), mas para fins terapêuticos a mecanísitca de atuação dessas moléculas precisa ser sempre estudada em aspectos moleculares, celulares e sistêmicos. Figura 8. Mecanismo de regulação da expressão gênica pelo miRNA endógenos e pela estratégia utilizando mimics. Inibição da ação do miRNA pela estratégia de inibidor (antimiR). Fonte:www.abmgood.com O RNA interferente (RNAi) é um mecanismo conservado em que os pequenos RNAs induzem o silenciamento de alvos complementares (Pisacane e Halic, 2017). O sistema de RNAi pode ser realizado por siRNA ou por miRNA. O siRNA são derivados de longas moléculas de RNA dupla fita de origem exógena (Marasovic et al. 2013). O miRNA, por outro lado, são pequenos RNAs dupla-fita endógenos, transcritos a partir do genoma. O siRNA normalmente se liga ao seu alvo de mRNA, através de um combinação perfeita entre as sequências (siRNA/mRNA). Em contraste, o miRNA pode 34 inibir a tradução de muitas sequências de mRNA diferentes porque o seu pareamento não é totalmente complementar (Pritchard et al. 2012). Um dos principais obstáculos ao uso do siRNA como drogas terapêuticas é obter sua internalização específica das pequenas moléculas na célula-alvo. Quimicamente, os pequenos RNAS são moléculas lábeis que apresentam carga negativa, o que dificulta a penetração celular através das membranas celulares hidrofóbicas (Seo et al. 2013). Diversas estratégias empregam injeção endovenosa de pequenos RNAs quimicamente modificados, tanto para prologar a sua meia vida como para se obter uma maior eficácia na internalização das células alvo. A utilização de estratégias de conjugação das moléculas ao colesterol e/ou de sua proteção dentro de lipossomas catiônicos vem sendo utilizada. A conjugação ao colesterol tem mostrado bons resultados, pois prolonga a meia vida dos siRNA na circulação por meio de ligação a lipoproteínas, que são resistentes à filtração pelos rins e oferecem também proteção à ação das nucleases plasmáticas. Embora eficaz, a conjugação ao colesterol não é um método seletivo, pois o complexo colesterol-pequenoRNA-lipoproteína pode ser endocitado por receptores de colesterol encontrados em todos os tipos celulares (Wittrup e Lieberman, 2015; Machitani et al. 2017). Por sua vez,o empacotamento de miscelas de lipossomas catiônicos contedo as moléculas de pequenos RNAs, melhora a farmacocinética e diminui a toxicidade dos siRNAs, embora resulte também em amplo espectro de ação celular (Tsuji et al. 2016). Mecanismos seletivos de entrega de siRNA a células e tecidos estão sendo intensamente estudados (Schneider e Tollervey, 2013; Liu et al. 2014; Pisacane e Halic, 2017). A entrega a células específicas facilita a incorporação dos RNAs por endocitose. Os sistemas seletivos de entrega para receptores específicos de superfície celular são vantajosos pela necessidade de menor dose e redução de efeitos fora do alvo. Diversos grupos têm estudado o uso de vetores virais para a introdução de shRNAs em organismos. Entretanto, o uso de vetores virais ainda é questionado quanto à segurança para emprego terapêutico (Thomson et al. 2011; Kobori et al. 2013). Como qualquer tipo de terapia genética, as terapias baseadas em miRNAs apresentam vantagens e desvantagens que devem ser avaliadas e discutidas. Por um lado, a utilização dos miRNAs como agentes terapêuticos, tendo estes vários alvos em simultâneo, faz com que seja possível regular vários genes pertencentes a uma via 35 comum ou com a mesma função biológica (Yao et al. 2015). Esta característica faz com que este miRNA não tenha como alvo apenas um único gene, mas sim uma rede de genes reguladores, permitindo assim uma maior eficiência relativamente a outros métodos terapêuticos que têm como alvo apenas uma molécula (Ding et al. 2011; Steinkraus et al. 2016), o que reforça a necessidade de testes mais aprofundados na atuação sistêmica dessas pequenas moléculas. 