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Roteiros Bioquímica Estrutural Manual de Estágio REGRAS BÁSICAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO 1. Durante a aula prática, mantenha sempre atenção ao roteiro, tendo-o sempre próximo a você. Pode ser efetuada marcação com caneta sob cada item realizado do experimento de forma a não se perder durante a execução. 2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e mesmo antes das explicações do professor. 3. Observe a localização do material e dos equipamentos de emergência (chuveiro, lava-olhos etc.). 4. Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer seu conteúdo pelo rótulo. 5. Não pipete líquidos diretamente com a boca, use pipetas adequadas. 6. Não tente identificar um produto químico pelo odor e nem pelo sabor. 7. Não deixe de utilizar os equipamentos de proteção. 8. Não adicione água aos ácidos, mas sim os ácidos à água. 9. Não trabalhe com sandálias, chinelos ou sapatos abertos e de salto no laboratório. 10. Sempre identifique o conteúdo presente nos frascos ou nos tubos utilizados no experimento com caneta para vidros. Isso facilita seu descarte adequado por parte dos responsáveis pelo laboratório. 11. Mantenha os solventes em recipientes adequados e devidamente tampados, bem como materiais inflamáveis longe de fontes de calor (bico de Bunsen). 12. Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores. 13. Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las pela primeira vez no laboratório. Caso tenha dúvidas, consulte o professor ou o técnico a respeito. 14. Se tiver cabelos longos, prenda-os ao realizar qualquer experiência no laboratório; não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios. Serviço Social Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Indicadores de pH AULA 1 ROTEIRO 1 OBJETIVOS Os indicadores de pH são substâncias que têm a propriedade de mudar de cor; essa mudança de cor indica o caráter ácido ou básico da solução. O termo pH é usado universalmente para expressar o grau de acidez ou basicidade de uma solução. A escala de pH é constituída de uma série de números variando de 0 a 14, os quais denotam vários graus de acidez ou alcalinidade. PROCEDIMENTOS 1) Bata 1 folha de repolho roxo com 1 litro de água no liquidificador. 2) Coe esse suco. Se não for usar o extrato de repolho roxo na hora, guarde-o na geladeira, pois ele se decompõe muito rápido. 3) Enumere 11 tubos de ensaio. 4) Coloque o extrato de repolho roxo nos 11 tubos. 5) Acrescente nos copos 2 a 11 as seguintes substâncias, na respectiva ordem: hidróxido de sódio, cloreto de sódio, água sanitária, sabão em pó, leite, detergente, vinagre, bicarbonato de sódio, albumina e água. 6) Observe as cores das soluções. Manual de Estágio Extrato de repolho roxo Cor pH aproximado Ácido clorídrico 0,5M Hidróxido de sódio 0,1M Cloreto de sódio 10% Vinagre Detergente incolor Água sanitária Água sem gás Sabão em pó Leite Bicarbonato de sódio Albumina Observação: se não for possível encontrar repolho roxo na sua região, utilizar o procedimento a seguir. PROCEDIMENTOS 1) Separar 30 tubos de ensaio e identificá-los. 2) Colocar 2 mL da solução a ser testada nos tubos de ensaio e, em seguida, adicionar 3 gotas do indicador de pH nos tubos de ensaio. 3) Utilizar como indicadores de pH a fenolftaleína, o azul de bromotimol e o verde de bromocresol (reativo do kit da albumina). 