Testes Sorológicos - Reagentes marcados

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TESTES SOROLÓGICOS
REAGENTES MARCADOSREAGENTES MARCADOS
Professora: Natália Malavasi Vallejo
INTRODUÇÃO
• São testes que necessitam da adição de uma molécula que
fornece cor, para que a reação seja visualizada;
• Alta sensibilidade e especificidade;
• Detecção de Ag, Ac e imunocomplexo;• Detecção de Ag, Ac e imunocomplexo;
• Custo alto;
• Automação completa ou não;
• Reagente marcado – Ag ou Ac;
INTRODUÇÃO
• Reagente marcado:
– Marcação não modifica interação Ag-Ac;
– Tipo de marcador determina nome do teste
• MARCADOR:• MARCADOR:
– Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO;
– Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA;
– Enzima = ELISA, Western Blot;
RADIOIMUNOENSAIO – RIA
• Foi inicialmente introduzido por Benson e Yelow (1959) para
medir a concentração de insulina no soro;
• Foi a primeira técnica imunológica capaz de identificar e
quantificar substâncias da ordem de nano a picogramas;
• Definição dos termos:
- Radioimunoensaio (RIA): mais empregado em ensaios com
antígenos marcados;
- Imunorradiométrico (IRMA): utilizado em ensaios com
anticorpos marcados.
• Vantagens:
- Muito sensível;
- Específico;
- Alta afinidade;
- Baixo custo*;
- Requer pouca amostra;
• Desvantagens:
- instabilidade dos radioisótopos;
- Risco operacional;
- Requer medidas especiais;
- Custo elevado de biossegurança;
- descarte especial do material;
RADIOIMUNOENSAIO – RIA
- Requer pouca amostra;
- Relativamente rápido.
- descarte especial do material;
• Aplicação: pesquisa de antígenos específicos (vírus da hepatite
B), marcadores tumorais, hormônios, polipeptídeos,
catecolaminas, esteróides, antibioticos, proteínas, vitaminas,
drogas, dentre outros..
RADIOIMUNOENSAIO – RIA
• Princípio:
- Reação de competição por um receptor comum entre uma
substância a ser determinada e a mesma substância marcada
radioisotopicamente
• Radioisótopos - I125 , I131, Trítio (3H), Carbono 14;
• Contagem radioativa � Tipos de radiações emitidas:
– radiações α e β - contador de cintilação;
– radiação γ - contador gama de cristal sólido.
• Procedimento:
- Adiciona-se:
RADIOIMUNOENSAIO – RIA
- Ag frio específico (soro do paciente);
- Ac específico (quantidade estabelecida);
- Ag marcado específico.
- Aguardar 16 horas para a ligação;
- Adicionar 2º Anticorpo (reconhece imunocomplexo);
- Adicionar água (Stop) e centrifugar;
- Retirar o sobrenadante e fazer a contagem radioativa.
A concentração de moléculas antigênicas presentes na amostra é
inversamente proporcional à leitura de radioatividade
RADIOIMUNOENSAIO – RIA
• Hormônio
• proteínas séricas
• drogas
• vitaminas
• Ac
0,0001 microgramas/ mL
Moléculas marcadas com 
ISÓTOPO
Contador de Radioisótopos
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• Permite a detecção e localização de Ag nos fluidos biológicos
utilizando Ac específicos, marcados com fluorocromos ou
fluoróforo, de modo que a localização dos Ag se torna visível ao
microscópio de fluorescência;
• Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividadecovalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade
específica com o antígeno;
• Fluorocromos são substâncias que absorvem luz em um dado
comprimento de onda e emitem luz em outro comprimento de
onda, geralmente absorvem na luz UV e se tornam
fluorescentes.
MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA
• A reação imunofluorescente é
desencadeada no microscópio de
epifluorescência e ocorre através da
emissão de luz de cor quando o fotón
é excitado por uma luz de curto
comprimento de onda (UV);
• Para deixar passar somente a
emissão secundária desejada, devem-
se utilizar filtros apropriados
dependendo da cor do fluorocromo.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) ���� VERDE
Ficoeritrina (FE) ���� VERMELHA
TIPOS DE REAÇÃO
• Imunofluorescência direta:
- detecção do Ag;
• Imunofluorescência indireta:• Imunofluorescência indireta:
- detecção do complexo Ag-Ac;
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
• Vantagens:
- alta especificidade e sensibilidade;
- possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de
sua localização (dermatose auto-imune).
