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25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 1/29 Autoria: Symara Rodrigues Antunes Revisão técnica: Carlos Jorge Rocha Oliveira PROCESSOS MOLECULARES E GENÉTICOS UNIDADE 1 - O DOGMA DA BIOLOGIA MOLECULAR E SEUS PROCESSOS 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 2/29 Introdução Seja bem-vindo à disciplina de Processos Moleculares e Genéticos! Nossa jornada irá começar com a apresentação dos processos básicos de transmissão da informação genética e quais são as moléculas envolvidas neles. Contudo, primeiramente precisamos relembrar conceitos iniciais. É importante recordar que temos dois tipos de células: eucariotas e procariotas, sendo a primeira dotada de núcleo e organelas membranosas, enquanto a segunda não os possui. O núcleo, nas células eucarióticas, guarda uma importante molécula: o DNA (ácido desoxirribonucleico). O DNA, por sua vez, possui uma importância gigantesca: é o nosso material genético. É essa molécula que carrega todas as nossas informações, que designam nossas características físicas e moleculares, ou seja, toda a nossa constituição. Todavia, não é essa a molécula que irá levar a informação para as moléculas que executam as ordens. Portanto, neste capítulo iremos entender como acontecem os processos de transmissão da informação, quais as moléculas envolvidas e quais os processos que o cercam. Ao �nal, você terá a oportunidade de ter uma visão geral da aplicação desses conhecimentos nas técnicas de biologia molecular, tão difundidas nas pesquisas acadêmicas e cada vez mais ganhando espaço nos diagnósticos clínicos. Bons estudos! O ano de 1953 foi um marco na história da biologia molecular: estava descoberto o DNA. Porém, não ache que essa importante molécula simplesmente não era previamente conhecida. Na verdade, Francis Crick, James Watson e Maurice Wilkins realizaram a tarefa de reunir, em um artigo de revisão de duas páginas, as informações que já se conheciam dessa molécula e correlacionaram com a mais importante função dentro da célula: carregar a informação genética. Hoje, parece impensável um mundo no qual não se sabe que é o DNA a molécula que controla todas as funções dentro de uma célula. Não há ainda nem 100 anos dessa descoberta e já há muitos avanços desde 1.1 O dogma central da biologia molecular, suas moléculas e seus processos 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 3/29 então: conseguimos mapear todo o genoma humano e de diversos animais e plantas, conseguimos relacionar alterações estruturais e funcionais do DNA com diversas doenças e características nos animais, além de desenvolvermos técnicas baseadas em análises de DNA que facilitam nosso dia a dia e a medicina. Entretanto, a descoberta da molécula do DNA não respondia a muitas questões. Já se sabia da existência de RNA e proteínas, mas não se sabia como essas macromoléculas poderiam de alguma forma interagir, ou como interagiam, e qual a hierarquia entre elas. Foi assim que, em 1958, Francis Crick, continuando seus estudos moleculares, propôs o que �cou conhecido como o Dogma Central da Biologia Molecular. Con�ra! Figura 1 - Dogma Central da Biologia Molecular Fonte: Elaborada pela autora, 2020. Genoma é a denominação dada à sequência completa do DNA de um organismo. Em outras palavras, é a sequência de DNA que designa os genes do ser vivo. O conhecimento do genoma de um organismo possibilita uma vasta gama de informações, que pode auxiliar no entendimento de como ocorrem os processos celulares e moleculares da espécie. VOCÊ SABIA? 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 4/29 #PraCegoVer: imagem representando o Dogma Central da Biologia Molecular e seus processos, em que o DNA é responsável pela informação repassada ao RNA, pelo processo da transcrição, que, por sua vez, passa a informação à proteína por meio da tradução. O processo da síntese de nova molécula de DNA é a replicação. A proposta de Crick era baseada nos diversos estudos anteriores, tanto da sua equipe quanto de outros pesquisadores. Crick e Watson propuseram, pouco após a revelação da estrutura do DNA, como ocorria sua replicação, como ocorriam as mutações e como essas alterações poderiam in�uenciar no produto �nal: as proteínas. Em 1958, Crick publicou um novo artigo, propondo o Dogma Central. A partir dessa publicação, �cou estabelecido que o �uxo da informação genética seria do DNA gerando a molécula de RNA por meio do processo denominado transcrição. O RNA, por sua vez, daria origem à proteína, pelo processo da tradução. O DNA seria gerado a partir de uma molécula de DNA prévia, pelo processo de replicação do DNA. De lá para cá, poucos ajustes foram feitos no Dogma Central, não modi�cando sua estrutura principal, mas inserindo- se exceções na maioria causadas pelos vírus. Descobriram-se enzimas, como a transcriptase reversa, que gera uma molécula de DNA a partir de uma molécula de RNA, por exemplo, mas o cerne do dogma permanece como verdadeiro até os dias atuais. A seguir, vamos conhecer como é a estrutura dessas moléculas e como ocorrem seus processos de formação. A proposta da estrutura do DNA por Francis Crick, James Watson e Maurice Wilkins, publicada em 1953, trazia resultados de diversos experimentos de outras equipes de cientistas. Na proposta de Watson e Crick, aceita até os dias atuais, a molécula de DNA é estruturalmente de�nida como sendo uma molécula helicoidal bi�lamentar, com �tas antiparalelas. A molécula é constituída de nucleotídeos que são, por sua vez, formados por uma base nitrogenada, um açúcar (uma desoxirribose) e um grupamento fosfato. 