4) Observar a coloração e comparar a cor obtida com a escala de pH. Anotar na tabela a seguir os resultados. Serviço Social Soluções com fenolftaleína Cor pH aproximado Ácido clorídrico 0,5M Hidróxido de sódio 0,1M Cloreto de sódio 10% Vinagre Detergente incolor Água sanitária Água sem gás Sabão em pó Leite Bicarbonato de sódio Albumina Soluções com azul de bromotimol Cor pH aproximado Ácido clorídrico 0,5M Hidróxido de sódio 0,1M Cloreto de sódio 10% Vinagre Detergente incolor Água com gás Água sem gás Sabão em pó Leite Bicarbonato de sódio Albumina Manual de Estágio Soluções com verde de bromocresol Cor pH aproximado Ácido clorídrico 0,5M Hidróxido de sódio 0,1M Cloreto de sódio 10% Vinagre Detergente incolor Água com gás Água sem gás Sabão em pó Leite Bicarbonato de sódio Albumina MATERIAIS QUANTIDADE Pipeta Pasteur 3 por grupo Tubos de ensaio 30 por grupo Ácido clorídrico 0,5M 20 mL por grupo Hidróxido de sódio 0,1M 10 mL por grupo Cloreto de sódio 10% 10 mL por grupo Vinagre 10 mL por grupo Detergente incolor 10 mL por grupo Água sanitária 10 mL por grupo Água sem gás 10 mL por grupo Sabão em pó 10 mL por grupo Leite 10 mL por grupo Bicarbonato de sódio 10 mL por grupo Albumina 5% 10 mL por grupo Indicadores de pH: fenolftaleína, azul de bromotimol e verde de bromocresol (reativo do kit da albumina) 3 mL por grupo Liquidificador 1 por bancada Repolho roxo 1 unidade Coador 1 por grupo Serviço Social Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Atividades de fixação 1. A partir dos resultados obtidos, fazer uma discussão sobre o caráter ácido/básico das substâncias analisadas e, se possível, discutir se as pessoas com gastrite ou refluxo podem ingerir essas substâncias. 2. Discutir sobre as técnicas de identificação de proteínas (albumina) e a importância clínica. Manual de Estágio Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: pH e solução tampão AULA 1 ROTEIRO 2 OBJETIVOS Manusear e compreender o funcionamento de um pHmetro (medidor de pH). Recordar os fundamentos teóricos sobre pH. Discutir as reações que ocorrem em uma solução tampão (ácida, neutra ou básica) em laboratório. Associar o resultado do experimento com as reações que ocorrem no sangue (acidose e alcalose). PROCEDIMENTOS Calibrar o pHmetro com solução pH = 4,0 (ou pH = 9,0) e pH = 7,0. 1) Medir o pH de, aproximadamente, 20 mL de água colocada em um béquer contendo uma barra magnética (misturador) e colocar 10 gotas (gota a gota) de ácido clorídrico (HCl) 5M, anotando os valores de pH a cada gota. 2) Em outro béquer contendo 20 mL de solução tampão (ácido acético + acetato de sódio), colocar 10 gotas (gota a gota) de ácido clorídrico (HCl) 5M, anotando os valores de pH a cada gota. 3) Fazer o mesmo processo descrito em (1) e (2) com NaOH 5M. 4) Comparar os fenômenos em (1) e (2) nas duas aferições. Serviço Social MATERIAIS QUANTIDADE Pipeta Pasteur 3 por grupo Béquer 2-3 por grupo Solução tampão 20 mL por grupo HCl 5M/ NaOH 5M 5-10 mL por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE pHmetro 2 por bancada Barra magnética e placa agitadora 2 por bancada Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Atividades de fixação 1. Confeccionar um gráfico de titulação de valores aferidos de pH x volume/gota de cada experimento. 2. Discutir a função da solução tampão ácido carbônico/bicarbonato de sódio do sangue e do tampão tris-acetato para fazer experimentos com o DNA do RNA. Manual de Estágio Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Titulação de aminoácidos AULA 2 ROTEIRO 1 OBJETIVOS Relembrar o caráter anfótero dos aminoácidos. Determinar os valores de pH das soluções de aminoácidos (glicina e ácido glutâmico), utilizando a curva de titulação. Manusear um pHmetro (medidor de pH). PROCEDIMENTOS Preparação do experimento 1) Separar quatro béqueres. 