1.5 Metabolismo lipídico como elemento indutor da transdiferenciação das células estreladas hepáticas Os lipídios são componentes essenciais para a vida e suas várias propriedades estruturais e físicas influenciam diversos processos celulares e, portanto, a saúde humana (Magtanong e Dixon, 2016). Estes são sintetizados e modificados por vias metabólicas complexas, e atuam fornecendo energia, moléculas de sinalização e hormônios para afetar a proliferação celular, resposta ao estresse, função estrutural nas membranas celulares, atuação no sistema imunológico entre outras funções (Wang, 2016). Existem algumas categorias de lipídios encontrados em células de mamíferos, onde cada um apresenta características estruturais distintivas. Podemos encontrar os ácidos graxos, esfingolípidos, glicerolfosfatos, glicerofosfolípidos, triacilglicerol, esteróides, entre outros (Fahy et al. 2011). Cada categoria de lipídio abrange diversas funções e locais específicos na célula, como por exemplo a presença de fosfolipídio na membrana biológica; triglicerídeos armazenados nos adipócitos para serem usados como fonte de energia; o colesterol está relacionado com a produção de hormônios esteroides, entre outros (Atilla-Gokcumen et al. 2014). Existem basicamente duas vias de obtenção de ácido graxo no organismo, uma através da alimentação, onde as células irão usar os ácidos graxos livres na circulação; outra através da síntese de ácido graxo de novo, realizada no fígado, tecido adiposo e em tecidos com alguma alteração metabólica (Liu et al. 2010). A síntese de novo ocorre no citosol a partir da ativação do complexo enzimático de ácido graxo sintase (FAS). Para que a reação de síntese ocorra é preciso que os elementos para a formação de ácidos graxos, acetil-CoA e malonil-CoA estejam disponíveis (Jeon et al. 2012). 36 Inicialmente ocorre o transporte de acetil-CoA presente na mitocôndria, originada principalmente da transformação de piruvato (resultado da glicólise), por uma reação catai pelo complexo piruvato desidrogenase (PDHA1), formando acetil-CoA. O malonil-CoA é formado pela carboxilação da acetil-CoA através da enzima acetil-CoA carboxilase (ACACA) (Kong et al. 2016) (FIG. 9). A FASN catalisa a junção de acetil-CoA com malonil-CoA que utiliza a coenzima NADPH como agente redutor. Essa enzima possui um grupo prostético chamado ACP (proteína carregadora de acila) que está sempre ligada a cadeia de ácido graxo em crescimento. O processo de alongamento do ácido graxo ocorre através da sequência repetitiva das seguintes reações catalisadas pela FAS: condensação, envolvendo a transferência de duas unidades de carbonos do malonil-ACP para o acetil-ACP para liberar CO2 e formar ceto-acil-ACP; redução, com conversão de ceto-acil-ACP a hidroxiacil-ACP; desidratação, com eliminação de H2O para formar enoil-ACP e redução tirando a dupla ligação entre os carbonos e deixando um composto contendo 4 carbonos completamente saturados (acil-ACP). As reações se repetem por sete ciclos até a formação do palmitato (16 carbonos), sendo liberado da FAS abandonando o ciclo e concluindo a montagem de ácido graxo simples (FIG. 9) (Cheng et al. 2014; Sadowski et al. 2014). Figura 9. Síntese de ácido graxo de novo. O citrato é convertido em acetil-CoA, que por sua vez é convertido em malonil-CoA. A enzima FASN catalisa a condensação dos grupos acetil- CoA e malonil-CoA originando o palmitato. Fonte: adaptado (Liu et al. 2010) 37 A homeostase lipídica é crucial, de modo que o excesso de ácidos graxos pode ser prejudicial às células. Para evitar tal lipotoxicidade, as células convertem o excesso de ácidos graxos em lípidos neutros para armazenagem em gotículas lipídicas (Magtanong et al. 2016). Essas gotículas são organelas citoplasmáticas formadas dentro da bicamada lipídica do retículo endoplasmático e uma vez madura, brotam para formar uma organela independente. As proteínas transmembranares da gotícula induzem o armazenamento de lipídio, sendo a seipina uma proteína que desempenha um papel importante nesse processo (Tan et al. 2014). Os lípidos neutros primários do núcleo da gotícula de lipídio são principalmente ésteres de esterol e triacilgliceróis. A síntese lipídica neutra é catalisada pela acil-Coenzima A (acil-CoA) e diacilglicerol O- aciltransferase (DGAT1 e DGAT2) que sintetizam triacilgliceróis e a enzima acil-CoA colesterol aciltransferase (ACAT1 e ACAT2) que gera os ésteres de esterol. As enzimas de síntese lipídica neutra residem principalmente no retículo endoplasmático, com exceção da DGAT2, que também se localiza nas gotículas de lipídio (Straub et al. 2008; Crunk et al. 2013). A composição das gotículas pode variar de acordo com tipo de célula, na célula estrelada, por exemplo, além dos lipídios neutros também são encontrados ésteres de retinil e éster de colesterol (Fortuna et al. 2011). O éster de retinil é a principal forma de armazenamento do retinol, ao passo que essa esterificação é uma reação chave que regula a disponibilidade intracelular de retinol. Duas enzimas são importantes