1.1.1 Estrutura e replicação do DNA 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 5/29 Figura 2 - Representação gráfica da molécula do DNA com seus componentes moleculares Fonte: Designua, Shutterstock, 2020. #PraCegoVer: estrutura do DNA. À direita, temos a representação da molécula de DNA: uma molécula helicoidal de �ta dupla, antiparalela. À esquerda, o detalhamento da estrutura das �tas: um grupamento fosfato (azul); uma pentose, que é o açúcar (rosa); e uma base nitrogenada (laranja). A união entre as duas �tas se dá por pontes de hidrogênio. Os nucleotídeos do DNA são chamados de desoxinucleotídeos e seguem a mesma constituição base estabelecida anteriormente. A ligação da pentose (lembre-se de que é uma desoxirribose) ocorre pelo carbono 1’ (leia-se carbono um linha) na base nitrogenada e o grupamento fosfato ao carbono 5’ (leia-se carbono cinco linha). As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: Bases púricas Bases pirimídicas 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 6/29 Observamos, entretanto, estruturas formadas pela união de uma pentose com uma base nitrogenada, e a essa molécula formada denominamos nucleosídeo. Se for inserido um grupo fosfato ao carbono 5’ da pentose, a estrutura passa a ser chamada de nucleotídeo. A quantidade de fosfatos ligados à base nitrogenada − monofosfato, difosfato ou trifosfato − permite que essas moléculas assumam diferentes e fundamentais funções celulares. Um exemplo que vale a pena destacar é a molécula de ATP, conhecida como a mais importante molécula energética da célula. Sua denominação por escrito já entrega a sua composição: adenosina trifosfato. Continuando a descrição da molécula de DNA, Erwin Chargaff e colaboradoresrealizaram análises da composição química da molécula e constataram dados curiosos, conforme relatado em GRIFFITHS et al. (2013). Con�ra! A concentração de timina era sempre igual à de adenina em uma mesma molécula (T=A), assim como a de citocina e guanina (C=G). A concentração total de pirimidinas (T+C) era sempre igual a de purinas (A+G) em uma mesma molécula (portanto, temos a equação T+C=A+G). Rosalind Franklin era uma cientista britânica, segunda de cinco �lhos de uma importante família judaica. Formou-se em Ciências da Natureza pelo Newnham College, faculdade restrita às mulheres da Universidade de Cambridge. Seu Ph.D. foi obtido com uma pesquisa sobre o carvão, importante substância para a indústria britânica na época da Segunda Guerra Mundial. A partir dessa pesquisa, Rosalind passou a estudar outras substâncias, entre elas o DNA e RNA. De fato, as pesquisas de Franklin foram fundamentais para a descoberta da molécula do DNA, mas, infelizmente, a pesquisadora não pôde receber o prêmio Nobel, em 1962, pela sua contribuição, pois faleceu prematuramente, em 1958, e o prêmio somente é entregue a pesquisadores vivos. VOCÊ O CONHECE? 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 7/29 A partir das observações de Chargaff e colaboradores, foi possível deduzir que as duas �tas que formam a molécula de DNA, ligadas a partir de pontes de hidrogênio, seguem a seguinte regra: timina pareia com adenina ligando por duas pontes de hidrogênio; e citocina pareia com guanina ligando-se por três pontes de hidrogênio. Para quem lembra, as pontes de hidrogênio são ligações químicas que, analisadas isoladamente, são fracas. Porém, como o DNA é uma molécula muito grande, possui, então, inúmeras pontes de hidrogênio, transformando o conjunto dessas ligações fortes o su�ciente para estabilizar a molécula. Na mesma �ta de DNA, as bases nitrogenadas são ligadas por meio de uma ligação química do tipo fosfodiéster. A molécula de DNA, então, apresenta-se na forma helicoidal, com mais pontes de hidrogênio fazendo a sua estabilização, estabelecendo os chamados giros menores e os giros maiores. Essa estrutura da molécula do DNA já proporcionou importantes pistas de como seria executada a replicação dessa molécula. O pareamento de bases especí�co é um mecanismo de cópia �dedigna, como veremos a seguir. Os primeiros estudos e conhecimentos adquiridos sobre a replicação do DNA foram obtidos graças a experimentos com bactérias, em especial a Escherichia coli. Isso porque esse microrganismo tem um tempo relativamente curto entre uma duplicação celular e outra: cerca de 20 minutos. Além se tratar de uma célula procariota, menos complexa do que uma célula humana, eucariota, por exemplo. Deve-se ainda ressaltar outro ponto: nos eucariotos, a replicação do DNA ocorre em uma fase especí�ca do ciclo celular. O ciclo celular, por sua vez, pode ser de�nido como uma sucessão de fases que regem a vida de uma célula Em 2014, foi publicado no Brasil, pela editora Zahar, o livro de James D. Watson, A dupla hélice: como descobri a estrutura do DNA. Nesse livro, Watson conta a sua versão sobre a descoberta que modi�cou o mundo e permitiu que, poucos anos mais tarde, essa molécula �zesse parte do conhecimento geral de toda a população. Vale a pena conferir! VOCÊ QUER LER? 