2) Identifique dois béqueres como A1 e A2 e adicionar a cada um 20 mL (ou volume que permita a introdução do eletrodo sem que esbarre na barra magnética) de uma solução do aminoácido glicina 0,1M. 3) Identifique dois béqueres como B1 e B2 e adicionar a cada um 20 mL (ou volume que permita a introdução do eletrodo sem que esbarre na barra magnética)de uma solução do aminoácido ácido glutâmico 0,1M. 4) Calibrar o pHmetro com solução pH = 4,0 (ou pH = 9,0) e pH = 7,0. Serviço Social Procedimentos para o béquer A1 1) Mergulhar uma barra magnética na solução A1 e posicionar o béquer sobre a placa agitadora. 2) Submergir o eletrodo limpo e calibrado na solução (cuidado para não bater o bulbo do eletrodo na barra magnética). 3) Sob agitação, titular com NaOH 0,5 N, gota a gota e anotando o pH após adição de cada gota (pode ser realizado com pipeta Pasteur ou bureta). Procedimentos para o béquer A2 1) Mergulhar uma barra magnética na solução A2 e posicionar o béquer sobre a placa agitadora. 2) Submergir o eletrodo limpo e calibrado na solução (cuidado para não bater o bulbo do eletrodo na barra magnética). 3) Sob agitação, titular com HCl 0,5M. Repetir os mesmos procedimentos para os béqueres B1 e B2. MATERIAIS QUANTIDADE béqueres 2 por grupo Pipeta Pasteur 2 por grupo HCl 0,5 M 20 mL por grupo NaOH 0,5N 20 mL por grupo Solução de aminoácido 20 mL por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE pHmetro 2 por bancada Barra magnética e placa agitadora 2 por bancada Manual de Estágio Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Atividades de fixação 1. Construir o gráfico de pH da solução versus volume de NaOH/HCl adicionado (em gotas). 2. Verificar a presença de patamar indicando efeito tamponante. Discutir o caráter tampão da albumina sanguínea. Serviço Social Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Detecção de aminoácidos e proteínas em solução por meio de reações de coloração AULA 2 ROTEIRO 2 OBJETIVOS Relembrar a fórmula geral dos aminoácidos. Relembrar a estrutura das proteínas, dando ênfase à estrutura primária (ligação peptídica). Verificar as propriedades das proteínas e dos aminoácidos por reação colorimétrica diferencial. PROCEDIMENTOS (O técnico do laboratório deve deixar preparada a solução de biureto para uso) Reação com biureto: 1) Separar 8 tubos de ensaio e identificá-los de 1 a 8. 2) Adicionar ao tubo 1 (tubo branco) o volume de 2 mL do reativo do biureto + 1 mL de água. 3) Adicionar ao tubo 2 o volume de 1 mL do reativo do biureto + 1 mL da solução de albumina 10%. 4) Adicionar ao tubo 3 o volume de 1 mL do reativo do biureto + 1 mL da solução de aminoácido glicina 1%. 5) Adicionar ao tubo 4 o volume de 1 mL do reativo do biureto + 1 mL de leite sem ferver. Manual de Estágio 6) Adicionar ao tubo 5 o volume de 1 mL do reativo do biureto + 1 mL de leite fervido. 7) Adicionar ao tubo 6 o volume de 1 mL do reativo do biureto + 1 mL de amido 1%. 8) Adicionar ao tubo 7 o volume de 1 mL do reativo do biureto + 1 mL de óleo de cozinha. 9) Adicionar ao tubo 8 o volume de mL do reativo do biureto + 1 mL de suco de fruta. 10) Anote em quais tubos se detectou a presença de proteínas. A presença delas poderá ser notada pela coloração arroxeada nos respectivos tubos. MATERIAIS QUANTIDADE Solução de proteínas 10% (ovoalbumina em solução salina 10%) 5 mL por grupo Reagente do biureto (CuSO4 em solução alcalina) 18 mL por grupo Solução de glicina 1% 5 mL por grupo Pipetas graduadas 2 mL, 5 mL, 10 mL com pera (protopipetador) 5-8 de cada por grupo Béquer 1 por grupo Solução de amido 1% em água 5 mL por grupo Suco de fruta 5 mL por grupo Óleo de cozinha 5 mL por grupo Leite 5 mL por grupo Garra (pinça de madeira) para tubos 1 por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Banho-maria fervente 1-2 para classe Tripé, tela de amianto, bico de Bunsen 1 conjunto por grupo Estante para tubos 1 por grupo Serviço Social Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Atividades de fixação 1. Os resultados da utilização do método de biureto na detecção das proteínas da clara do ovo cru seriam semelhantes ao do ovo cozido? Justifique. 