Praticas de Genetica, Biologia - Rogerio Fernandes de Souza

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PRÁTICAS DE GENÉTICA,
BIOLOGIA MOLECULAR,
BIOTECNOLOGIA E
EVOLUÇÃO
Catalogação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Bibliotecária: Aparecida de Lourdes Mariani – CRB 9/1230
P912 Práticas em genética, biologia molecular, biotecnologia e evolução [livro
eletrônico] / Rogério Fernandes de Souza, Mariana A. Bologna Soares de
Andrade, Carlos Roberto Maximiano da Silva [organizadores]. – Londrina :
Eduel, 2018.
1 Livro digital : il.
Vários autores.
Inclui bibliografia.
Disponível em: http://www.eduel.com.br
ISBN 978-85-7216-953-0
1. Genética – Prática. 2. Biologia molecular – Prática. 3. Biotecnologia –
Prática. 4. Evolução (Biologia) – Prática. I. Souza, Rogério Fernandes de. II.
Andrade, Mariana A. Bologna Soares de. III. Silva, Carlos Roberto
Maximiano da.
CDU 575
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SUMÁRIO
Apresentação
Unidade 1 - Ciclo Celular
MITOSE EM RAIZ DE CEBOLA OU DE MILHO
OBTENÇÃO DE CÉLULAS METAFÁSICAS EM
ANIMAIS
OBTENÇÃO DE CÉLULAS MEIÓTICAS DE
PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE MILHO
MEIOSE EM TESTÍCULOS DE GAFANHOTO
Unidade 2 - Estudos Cariotípicos
ANÁLISE CARIOTÍPICA E MONTAGEM DE
CARIÓTIPOS
CITOGENÉTICA HUMANA
Unidade 3 - Biologia Molecular
CONSTRUINDO UM MOLDE DA MOLÉCULA DE
DNA
Unidade 4 - Genética Qualitativa e Quantitativa
NOÇÕES DE PROBABILIDADE APLICADA À
GENÉTICA
A PRIMEIRA LEI DE MENDEL – UMA SIMULAÇÃO
A SEGUNDA LEI DE MENDEL – UMA
SIMULAÇÃO
HERANÇA GENÉTICA DO MILHO SUPERDOCE:
PRIMEIRA LEI DE MENDEL
MOSCAS DROSÓFILAS COMO MODELO PARA
ESTUDOS DE GENÉTICA MENDELIANA
GENÉTICA QUANTITATIVA: COMPONENTES DE
VARIÂNCIA, HERDABILIDADE E GANHO DE
SELEÇÃO
Unidade 5 - Genética aplicada à Biotecnologia
PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA
QUEM É O PAI DO BEZERRO?
SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES
MOLECULARES
RESTRIÇÃO DE DNA DE BACTERIÓFAGO
LAMBDA (λ) E MAPAS DE RESTRIÇÃO
Unidade 6 - Genética de populações e evolução
biológica
SIMULAÇÃO DO EQUILÍBRIO DE HARDY-
WEINBERG
SIMULANDO A AÇÃO DA SELEÇÃO NATURAL
NA ESPÉCIE HUMANA
O JOGO DA DERIVA
DETERMINAÇÃO DO LIMIAR GUSTATIVO À
FENILTIOCARBAMIDA
O COEFICIENTE DE ENDOCRUZAMENTO E O
EQUILÍBRIO DE WRIGHT
ESTUDO DE SIMILARIDADE GENÉTICA COM
MARCADORES MOLECULARES
AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA E
CONSERVAÇÃo DE ESPÉCIES UTILIZANDO
MARCADORES AFLP
SIMULAÇÃO DA TEORIA DOS JOGOS
EVOLUTIVOS
Respostas às Questões
APRESENTAÇÃO
Os conhecimentos nas áreas da Genética, Evolução e
Biotecnologia estão em constante crescimento e isso causa impacto
no ensino desses conteúdos. Nota-se cada vez mais a necessidade
de que eles sejam contextualizados para que os estudantes
compreendam os diferentes aspectos dessas áreas da ciência. Por
outro lado, muitos obstáculos se apresentam quando se pensa em
desenvolver atividades práticas: falta de laboratório, de recursos e
de tempo, aliada a materiais caros e à carência de práticas com
caráter investigativo nos livros. Inclusive no ensino superior.