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 8/29 eucariótica, sendo cada fase designada para ocorrência de um conjunto de eventos especí�cos. O ciclo celular é, então, constituído de uma interfase e da fase de divisão celular propriamente dita (M, de mitose). A interfase é subdividida em G1, S, G2. A replicação do DNA ocorre dentro da fase S, que ganha essa sigla devido a ser a fase de síntese de DNA. Não se esqueça de que síntese signi�ca produção de algo novo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). Como ressaltado anteriormente, o DNA é constituído de duas �tas, antiparalelas, cujas bases se pareiam especi�camente seguindo a regra: adenina pareia com timina, e citocina pareia com guanina. Com suas estruturas inalteradas, não há pareamento fora dessa regra. O descobrimento dessa informação deu aos pesquisadores uma importante pista de como ocorreria o processo de replicação da molécula de DNA: usando uma �ta molde. Após vários experimentos, o modelo atualmente aceito é de uma replicação semiconservativa para a criação de novas moléculas de DNA. Esse modelo consiste em abrir a molécula de DNA, expondo as duas �tas que compõem a molécula, e utilizando-as como moléculas moldes para as �tas novas. Dessa forma, utilizando a regra de Chargaff, de pareamento de bases, é possível realizar a formação de moléculas precisamente iguais à molécula-mãe (ALBERTS, 2009). Figura 3 - Representação do modelo de replicação semiconservativo do DNA Fonte: Soleil Nordic, Shutterstock, 2020. #PraCegoVer: modelo de replicação semiconservativo de DNA, com apresentação de cinco etapas demonstrando que, ao �nal, são formadas duas moléculas de DNA, idênticas à original, mas que apresentam, cada uma, uma �ta parental e uma �ta recém-criada. Na �gura, as �tas em azul representam as �tas parentais que compõem a molécula de DNA original. Após a abertura do DNA, 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&c… 9/29 expondo as �tas como moldes, são construídas novas �tas complementares (�tas laranjas) tendo como molde as �tas azuis. Ao �nal, teremos duas novas moléculas, cada uma com uma �ta nova (laranja) e uma �ta parental (azul). Contudo, para que ocorra a replicação do DNA de forma altamente �dedigna, é preciso a utilização de uma enzima que será a responsável por executar a inserção dos nucleotídeos de acordo com a leitura da �ta molde. Essa enzima é a DNA polimerase. São conhecidas em Escherichia coli cerca de cinco enzimas conhecidas. A primeira identi�cada, a DNA polimerase I, possui as seguintes atividades: Essa enzima trabalha em um local chamado “forquilha de replicação”, uma estrutura em forma de Y na qual o DNA está aberto e há a atuação de inúmeras enzimas acessórias à DNA polimerase. Ativi dad e de poli mer ase 1 Ativi dad e de exo nucl eas e 3’ ---> 5’ 2 Ativi dad e de exo nucl eas e 5’ ---> 3’ 3 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 10/29 Figura 4 - Representação de uma forquilha de replicação, com demonstração da fita líder e da fita com os fragmentos de Okazaki Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 243. #PraCegoVer: estrutura de uma forquilha de replicação de DNA. À esquerda, uma forquilha de replicação com DNA recém-sintetizado em vermelho; as setas indicam a direção 5’-3’ da síntese do DNA. Como as duas �tas-�lhas de DNA são polimerizadas na direção 5’-3’, o DNA sintetizado na �ta retardada deve ser feito inicialmente em uma série de pequenos segmentos de DNA, os fragmentos de Okazaki, chamados assim por causa do cientista que os descobriu. À direita, a mesma forquilha pouco tempo depois. Na �ta retardada, os fragmentos de Okazaki são sintetizados em sequência, sendo os mais próximos à forquilha os fragmentos de síntese mais recente. Entretanto, a DNA polimerase somente consegue inserir novos nucleotídeos na extremidade 5’, para que ocorra a reação fosfodiéster. Devido a isso, observa-se que há, dessa forma, uma �ta chamada líder, pois já está posicionada adequadamente para o crescimento da nova cadeia, e uma �ta cujo crescimento será mais lento, por meio Fragmentos de Okasaki. É essencial ressaltar que a taxa de erros da DNA polimerase é extremamente baixa, cerca de 1 erro a cada 105 nucleotídeos inseridos e, ainda assim, esses erros sãoidenti�cados e consertados ainda pela própria enzima antes de �nalizar a replicação do DNA. 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 11/29 Figura 5 - Representação do processo de replicação do DNA pela DNA-polimerase Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 243. #PraCegoVer: Na �gura, a DNA-polimerase catalisa a adição sequencial de um desoxirribonucleotídeo à extremidade 3’-OH de uma cadeia polinucleotídica, a �ta iniciadora crescente que está pareada a uma �ta-molde já existente. A �ta de DNA recém-sintetizada é, então, polimerizada na direção 5’-3’. Como cada desoxirribonucleosídeo trifosfato deve formar par com a �ta-molde para ser reconhecido pela DNA-polimerase, essa �ta determina qual dos quatro desoxirribonucleotídeos possíveis (A, C, G ou T) será adicionado. A reação é promovida por uma grande alteração favorável da energia livre causada pela liberação do pirofosfato e sua subsequente hidrólise em duas moléculas de fosfato inorgânico. Logo após, é mostrada a estrutura da DNA-polimerase complexada ao DNA (em laranja), determinada por cristalogra�a de raios X. A �ta-molde de DNA é a �ta longa, e a �ta recém-sintetizada é a curta. Depois, temos um diagrama esquemático da DNA-polimerase. A geometria adequada