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
• Desvantagens:
- Alto custo do microscópio de fluorescência;
- Necessidade de um conjugado para cada Ag que se
deseja identificar ou localizar.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
• Vantagens:
- sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade;
- o mesmo conjugado pode ser usado em diferentes
sistemas;
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
• Desvantagens:
- alto custo do microscópio de fluorescência;
- não automação.
APLICAÇÕES – REAÇÃO DE 
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• Detecção direta de microorganismos em secreções, na urina,
nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na
fenotipagem de células tumorais;
• Em bacteriologia, este método ainda é utilizado em laboratório
clínico na identificação de Streptococos do grupo A.clínico na identificação de Streptococos do grupo A.
• Diagnóstico sorológico de doenças infecciosas;
- Doença de Chagas;
- AIDS;
- Hepatites;
- Toxoplasmose;
APLICAÇÕES – REAÇÃO DE 
IMUNOFLUORESCÊNCIA
- Toxoplasmose;
- Raiva, etc.
• Doenças auto-imune;
• Tumores.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
ADENOCARCINOMA DE GLÂNDULA 
SALIVAR HUMANA
LINFÓCITOS INFECTADOS COM HIV
IMUNOFLUORESCÊNCIA SÍFILIS
IMUNOFLUORESCÊNCIA CHAGAS
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
TOXOPLASMOSE
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
• Utiliza antígenos ou anticorpos marcados com enzimas,
seguidos da adição de um substrato. Permite a detecção e
quantificação de substâncias de interesse biológico.
• É um teste com alta sensibilidade, especificidade, é rápido, de
baixo custo, e pode ser adaptado a diferentes graus de
automação.
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
• Princípio Básico: Imobilização de um dos reagentes (Ag ou Ac)
na fase sólida, enquanto o outro reagente (Ag ou Ac) esta ligado
a uma enzima.
• Fase sólida: Poliacrilamida, agarose, poliestireno, etc.
Geralmente são usadas placas de 96 poços com fundo reto, por
permitirem a realização de múltiplos ensaios e automação;
• Qualitativo e quantitativo.
MICROPLACA
• Substrato cromogênico:
– ao serem consumidos por enzimas geram produtos
coloridos solúveis ou insolúveis;
– quantificação do produto – espectrofotômetro, cor
visual ou comparação com padrão;
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
visual ou comparação com padrão;
– depende do tipo da enzima utilizada;
Substrato
Produto 
colorido 
solúvel 
ou 
insolúvel
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
492492
laranja, azullaranja, azul
marrom, violetamarrom, violeta
OPD, TMBOPD, TMB
DAB, 4CNDAB, 4CN
HH22OO22PeroxidasePeroxidase
nmnmcorcorcromógenocromógenosubstratosubstratoenzimaenzima
450450
amareloamarelo
liláslilás
PP--NFFNFF
55--BB--44--CC--33--IFIF
Fosfatase Fosfatase 
alcalinaalcalina
492492
marrom, violetamarrom, violetaDAB, 4CNDAB, 4CN
HH22OO22PeroxidasePeroxidase
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
• Tipos:
– ELISA indireto;
– ELISA direto ou sanduíche;
– ELISA captura de IgM;– ELISA captura de IgM;
ELISA
INDIRETO
ELISA
INDIRETO
ELISA DIRETO, CAPTURA OU 
SANDUÍCHE
ELISA CAPTURA DE IgM
RESULTADO ELISA
EQUIPAMENTOS
Lavadora de microplacas
Leitora de microplacas
acoplada a computador
WESTERN BLOT
• 1ª anticorpo: é específico para a proteína de interesse;
• 2ª anticorpo: específico para o 1º anticorpo ou para o complexo Ag-
Ac, conjugado com uma enzima que permite a identificação visual;
• Detecção: colorimétrica (quimioluminescente, fluorescente,
radioativa).
WESTERN BLOT
• Aplicações:
- Teste confirmatório para HIV;
- doenças infecciosas;
- doenças auto-imune;
- alergias.
WESTERN BLOT