2. É possível também detectar aminoácidos livres por esse mesmo teste (biureto)? Justifique. 3. Como se explica o aparecimento de cor no experimento realizado? Haja vista que o íon metálico Cu+2 não apresenta a formação de compostos coloridos, pois, ao analisar a sua distribuição eletrônica [Ar]3d10, ele já possui o orbital d completo e estável, não havendo transição eletrônica. Por isso, não há absorção dos comprimentos de onda da luz branca e todos esses comprimentos de onda que compõem a luz branca são refletidos, sendo incolores os seus compostos por conta desse fato. 4. Sabendo-se que um peptídeo apresenta os aminoácidos em sequência Gly-Ala-Cys, esboce o peptídeo. A inversão da ordem dos aminoácidos no peptídeo (Cys-Ala-Gly) altera a molécula? Por quê? Manual de Estágio Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Desnaturação proteica AULA 3 ROTEIRO 1 OBJETIVOS Verificar a alteração de solubilidade de proteínas em presença de soluções salinas e solventes orgânicos. Verificar e relembrar situações desnaturantes. PROCEDIMENTOS 1. Ação da temperatura nas proteínas A) Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de ovoalbumina a 10% e, com auxílio de uma pinça, colocá-lo sobre o bico de Bunsen, ferver (anotar o resultado). 2. Ação do pH nas proteínas A) Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de ovoalbumina a 10% e adicionar 2 mL de HCl 5M (anotar o resultado). B) Em outro tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de ovoalbumina a 10% e adicionar 2 mL de HCl 0,5M (anotar o resultado). 3. Ação de solventes orgânicos sobre as proteínas A) Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de ovoalbumina a 10% e adicionar 2 mL de etanol gelado (anotar o resultado). Serviço Social 4. Ação de sais sobre as proteínas A) Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de ovoalbumina a 10% e adicionar 2 mL da solução saturada de sulfato de amônio (anotar o resultado). MATERIAIS QUANTIDADE HCl 5M 2 mL por grupo Solução saturada de sulfato de amônio (NH4)2 SO4 2 mL por grupo Etanol gelado 2 mL por grupo NaOH 5M 2 mL por grupo Solução de proteínas 10% (ovoalbumina em solução salina 10%) 10 mL por grupo Pipetas graduadas 2 mL, 5 mL, 10 mL com pera (protopipetador) 5-8 de cada por grupo Béquer 2 por grupo Garra (pinça de madeira) para tubos 1 por grupo Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Atividades de fixação 1. Analise a figura a seguir que mostra a mudança da estrutura terciária de uma proteína enzimática, pela modificação das condições às quais ela está exposta. Manual de Estágio Essa mudança é chamada de: a) Saturação e pode ser causada pela alteração do pH do meio. b) Renaturação e pode ser causada pela alteração da temperatura do meio. c) Saponifização e pode ser causada pela alteração de pH do meio. d) Floculação e pode ser causada pela mudança de densidade do meio. e) Desnaturação e pode ser causada pela alteração de temperatura do meio. 2. Logo após a colheita, os grãos de milho apresentam sabor adocicado, devido à presença de grandes quantidades de açúcar em seu interior. O milho estocado e vendido nos mercados não tem mais esse sabor, pois cerca de metade do açúcar já foi convertida em amido por meio de reações enzimáticas. No entanto, se o milho for, logo após a colheita, mergulhado em água fervente, resfriado e mantido em um congelador, o sabor adocicado é preservado. Por que esse procedimento preserva o sabor adocicado dos grãos de milho? 