do pareamento de bases dada pelo desoxirribonucleosídeo trifosfato a ser incorporado provoca um ajuste da polimerase em torno do par de base, iniciando a reação de adição do nucleotídeo. A dissociação do pirofosfato relaxa a polimerase, permitindo a translocação do DNA em um nucleotídeo. A DNA polimerase, apesar de ser a mais importante enzima do processo de replicação do DNA, não atua sozinha nesse processo. Observe, a seguir, algumas das demais enzimas e moléculas que atuam na replicação com suas respectivas funções (GRIFFITHS et al., 2013): Enzima responsável por fornecer um primer ou iniciador para a DNA polimerase, pois esta última não é capaz de iniciar uma molécula de DNA DNA 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 12/29 sem um suporte inicial. Esse primer fornecido pela DNA primase é composto de poucos nucleotídeos; cerca de 10 nucleotídeos de RNA que são posteriormente retirados. Enzima responsável pela abertura da molécula de DNA. Imagine-a como se fosse a cabeça de um zíper abrindo-o. Essa é a função da DNA helicase. Enzima responsável por desenrolar a molécula de DNA, não permitindo a formação de nós à frente da forquilha de replicação. primas e DNA helica se DNA topois omera se 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 13/29 Figura 6 - Forquilha de replicação e algumas das diversas enzimas que auxiliam no processo de replicação Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 249. Pequenas proteínas que se ligam às �tas simples de DNA na forquilha de replicação, de forma cooperativa, e que impedem o DNA de se ligar novamente como �ta dupla. Proteín as ligador as de fita simple s de DNA (SSB, de single strand DNA- bindin g) 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 14/29 #PraCegoVer: Diagrama mostrando uma visão atual da disposição das proteínas de replicação em uma forquilha de replicação durante a síntese de DNA. A �ta retardada está dobrada para aproximar-se da molécula de DNA-polimerase da �ta retardada e formar um complexo com a DNA-polimerase da �ta-líder. Esse enovelamento também aproxima a extremidade 3’ de cada fragmento de Okazaki completado do ponto de início do próximo fragmento de Okazaki. Como a DNA-polimerase da �ta retardada permanece ligada ao resto das proteínas de replicação, ela pode ser reutilizada na síntese dos sucessivos fragmentos de Okazaki. Nesse diagrama, ela está quase liberando o fragmento de DNA completo e move-se para o iniciador de RNA que está sendo sintetizado. As proteínas adicionais (não mostradas) que auxiliam na manutenção dos diferentes componentes proteicos na forquilha permitem que o complexo funcione como uma maquinaria proteica coordenada. Como podemos observar, o processo de replicação do DNA não é um processo simples. Os conhecimentos que temos desse processo foram adquiridos graças às observações iniciais em procariotos, células mais simples que os eucariotos e com tempo de vida mais curto, o que possibilitou um rápido avanço no conhecimento. Com o avançar das tecnologias e das técnicas de análises, foi possível realizar experimentos observacionais em células eucarióticas e constatou-se que, salvo algumas particularidades próprias dessas células, a replicação ocorre de maneira similar nas células mais complexas. O RNA (ácido ribonucleico) é uma molécula de estrutura similar ao DNA, sendo também considerado um ácido nucleico. Entretanto, devemos destacar algumas particularidades: o tamanho do RNA é muito inferior ao do DNA; é uma molécula de �ta simples; seu açúcar é a ribose e é constituído de ribonucleotídeos, sendo a uracila a base exclusiva do RNA (assumindo o lugar da timina, que é exclusiva do DNA) A molécula de RNA é obtida pelo processo de transcrição. 1.2 Estrutura e transcrição do RNA 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 15/29 Figura 7 - Imagem representativa das diferenças das bases nitrogenadas do RNA e do DNA, além de ter uma representação da molécula de RNA Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 225. #PraCegoVer: A estrutura química do RNA se diferencia ligeiramente da estrutura do DNA. O RNA contém o açúcar ribose, o qual difere da desoxirribose, o açúcar utilizado no DNA, pela presença de um grupo -OH adicional. O RNA contém a base uracila, a qual difere da timina, a base equivalente no DNA, pela ausência de um grupo -CH3. A �gura mostra um pequeno segmento de RNA. A ligação química entre os nucleotídeos no RNA – uma ligação fosfodiéster − é a mesma da no DNA. Um fato curioso é que as células produzem vários tipos de RNA. Podemos destacar cinco tipos de RNAs produzidos pela célula: RNA que tem a propriedade de codi�car proteínas. É a classe de RNA que cumpre o que é falado no Dogma Central da Biologia Molecular. RNA mensa geiro (mRNA ) 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 16/29 RNAs que irão compor a estrutura dos ribossomos que, por sua vez, são responsáveis por catalisar a síntese de proteínas. Importantes nos processos de regulação da expressão gênica. Moléculas de RNA que transportam os aminoácidos até os ribossomos para que seja sintetizada uma cadeia polipeptídica que se transformará em uma proteína. Possuem diversas funções dentro dos processos celulares que ainda estão sendo descobertos. Seus tamanhos variam e muitos ainda não têm elucidadas suas funções na célula. RNAs riboss ômico s (rRNA) MicroR NAs (miRN As) RNAs