nessa via de esterificação: lecitina retinol aciltransferase (LRAT) e acil-CoA retinol aciltransferase (ARAT), ambas estão associadas com microssomos em diferentes tipos de células, incluindo a CEH. A LRAT utiliza retinol livre e retinol ligado a proteína celular ligada ao retinol (CRBP) como substrato, enquanto o ARAT catalisa a esterificação apenas do retinol livre (Fortuna et al. 2011; Grumet et al. 2017) (FIG. 10). Para manter a homeostase do retinol, a CEH precisa ser altamente sensível as variações sistêmicas, e equilibrar a atividade de esterificação (O’Byrne et al. 2013). Além disso, as situações que estão associadas à conversão da célula estrelada do fenótipo quiescente (adequado para armazenamento de éster de retinil em gotículas de gordura) para o fenótipo de miofibroblasto (essencialmente envolvido produção de matriz extracelular) causam a hidrólise de ésteres de retinil e consequentemente uma diminuição na sua 38 quantidade, perda das gotículas de lipídio e acúmulo da matriz extracelular (Crunk et al. 2013; Tuohetahuntila et al. 2016). Figura10. Esterificação do retinol pelas enzimas LRAT e ARAT, dando origem ao éster de retinil, principal forma de armazenamento do retinol na gotícula de lipídio. A ativação da CEH do fenótipo quiescente para fenótipo ativado é um processo em que ocorre a supressão da adipogênese, e no metabolismo do retinóide, em contrapartida ocorre a estimulação da fibrogênese, proliferação e contratilidade da célula estrelada. Em consequência as alterações fenotípicas observadas durante o processo de ativação, um nível de energia relativamente elevado é necessário para as funções fisiológicas e patológicas (Yoshizato et al. 2016). A baixa expressão de PPAR- γ constitui um dos eventos moleculares essenciais para a ativação da célula estrelada; a expressão deste fator em cultura celular resulta na reversão fenotípica da célula estrelada ativada para o quiescente (Sharvit et al. 2013). O tratamento das CEHs ativadas com diferentes substâncias que promovam a diferenciação em adipócitos aumentou a expressão do fator de transcrição SREBP-1c e consequentemente promoveu a regulação de fatores de transcrição que regulam genes relacionados a adipogênese causando reversão bioquímica e morfológica das células estreladas ativadas para células quiescentes (Fernández-Alvarezet et al. 2011). Além disso, quando ativadas, as células estreladas produzem em grande quantidade o colágeno tipo I, predominante no tecido fibroso. Este apresenta uma estrutura complexa que requer numerosas interações intramoleculares e ligações de hidrogênio, além da associação com outros componentes da matriz (Lee e Friedman, 39 2011; Escobedo et al. 2013). Esse processo consome mais energia do que a produção de outras proteínas comuns, tais como proteínas globulares. Assim as funções das CEH ativadas, especialmente no aumento na síntese de colágeno e na aquisição de contratilidade, requerem um suprimento abundante de ATP (Walther e Farese, 2012). A autofagia das gotículas de lipídio está sendo relacionada como um processo que auxilia na obtenção de energia pela célula estrelada para realizar suas funções durante a fibrogênese (Hernandez-Gea et al. 2012). A via clássica do metabolismo lipídico é mediada por lipases citosólicas, logo a autofagia das gotículas de lipídio, irá disponibilizar substrato para uma maior produção de energia pela célula (Dong e Czaja, 2011). O estudo de Thoen e colaboradores (2011) observaram que a autofagia das gotículas é necessária para a transformação da CEH quiescente para ativada, através do aumento da proteína associada a microtúbulo 3 II (LC3-II). Esta proteína está localizada na membrana do fagóforo e sua quantificação é normalmente utilizada para estimar a abundância de autofagossomas (Glick e Macleod, 2010). No estudo, amostras de fígado de camundongos tratados com CCl4, apresentaram um aumento significativo do marcador para fagossomo (LC3-II) em comparação com fígados saudáveis (Thoen et al. 2011). Com o processo de autofagia, os lípidos ficam livres para serem hidrolisados e liberar ácidos graxos, que podem ser utilizados para gerar energia e lipídios de membrana (Greenberg et al. 2011; Walther e Farese, 2012). Na CEH, durante o processo de ativação, o destino principal desse lipídio é para gerar energia através da β- oxidação (Tuohetahuntila et al. 2015). O processo de β-oxidação caracteriza-se pelo catabolismo de ácidos graxos na mitocôndria, com sucessivas retiradas de unidades de dois átomos de carbono para formação de acetil-CoA. O processo pode ser dividido em quatro reações: oxidação do acil-CoA em enoil-CoA, hidratação com formação de 3- hidroxiacil-CoA, oxidação de um grupo hidroxila a carbonila resultando em beta- cetoacil-CoA e por fim a reação de beta-cetoacil-CoA com uma molécula de CoA formando um acetil-CoA (Currie et al. 2013) (FIG. 11). 