3. Qual a diferença (para o nosso corpo) se tomarmos leite direto da caixa longa-vida e leite fervido? E o que diz a respeito ao leite propriamente dito, o que mudou? 4. Sabe-se que quando se colocam gotas de limão no leite aparece o coalho. Qual a possível explicação? Relacionecom a digestão de proteínas pelo estômago. Explicar por que a enzima pepsina (que é responsável pela digestão, junto com o HCl) não se comporta como as proteínas que se submetem à digestão no estômago. Serviço Social Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Atividade enzimática AULA 3 ROTEIRO 2 OBJETIVO Esta atividade prática tem por objetivo discutir e evidenciar a importância das enzimas sobretudo nos processos digestivos. PROCEDIMENTO 1 – atividade enzimática de extratos vegetais 1) Preparar a gelatina conforme as instruções da embalagem. 2) Preparar os extratos das frutas previamente picadas (o abacaxi sem casca, o mamão com casca e a fruta regional escolhida de acordo com a indicação popular de uso, isto é, com ou sem a casca), utilizando o liquidificador e um pouco de água. 3) Peneirar os extratos (pode ser com gaze). 4) Numerar os tubos de ensaio de 1 a 4 e preparar a sequência de tubos de ensaio, conforme apresentado na tabela a seguir. Tubo Composição Teste 1 4 mL gelatina + 2 mL de água Controle 2 4 mL gelatina + 2 mL de extrato de mamão Mamão 3 4 mL gelatina + 2 mL de extrato de abacaxi Abacaxi 4 4 mL gelatina + 2 mL de extrato da fruta regional Fruta regional Manual de Estágio 5) Colocar os tubos no freezer até que o tubo 1 (controle) gelifique. Isso deverá ocorrer após alguns minutos. A ocorrência ou não da proteólise será avaliada por meio da gelificação. Após um banho de gelo de alguns minutos (o suficiente para ocorrer a gelificação do controle – tubo 1), incline os tubos ligeiramente para verificar a viscosidade do meio em cada um deles. 6) Observar os tubos e anotar na tabela apropriada os resultados positivos e negativos para a gelificação dos tubos. PROCEDIMENTO 2 – atividade enzimática da saliva (importância da amilase salivar) 1) Coletar saliva em um béquer e diluir com água destilada (se for necessário, filtrar em gaze). 2) Em outro béquer, adicionar 20 mL de amido a 1% e colocar, aproximadamente, 1,0 mL de saliva diluída. 3) Identificar sete tubos de ensaio, como segue: T0, T1, T2, T3, T4, T5 e T6 e em cada tubo adicionar 1 gota de Lugol. 4) Homogeneizar o béquer (com o preparado descrito no item 2) e retirar alíquotas de 1 mL a cada 1 minuto (a contar do tempo zero), até 5 minutos transferindo cada alíquota para um dos tubos identificados anteriormente (totalizando sete tubos). Se possível verificar o aparecimento de dextrinas nos tubos mediante a coloração: Amido (azul) – amilodextrina (roxo) – eritrodextrina (vermelho) – acrodextrina (incolor) – maltose (incolor) – glicose (incolor). Observação: o professor deve fazer de forma demonstrativa o mesmo experimento substituindo saliva por HCl 5M a fim de comparar hidrólise ácida com ação enzimática. Serviço Social MATERIAIS QUANTIDADE Abacaxi 1 unidade Mamão 1 unidade Fruta regional 1 unidade Peneira ou gaze 1 por grupo Pó de gelatina 1 por grupo Tubos de ensaio 4 por grupo Pipeta graduada de 10 mL 1 por grupo Espátula 1 por grupo Faca 1 