transp ortado res (tRNAs ) Outros RNAs não codific adores 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 17/29 Quando falamos em Dogma Central da Biologia Molecular e seus processos, a produção de RNA se dá pelo processo de transcrição. Tal processo é o mesmo para todos os tipos de RNA, porém para o RNA mensageiro é somente feito em sequências especí�cas denominadas genes. Figura 8 - Representação da transcrição do RNA a partir de genes contidos no DNA Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017,p. 224. #PraCegoVer: Uma célula pode expressar diferentes genes em diferentes taxas. Essa expressão de genes segue o Dogma Central da Biologia Molecular. Na imagem, são demonstrados dois genes – Gene A e Gene B – alocados na molécula do DNA. À esquerda, é mostrado que do gene A são produzidas cinco moléculas de RNA, mesmo só havendo uma cópia do gene, e na tradução são produzidas vinte e cinco moléculas de proteínas, todas seguindo a informação contida no gene A. À direta, está representada a transcrição do gene B, resultando em somente uma molécula de RNA transcrita e, a partir dela, três proteínas traduzidas. Isso demonstra que a célula pode controlar a quantidade de produtos gênicos produzidos de cada gene contido no DNA de acordo com a necessidade da célula, mesmo que somente haja uma cópia física do gene. Esse processo de transcrição é bem mais simples do que o processo de replicação do DNA descrito anteriormente. O processo de transcrição é dividido em três fases, pois é um processo cíclico de síntese de RNA. Cada ciclo de 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 18/29 transcrição ocorre várias vezes na mesma região do DNA, o gene, e, antes que um complexo atinja a região de terminação, outros complexos de transcrição estão iniciando a síntese de RNA (ZAHA et al., 2014). Na primeira fase, fase inicial, as sequências especí�cas do DNA, conhecidas como promotores, sinalizam o local de formação do complexo de transcrição e com isso inicializam a cópia das sequências do DNA em RNA. Na segunda fase, fase de alongamento da cadeia, a molécula de RNA é sintetizada propriamente dita. Ocorre a inserção dos ribonucleotídeos pela RNA polimerase. A terceira fase, fase de terminação da transcrição, é o processo em que a síntese de RNA é terminada em resposta a sinais especí�cos de terminação da transcrição, conhecidos como terminadores. Apesar de normalmente ser mostrado um complexo de transcrição em um determinado gene, a transcrição é dinâmica e várias cópias de um determinado RNA são sintetizadas a partir do gene, concomitantemente. Os componentes do complexo de transcrição são dissociados, ao �nal da transcrição, e reiniciam um novo ciclo de transcrição (ZAHA et al., 2014). Assim como na replicação do DNA, há uma enzima responsável pelo processo de transcrição: a RNA polimerase. Tal qual sua irmã, a DNA polimerase, essa enzima somente é capaz de inserir novos nucleotídeos no sentido 5’ ---> 3’. Contudo, há uma relevante diferença: a RNA polimerase não necessita de um iniciador, sendo capaz de iniciar a �ta de novo, isto é, iniciar a nova �ta do zero. Ainda assim, enzimas como a helicase e a topoisomerase são necessárias para auxiliar na abertura da cadeia de DNA e expor as sequências que precisam ser transcritas. Em organismos procarióticos, há somente um tipo de RNA polimerase para a produção de todos os tipos de RNAs necessários para o funcionamento celular. Já em eucariotos, são conhecidos ao menos três tipos de enzimas, responsáveis pela síntese de diferentes tipos de RNAs. Para o reconhecimento das sequências que precisam ser transcritas, a RNA polimerase precisa reconhecer regiões como os promotores de genes, que indicam que um gene está ali próximo. Há, ainda, outras sequências de reconhecimento e de controle da transcrição de promotores e proteínas, conhecidas como fatores de transcrição, que auxiliam no processo de reconhecimento das regiões que precisam ser transcritas. A célula possui um intrincado processo de controle da expressão gênica, designando, com precisão, quais genes necessitam ser transcritos em qual momento e por quanto tempo, controlando, assim, o número de cópias de RNAs enviadas ao citoplasma, que, consequentemente, podem ser traduzidas em proteínas. Tudo depende da necessidade naquele momento da célula e também de sinalizações externas recebidas. 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 19/29 No entanto, a simples cópia do molde de DNA, convertida em uma molécula de RNA, baseada no pareamento de bases (adenina pareando com uracila, e guanina pareando com citocina) não gera, em eucariotos, um RNA funcional. Após o processo de transcrição, é necessário que seja realizado o processamento do RNA. São três os processos realizados na molécula do transcrito primário: Aproveite e aprofunde seus conhecimentos! Adição de uma capa na extremidade 5’, que consiste em uma guanina atípica com um radical metil anexado a ela. Poliadenilação da extremidade 3’, que nada mais é do que a síntese de uma cauda com uma série de repetições de adeninas, chamada cauda poli-A. Excisão de íntrons em um processo chamado splicing. 