40 Figura 11. Esquema das quatro reações de β-oxidação. Fonte: Nelson e Cox. Princípios de Bioquímica do Lenhninger, 2014. A oxidação de ácidos graxos é altamente regulada, a carnitina palmitoiltransferase-I (CPT1), por exemplo, é uma enzima chave envolvida na captação mitocondrial de ácidos graxos e pode ter sua função inibida por malonil-CoA (Polinati et al. 2015). Um aumento de malonil-CoA suprime a oxidação de ácidos graxos mitocondriais através da diminuição do transporte de ácidos graxos, já a redução de malonil-CoA leva ao aumento da oxidação de ácidos graxos (Lo et al. 2008). O nível de malonil-CoA é controlado por sua síntese e degradação, a síntese ocorre a partir da carboxilação de acetil-CoA pela acetil-CoA carboxilase (ACC) 1 e degradado a acetil- CoA por malonil-CoA descarboxilase (MCD) (Polinati et al. 2015). Alterações no metabolismo de lipídio das gotículas está sendo relacionado a esteatose hepática não alcoólica. Níveis elevados das proteínas perilipina e efetor tipo DFFA indutor de morte celular, presentes na gotícula de lipídio, estão correlacionadas a progressão da esteatose hepática (Fujii et al. 2009; Jinno et al. 2010; Xu et al. 2011). A retirada da proteína CGI-58, específica do fígado que facilita a lipólise em gotículas de lipídio, leva a esteatose hepática não alcoólica e a fibrose através de uma redução na 41 atividade hidrolítica de lipídios (Guo et al. 2013). Além disso, a variante de patatina fosfolipase contendo domínio da proteína 3 (PNPLA3), que tem sido associada à diminuição da lipólise, também promove esteatose hepática (Rotman et al. 2010). Apesar de uma potencial redução da lipólise contribuir para acúmulo de gordura no fígado, estudos em outros tecidos sugerem que a lipólise pode promover a inflamação. Por exemplo, nos adipócitos, o efetor tipo DFFA indutor de morte celular regula as respostas inflamatórias através da interação da gotícula de lipídio com fator nuclear das células T ativadas, um fator de transcrição que promove a inflamação (Ueno et al. 2013). Além disso, numerosas enzimas envolvidas na biossíntese de eicosanóides estão presentes nas gotículas de lipídio em vários tipos de células inflamatórias (Paiva et al. 2010). Dentro deste contexto, sugere-se que as gotículas de lipídio podem desempenhar um papel direto na regulação do controlo transcricional da inflamação e no fornecimento de mediadores lipídicos inflamatórios. Estudos que buscam elucidar como os lipídios são disponibilizados e utilizados como fonte de energia no processo de transdiferenciação da célula estrelada, podem auxiliar na identificação de uma molécula com potencial terapêutico para tratamento da fibrose. 1.6 Biotecnologia e a terapêutica do RNA O termo biotecnologia pode ser definido como a aplicação de técnicas biológicas em organismos vivos, ou suas partes, para obter um produto, processo ou serviço (Pereira et al. 2008). É uma área interdisciplinar fortemente ligada à pesquisa científica e tecnológica que tem como principal objetivo desenvolver processos e produtos utilizando agentes biológicos (Oliveira e Spengler, 2014). A moderna biotecnologia viabiliza ainda a modificação no DNA dos organismos vivos para que eles possam melhorar seu desempenho na produção de produtos e/ou processos (Ho et al. 2013). Nos últimos anos a biotecnologia tem apresentado avanços significativos na saúde humana (Guido et al. 2010). Através de técnicas modernas está sendo possível desenvolver medicamentos inovadores para combate de doenças raras. Uma das vantagens dos produtos biotecnológicos é a segurança gerada pelo controle na produção 42 e a capacidade de gerar o produto em larga escala, essas características implicam em melhorias na qualidade de vida do ser humano (Volkin et al. 2015). Várias técnicas e modelos de estudo são necessários para produzir substâncias terapêuticas e estas serem comercializadas. O modelo celular é uma das estratégias de planejamento para estudo de mecanismos celulares e moleculares, para testar compostos
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