por grupo Béquer 50 mL 1 por grupo Bastão de vidro 1 por grupo Béquer de 500 mL 1 por grupo Amido a 10% 20 mL por grupo Lugol 1 por bancada Gaze (se necessário) 1 pacote por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Bico de Bunsen 1 por grupo Liquidificador 1 unidade Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Atividades de fixação 1. As enzimas estão presentes em pequenas quantidades no organismo. Elas são moléculas extremamente específicas, atuando somente sobre um determinado composto e efetuam sempre o mesmo tipo de reação. Em relação às enzimas, foram feitas as afirmações: Manual de Estágio I. Enzimas são proteínas que atuam como catalisadores de reações químicas. II. Cada reação química que ocorre em um ser vivo, geralmente, é catalisada por um tipo de enzima. III. A velocidade de uma reação enzimática independe de fatores como a temperatura e o pH do meio. IV. As enzimas sofrem um processo de desgaste durante a reação química da qual participam. São verdadeiras as afirmações: a) I e II. b) I e III. c) I, II e IV. d) III e IV. e) I, II, III e IV. 2. Arquilino Pestana, professor de Biologia, após expor para seus alunos do 1º ano do Ensino Médio o conteúdo referente a enzimas – biocatalizadores de natureza proteica –, propôs-lhes o seguinte questionamento: “Sabendo-se que os peroxissomos são organelas que contêm uma catalase – a peroxidase –, o que ocorrerá quando acrescentarmos aos recipientes a seguir, numerados de 1 a 3, peróxido de hidrogênio (H2O2)?” Recipiente 1: carne cozida a 80 ºC por 1,5 horas e recém-cortada em pequenos pedaços. Recipiente 2: carne descongelada e recém-cortada em pequenos pedaços, após três dias de congelamento a -2 ºC. Recipiente 3: Solanum tuberosum (batata) recém-cortada em pequenos pedaços, tendo sido mantida todo tempo em temperatura de 32 ºC. Serviço Social Podemos afirmar que: I. No recipiente 1 não ocorrerá nenhuma alteração, pois as enzimas desnaturam em temperaturas superiores a 40 ºC. II. Nos recipientes 1 e 2, nenhuma alteração será percebida, pois tanto temperaturas elevadas quanto baixas provocam inativação enzimática. III. No recipiente 2 ocorrerá um “borbulhamento” na superfície da carne, em decorrência da ação da peroxidase, promovendo a quebra do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, visto que temperaturas baixas apenas inativam as enzimas, sendo um fenômeno reversível. IV. No recipiente 3 ocorrerá a seguinte reação: H2O2 H2O + O, já que, a 32 ºC, a peroxidase está em seu ótimo de temperatura. V. No recipiente 3 não ocorrerá qualquer tipo de reação, já que os peroxissomos são organelas típicas dos animais. Assinale a alternativa cuja(s) assertiva(s) é(são) correta(s). a) I, III e IV. b) II e IV. c) II, apenas. d) I, III e V. e) III, apenas. Manual de Estágio 3. Analisar a reação 2 (com amido) e explicar (se possível graficamente) o que ocorre com a velocidade enzimática quando: a) Não se dilui a saliva ou se coloca 4 mL de saliva na reação ao invés de 1,0 mL. b) Quando se coloca mais amido (substrato). c) Quando se aumenta ou diminui a temperatura da reação. d) Quando se aumenta ou diminui o pH da reação. Serviço Social Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Determinação de açúcares em solução AULA 4 ROTEIRO 1 OBJETIVOS Relembrar a estrutura de diferentes carboidratos monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos (ligação hemiacetal, hidroxila anomérica, ligação glicosídica). Relembrar as funções e as fontes desses carboidratos. Diferenciar alguns carboidratos mediante reações específicas. PROCEDIMENTOS 1. Teste de Barfoed Separar dois tubos de ensaio e identificá-los com 1 e 2: No tubo 1, adicionar 2 mL de reativo de Barfoed e acrescentar 1 mL de glicose a 10%. No tubo 2, adicionar 2 mL de reativo de Barfoed e acrescentar 1 mL de lactose a 10%. Aquecer à fervura em banho-maria de água durante 5 minutos. Positivo: turvação ou precipitado avermelhado para monossacarídeos redutores. 