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 20/29 Somente após essas modi�cações do RNA é que ele é reconhecido como um RNA maduro e pode, en�m, ser transportado para o citoplasma. Chegando ao citoplasma, caso se trate de um mRNA, imediatamente ele será traduzido pelos ribossomos para a formação das proteínas. Quando o mRNA chega ao citoplasma, ele será imediatamente “atacado” por ribossomos para que seja realizada a tradução da informação genética em uma proteína. A informação genética que antes estava sendo repassada de 1:1 agora passa a ser repassada de 3:1. Isso porque, quando é feita a tradução, a leitura dos nucleotídeos do mRNA não é feita de um a um, mas sim de três em três, as chamadas trincas. Em linhas gerais, o repasse de informação do DNA para o RNA é simples, uma vez que são moléculas química e estruturalmente simples. Muito acertadamente, o nome do processo de conversão da informação contida no mRNA para uma proteína chama-se tradução, pois está sendo convertida para “outra linguagem” molecular. As proteínas são feitas de uma sequência de aminoácidos, e não de nucleotídeos. 1.3 Tradução, código genético e estrutura de proteínas Os genes eucarióticos são compostos de sequências denominadas íntrons (do inglês, intervening sequences) e éxons (do inglês, expressed sequences). Os primeiros não são sintetizados em proteínas, sendo retirados pelo processo de splicing. O fato de os genes eucarióticos serem “interrompidos” permite que sejam feitos rearranjos pós- transcricionais e a modi�cação da sequência que será traduzida, possibilitando a formação de proteínas diferentes a partir de um único transcrito primário, de acordo como os éxons serão rearrumados na retirada dos íntrons. VOCÊ SABIA? 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 21/29 O mRNA é lido de acordo com uma sequência de trincas, que são agrupamentos de 3 em 3 nucleotídeos. Os ribossomos funcionam como verdadeiras enzimas que catalisam esse processo traducional. Os tRNAs são os responsáveis por fornecerem os aminoácidos para a montagem da molécula de proteína. Toda a leitura é feita obedecendo-se ao chamado código genético. O código genético foi desvendado em 1961 e designa quais trincas designam cada um dos aminoácidos. Entretanto, há uma di�culdade que precisa ser superada: o RNA possui quatro diferentes nucleotídeos, que podem gerar 64 combinações diferentes de trincas e somente há 20 aminoácidos diferentes encontrados formando proteínas. As pesquisas demonstram que o código genético é redundante, isto é, o mesmo aminoácido pode ser designado por trincas diferentes. Vale ressaltar que essas trincas, quando no mRNA, são chamadas de códon, e a trinca complementar, presente no tRNA, é chamada de anticódon. É considerado universal, pois quase todos os organismos da atualidade cumprem as suas regras. Outra curiosidade é que ele possui “sinais de pontuação”: códonsde iniciação de leitura e códons de parada. Figura 9 - Tabela do código genético baseada em sequências de códons Fonte: Griffiths (2013, p. 276). #PraCegoVer: Tabela do código genético para a leitura das trincas e designar os respectivos aminoácidos a serem inseridos na sequencia formadora da proteína. Na coluna mais a esquerda, está a primeira letra da trinca do códon (U, C, A, G). Na linha mais superior, a segunda letra do códon (U, C, A, G). na coluna mais a 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 22/29 esquerda, a terceira letra do códon (U, C, A, G). Ao centro, cada célula é formada pela união das três letras do códon, lido na sequencia descrita, formando 64 combinações possíveis que irão designar os 20 aminoácidos existentes na natureza. A leitura do mRNA inicia-se quando o ribossomo encontra o chamado códon inicial AUG. A partir desse códon, os nucleotídeos serão lidos de 3 em 3, sem “pular” nenhum, até que se encontre um dos 3 códons de �nalização (UAA, UAG e UGA). Os ribossomos leem os códons e selecionam o tRNA que possui uma sequência de trinca que seja complementar, chamada de anticódon. Encontrando o tRNA complementar este, carregado com o aminoácido, passa-o para que seja inserido na sequência de aminoácidos que está sendo formada pelos ribossomos, com união por ligações peptídicas. Figura 10 - Esquema em três etapas demonstrando como ocorre o reconhecimento dos códons para designação correta do aminoácido Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 243. #PraCegoVer: o código genético é traduzido pela atuação conjunta de dois adaptadores: aminoacil-tRNA, sintetases e tRNAs. Cada sintetase acopla um aminoácido especí�co a seus tRNAs correspondentes, em um processo chamado carregamento. O anticódon da molécula de tRNA carregada forma pares de bases com o códon apropriado no mRNA. Um erro, seja na etapa de carregamento, seja na etapa de ligação do tRNA carregado ao seu códon, fará com que o aminoácido errado seja incorporado a uma cadeia de proteína. Na sequência de eventos ilustrada, o aminoácido triptofano (Trp) é selecionado pelo códon UGG no mRNA. 