2. Teste do espelho de prata 1) Colocar 1 mL da solução de nitrato de prata em um tubo de ensaio bem lavado. 2) Adicionar amônia diluída gota a gota com agitação até se dissolver o precipitado formado. Manual de Estágio 3) Adicionar 0,5 mL da solução de glicose (amostra) e agitar. 4) Aquecer em um banho de água à temperatura de 70 ºC durante 5 minutos. Positivo: formação de um espelho de prata para açúcares redutores. 3. Teste de Fehling Separar dois tubos de ensaio e identificá-los com 1 e 2: No tubo 1, adicionar 1 mL da solução de Fehling A e 1 mL da solução de Fehling B e 0,5 mL de glicose. No tubo 2, adicionar 1 mL da solução de Fehling A e 1 mL da solução de Fehling B e 0,5 mL de sacarose. Misturar e aquecer à fervura em umbanho de água durante, aproximadamente, 5 minutos. Positivo: formação de um precipitado avermelhado para açúcares redutores. Lista de reagentes � Solução de Fehling A (dissolução de 34,65 g de CuSO4.5H2O em água e diluição a 500 mL). � Solução de Fehling B (dissolução de 125 g de KOH e 173 g de NaKC4H4O6.4H2O – tartarato duplo de sódio e potássio, sal de Rochelle – em água e diluição a 500 mL). � Solução aquosa de nitrato de prata a 5% (p/v). � Amônia diluída (1:2). � Reagente de Barfoed (dissolução de 66 g de CuC4H6O4 – acetato de cobre (II) – em 10 mL de ácido acético glacial e em água e diluição a 1 L). � Solução 0,01 M em iodo e a 3 % (p/v) em iodeto de potássio. Serviço Social � Solução de Fehling A (dissolução de 34,65 g de CuSO4.5H2O em água e diluição a 500 mL). � Solução de Fehling B (dissolução de 125 g de KOH e 173 g de NaKC4H4O6.4H2O – tartarato duplo de sódio e potássio, sal de Rochelle – em água e diluição a 500 mL). � Solução aquosa de nitrato de prata a 5% (p/v). � Solução 0,01 M em iodo e a 3% (p/v) em iodeto de potássio. � Solução aquosa concentrada de iodeto de potássio (KI) contendo uma pequena quantidade de molibdato de sódio. MATERIAIS QUANTIDADE Pipetas graduadas 2 mL, 5 mL, 10 mL com pera (protopipetador) 5-8 de cada por grupo Tubos de ensaio 15 por grupo Estantes 1-2 por grupo Garra (pinça de madeira) para tubos 1 por grupo Soluções (reativos) para os experimentos EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Banho-maria fervente 1-2 para classe Tripé, tela de amianto, bico de Bunsen 1 conjunto por grupo Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Manual de Estágio Atividades de fixação 1. O que significa poder redutor do açúcar? Como esse conceito foi aplicado à aula? 2. Qual é a relação das ligações glicosídicas e o poder redutor do açúcar? 3. Por que foi possível obter prata metálica na reação de formação do espelho de prata? 4. Analisar os açúcares a seguir e dizer quais seriam Barfoed positivo e Fehling positivo. Serviço Social Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Bioquímica Estrutural Título da Aula: Lipídeos AULA 4 ROTEIRO 2 OBJETIVOS Relembrar a fórmula geral dos ácidos graxos e dos triglicerídeos. Relembrar a reatividade dos ácidos graxos: hidrogenação, halogenação e saponificação. Verificar a hidrólise alcalina dos triglicerídeos. Formação de sabão insolúvel. Pesquisa de insaturações em óleos e gorduras (explicar a finalidade do índice de iodo). PROCEDIMENTOS Parte I: Colocar um pedaço de manteiga (caso não tenha, pode-se