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 23/29 Tal qual acontece com os RNAs, a produção de proteínas ocorre várias de uma única vez, proporcionando a produção de centenas de moléculas a partir de um único mRNA que chega ao citoplasma. Há a possibilidade de fazer controle ainda nessa fase, de acordo com a necessidade da célula. Terminado o processo de tradução, a sequência de aminoácidos formada passa por transformações conformacionais para que possa assumir a forma funcional e desempenhar suas funções na célula. O entendimento e o conhecimento acerca dos processos moleculares descritos anteriormente permitiram que fossem desenvolvidas técnicas in vitro que pudessem reproduzi-los em laboratório e possibilitassem a observação do processo quanto ao uso em análises moleculares. Entretanto, apesar de baseados nos processos que ocorrem nas células, ainda ocorrem limitações na reprodução em laboratório por não contar com diversas outras questões bioquímicas e moleculares que a célula possui. Em 1983, Francis Mullis revolucionou a pesquisa em biologia molecular ao desenvolver a PCR (reação em cadeia da polimerase, do inglês, Polymerase Chain Reaction). Essa técnica lhe rendeu um prêmio Nobel em 1993 e, ainda hoje, pode ser considerada a principal técnica de biologia molecular usada em laboratório. Tal técnica permite, em linhas gerais, a replicação de fragmentos especí�cos do DNA em centenas de milhares de cópias, em uma questão de poucas horas. A técnica de PCR consiste em submeter uma mistura de nucleotídeos, sequência de DNA alvo e iniciadores (primer), misturados a uma solução tampão com adição de Taq polimerase (a enzima DNA polimerase usada in vitro), a uma variação de temperatura sequencial em ciclos. Os ciclos podem se repetir de 20 a 40 vezes. A técnica base utiliza DNA como sequência-alvo a ser multiplicada. Em teoria, pode-se ampli�car uma única sequência de DNA em centenas de milhares de cópias em poucas horas. A evolução tecnológica possibilitou o surgimento de máquinas de PCR cada vez mais precisas com a variação de temperatura dos ciclos e mais ágeis na troca de temperatura, acelerando o processo. 1.4 Técnicas de detecção de ácidos nucleicos e suas aplicações 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 24/29 A PCR pode ainda ser associada a outras técnicas, como a digestão enzimática por endonucleases. Essas enzimas clivam o DNA em pontos de sequências reconhecidas com precisão. Desse modo, se aquele fragmento de DNA possuir a sequência-alvo da endonuclease, ele será clivado, gerando dois fragmentos de tamanhos possivelmente variados. Se não houver a sequência, não haverá o corte e o fragmento permanecerá íntegro. A visualização do resultado se dá por meio de análises de bandas em géis de agarose na maioria das vezes. Essa simples combinação de técnica possibilitou um leque de análises e exames, incluindo até mesmo o sequenciamento do genoma humano. Com o avançar dos anos, foram surgindo outras possibilidades para a PCR, com aperfeiçoamento da técnica e surgimento de outras derivadas dela. A técnica da PCR em tempo real (RT-PCR) permitiu a análise da ampli�cação do DNA (e mais tarde do RNA) à medida que iria ocorrendo. Essa simples mudança da técnica – de se analisar se está ocorrendo a ampli�cação durante o processo, e não somente ao �nal, como na PCR tradicional – permite resultados mais rápidos e precisos, se há a sequência-alvo no pool de amostra analisado, além de outras importantes análises. As análises de doenças infecciosas se bene�ciaram dessa técnica, pois proporcionam uma rápida identi�cação entre as amostras dos pacientes, diminuindo o tempo de janela imunológica. Entretanto, o campo de técnicas moleculares expandiu-se muito desde a descoberta de Mullis. Há cerca de cinco anos, o meio acadêmico cientí�co foi novamente surpreendido com uma nova e revolucionária técnica: CRISPR. Jennifer Doudna e sua colaboradora, Emmanuelle Charpentier, estabeleceram a técnica de edição de, virtualmente, qualquer DNA. A técnica ainda não é totalmente dominada, mas os seus usos e suas aplicações são gigantescos: pode-se desde consertar genes defeituosos em doenças a até mesmo adquirir novos fenótipos a partir de alterações do genoma. 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 25/29 Os genes localizados nos cromossomos controlam as características hereditárias transmitidas pelos gametas feminino e masculino com a �nalidade de manter contínua a genética das gerações. A comprovação da identi�cação de uma determinada pessoa, ou seja, pelo DNA de seus �lhos (prole), conhecida popularmente como teste de paternidade, é uma técnica que utiliza sondas capazes de detectar as sequências de DNA humano, as quais são idênticas aos de seus ascendentes, no caso os pais. Lembre-se de que uma pessoa é formada a partir da união de dois gametas: um espermatozoide e um óvulo. Em cada um deles, há um conjunto de cromossomos que trazem genes. Portanto, uma pessoa é formada a partir de dois conjuntos de cromossomos, cada um herdado de um dos pais. A variabilidade encontrada na espécie humana é fornecida pelo crossing-over que ocorre na formação de cada um dos gametas, antes da ocorrência da fecundação. Entretanto, mesmo após o crossing-over, ainda há a permanência de similaridades do cromossomo que podem ser rastreadas, pois apresentam um padrão especí�co de bandeamento. Essas bandas se devem a sequências repetidas quemantêm o padrão conforme de qual progenitor é herdado. A técnica de análise desse padrão de bandas é chamado de VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), que busca comparar exatamente essas sequências curtas repetidas ao longo das moléculas de DNA que compõem cada um dos cromossomos e comparar com as sequências dos pais (DOMINGOS, 2017). Outra técnica de análise de ácidos nucleicos é a eletroforese em gel de agarose. Essa técnica permite a visualização de bandas luminosas. A técnica utiliza um gel de agarose, que formará uma teia por onde o DNA (ou fragmentos provenientes de ampli�cação por PCR) irá passar quando submetido a um Neste TED Talk, a cocriadora da técnica CRISPR -Cas9, Jennifer Doudna explica, de forma clara, sucinta e elucidativa, como essa técnica pode revolucionar o tratamento de doenças genéticas antes tidas como incuráveis. Con�ra acessando o link https://www.youtube.com/watch? v=TdBAHexVYzc (https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc) e não se esqueça de ativar a legenda! VOCÊ QUER VER? https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 26/29 campo elétrico. A molécula de DNA possui uma carga negativa; logo, é atraída para o polo positivo do campo. Como o gel oferece uma resistência à passagem das moléculas, aquelas que forem menores, irão se movimentar mais rapidamente, e as maiores irão se movimentar mais lentamente. Essas moléculas, então, irão se agrupar em bandas, que poderão ser visualizadas com a impregnação de substâncias �uorescentes, que emitem uma marcação luminosa quando submetidas à luz UV (DOMINGOS, 2017). A técnica de �ngerprint ou impressão digital genética, com con�abilidade de 99,9%, baseia-se na análise de sequências do DNA que formam um padrão único para cada pessoa. Essa técnica pode ser utilizada para atestar se um material biológico, que contenha material genético, pertence ou não a uma determinada pessoa (ZAHA et al., 2014). Outras técnicas foram e estão sendo desenvolvidas e aperfeiçoadas. O sequenciamento de DNA, no qual conseguimos conhecer a sequência exata dos nucleotídeos do DNA, teve avanços signi�cativos nos últimos anos. A técnica, que antes era bem demorada para se executar, hoje, diante das novas técnicas, propicia o conhecimento do sequenciamento do DNA em pelo menos metade do tempo. As análises de RNA também ganharam destaque, pois permitem observar se há o �uxo da informação genética pelo Dogma da Biologia Molecular. Das técnicas, a PCR em tempo real (RT-PCR) possibilita a análise da ampli�cação do RNA, por técnica que se baseia na PCR, mas as análises são feitas em tempo real, podendo ser registrado quantas moléculas são ampli�cadas por minuto. A bioinformática tem despontado como uma ciência essencial para as análises em biologia molecular. Com o avanço das técnicas de análises do DNA, criou-se uma avalanche de informações a serem pesquisadas, produtos das técnicas de análises. Portanto, a união das áreas de matemática, informática, estatística e biologia permite que haja maior robustez e detalhamento nas análises, além de rapidez. (ATIVIDADE NÃO PONTUADA) TESTE SEUS CONHECIMENTOS 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 27/29 Com a associação com a bioinformática, a chamada era da genômica (em que se focou nas análises da sequência de DNA e suas interações) acelerou-se e hoje possui robustas ferramentas on-line de análises rotineiras, como o site BLAST, o qual permite a comparação de sequências de DNA com um banco de sequências mundial de DNA e, por meio de um algoritmo, possibilita ter uma grande quantidade de informações acerca daquela sequência (ZAHA et al., 2014). A genética e a genômica modernas enfrentam o desa�o de aplicar esses novos recursos ao estudo da dinâmica da atuação dos genes e genomas para realizar a melhor compreensão de sua biologia. Chegamos ao �nal desta unidade e, até aqui, você aprendeu os processos moleculares básicos relacionados ao DNA, como sua estrutura, localização, replicação e transcrição; o RNA, seu processamento e sua tradução; a síntese de proteínas; assim como o código genético e as principais técnicas utilizadas para detecção do DNA, do RNA e das proteínas. Nesta unidade, você teve a oportunidade de: CONCLUSÃO estudar os aspectos dos genes, os elementos estruturais da molécula de DNA; identi�car as bases nitrogenadas; compreender que a informação genética é descrita em código, no qual o DNA é encontrado estruturado em cromossomos, que são os veículos da hereditariedade; entender a replicação do DNA; identi�car o processo de transcrição a partir de trechos de DNA; compreender a tradução do mRNA, o rRNA e o tRNA, que, por sua vez, está associado à subunidade do ribossomo; entender o início da síntese de proteínas; 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 28/29 Compreender o código genético; identi�car a reação em cadeia da polimerase – PCR ( Polymerase Chain Reaction), que permite o isolamento de qualquer segmento de DNA; conhecer as técnicas mais utilizadas para a detecção do DNA e do RNA. Clique para baixar conteúdo deste tema. ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. ALBERTS, B. et al. Fundamentos da biologia celular. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. DOMINGOS, P. P. Genética. Londrina: Editora e Distribuidora Educacional S.A., 2017. GRIFFITHS, A. J. F. et al. Introdução à genética. 10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2012. WATSON, J. D. A dupla hélice: como descobri a estrutura do DNA. Rio de Janeiro: Zahar, 2014. Referências 25/02/2022 16:57 Processos moleculares e genéticos https://student.ulife.com.br/ContentPlayer/Index?lc=orrCVHv%2fIn1ewFDSN78oXA%3d%3d&l=pG%2fN3Y483YM899nM4U%2f2YA%3d%3d&… 29/29 WATSON, J. D. et al. Biologia molecular do gene. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. Biologia molecular básica. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.
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