usar 3 mL de óleo de soja) em um erlenmeyer de 125 mL e adicionar 20 mL de KOH 10% em álcool (pode ser NaOH 10%). Aquecer em banho-maria durante, aproximadamente, 5 minutos. Verificar se a saponificação foi completa, observando a solubilidade de uma alíquota da mistura da mistura em água. Guardar a solução. Esquematizar a equação da reação ocorrida. Manual de Estágio Parte II: Separar três tubos de ensaio e identificá-los com 1, 2 e 3. No tubo 1, adicionar 2 mL de solução de sabão preparada na parte I e 5 gotas de solução de cloreto de sódio 35% (NaCl 35%). No tubo 2, adicionar 2 mL de solução de sabão preparada na parte I e 5 gotas de solução de cloreto de cálcio 10% (CaCl2 10%). No tubo 3, adicionar 2 mL de solução de sabão preparada na parte I e 5 gotas de ácido clorídrico 0,1N (HCl 0,1N). Se necessário, leve a mistura (sabão) obtida na parte I novamente ao banho-maria para dissolução. Misturar as reações por agitação. Esquematizar a reação. Parte III: Separar dois tubos de ensaio e identificá-los com 1 e 2: No tubo 1, adicionar 5 mL de óleo de soja e 10 gotas de lugol. No tubo 2, adicionar 5 mL de margarina derretida e 10 gotas de lugol. Ferver os tubos em banho-maria até o desaparecimento da coloração provocada pelo lugol. Após resfriamento à temperatura ambiente, adicionar 3 gotas de solução de amido em cada tubo. Atenção: esse teste deve ser realizado com cuidado, pois a adição de uma quantidade de iodo que ultrapasse a capacidade de fixação pelo ácido graxo insaturado levará a iodo livre em solução, podendo ocasionar interpretação errônea. Serviço Social Observação: como o amido é de difícil dissolução, proceder ao preparo dessa solução da seguinte maneira: misturar 1 g de amido com 10 mL de água. Derramar a pasta em um recipiente que contenha 100 mL de água fervente. Cessar a ebulição e deixar esfriar e sedimentar. Separar a parte sobrenadante (sem grumos) por decantação. A solução ganha maior estabilidade se for adicionada de 1 g de ácido salicílico (1%). Técnico: preparo do reagente de lugol: 5 g de iodo + 10 g de iodeto de potássio (KI). Completar o volume para 100 mL com água destilada. Diluir 1:10 no momento da utilização. MATERIAIS QUANTIDADE Óleo de soja 10 mL por grupo Tubo de ensaio 6 por grupo Margarina e manteiga 5-20 g por grupo Solução de amido 1% 1 mL por grupo Lugol 1 mL por grupo Pipeta Pasteur 4 por grupo KOH 10% em álcool 20 mL por grupo NaOH 10% (se necessitar) 20 mL por grupo NaCl 35% 1 mL por grupo CaCl2 10% 1 mL por grupo EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Banho-maria 1-2 para classe Tripé, tela de amianto, bico de Bunsen 1 conjunto por grupo Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente. Manual de Estágio Atividades de fixação 1. O que são reações de hidrogenação, halogenação e saponificação? Exemplifique. 2. Qual é a relação da iodinação com as insaturações dos ácidos graxos? Explique. 3. Esquematizar um ácido graxo de 18 ºC saturado e dizer como seria se tivesse duplas entre os carbonos (lembrar que “n” ou “ ” indica a posição da primeira dupla ligação, com a contagem iniciando-se no carbono do grupo metil (CH3), localizado na extremidade oposta da carboxila). a) 18:1 ( −9) = 9-10 – ácido oleico. b) 18:2 ( −6) = 6-7, 9-10 – ácido linoleico. c) 18:3 ( −3) =3-4, 6-7, 9-10 – ácido linolênico. d) Fazer um ácido graxo com 20C: 20:4 (w-6) = 6-7, 9-10, 12-13, 15-16 – ácido eicosatetraenoico ou ácido aracdônico. 4. Esquematizar um triglicerídeo (TG) com 3 ácidos graxos com 10C (reação de esterificação) e a digestão dos TGs pela lipase.
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