Elaborar atividades com caráter investigativo compreende o
desenvolvimento de trabalhos práticos. Pode-se compreender
trabalho prático como qualquer atividade que comporte a
manipulação de materiais, objetos ou organismos com a finalidade
de se observar fenômenos. Portanto, isso pode ocorrer em
laboratório, no campo e na própria sala de aula. Nesta perspectiva,
este livro foi desenvolvido com o objetivo de oferecer propostas de
atividades práticas para aulas de Genética, Evolução e
Biotecnologia dos cursos de graduação. Nessa elaboração,
participam professores e pesquisadores das áreas relacionadas à
temática do livro. O resultado foi um material que apresenta uma
compilação de atividades, desde as mais utilizadas por professores
até propostas inovadoras.
O livro está divido em seis unidades: Ciclo Celular, Estudos
Cariotípicos, Biologia Molecular, Genética Qualitativa e Quantitativa,
Genética Aplicada à Biotecnologia e Genética de Populações e
Evolução Biológica. Em cada uma das unidades são apresentadas
propostas para serem desenvolvidas com estudantes que possuam
Genética, Evolução ou Biotecnologia nos seus currículos. Quanto à
estrutura dos capítulos, são propostas de aulas que envolvem
simulações, práticas em laboratórios, atividades de campo e análise
de materiais. Em todos eles há uma breve contextualização do
conteúdo a ser desenvolvido, o detalhamento da atividade e dos
procedimentos necessários e, ao final, questões problematizadoras.
Esperamos, com este material, auxiliar a prática de professores
dessas áreas com as propostas de aulas contextualizadas e
possíveis de serem desenvolvidas em diferentes situações.
Os organizadores
UNIDADE 1 - CICLO CELULAR
MITOSE EM RAIZ DE CEBOLA OU DE MILHO
Carlos Roberto Maximiano da Silva
Ana Lúcia Dias
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Quando uma célula eucariótica se multiplica, ela passa por uma
série de transformações, muitas das quais podem ser facilmente
observadas à luz de um microscópio óptico, principalmente as
modificações sofridas pelas cromatinas. O processo de divisão
celular é chamado de mitose (do grego mitos = fio + ose = estado
de). Esta envolve a separação das cromátides irmãs, que resultam
da duplicação do DNA durante a fase S da interfase. No decorrer
dela, a estrutura da cromatina se condensa e ocorre a separação e
a migração das cromátides para os polos da célula, bem como a
divisão do citoplasma. Com isso, uma célula, chamada de célula-
mãe, origina duas células filhas que compartilham a mesma
informação genética.
Não é fácil analisar a mitose nas células vivas, pois a divisão
celular é um processo dinâmico e ininterrupto. Além disso, o núcleo,
organelas e componentes citoplasmáticos apresentam-se
normalmente incolores. Por esse motivo é necessário utilizar
fixadores, que matam as células e fazem com que elas estacionem
em determinados estágios da divisão, e corantes, que permitirão a
visualização dessas estruturas. De acordo com as características
celulares e o nível de condensação da cromatina, convencionou-se
dividir a mitose em 4 fases, denominadas prófase, metáfase,
anáfase e telófase. Em vegetais, os melhores materiais para a
observação dessas fases constituem os tecidos em crescimento,
como brotos de caules e de folhas e as pontas das raízes, também
chamados de meristemas apicais e radiculares, respectivamente.
Do ponto de vista didático, podemos utilizar os meristemas
radiculares de cebola (Allium cepa; 2n = 16 cromossomos) e de
milho (Zea mays; 2n = 20 cromossomos) para esse tipo de estudo,
tendo em vista que estas são de fácil germinação, além de
apresentarem cromossomos grandes e prontamente identificáveis.
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Identificar as diferentes fases da mitose, relacionando-as com as
alterações sofridas pela cromatina ao longo da divisão celular, por
meio do preparo de lâminas a fresco que podem ser observadas em
microscópio óptico.
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Raízes de cebola e/ou milho;
Corante orceína acetoclorídrica;
Meio de montagem (verniz, bálsamo do Canadá,
Entellan® ou Permount®) – opcional;
Ácido acético a 50%;
Microscópio óptico;
Copos, lâminas, lamínulas, placas de Petri, vidro relógio
(opcional), pinças, estiletes, tesouras, esmalte incolor,
lamparina de álcool, papel sulfite e lápis.
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Colocar uma cebola emborcada em um copo com água,
deixando a região onde se formam as suas raízes (o
disco ou caule) em contato com a água (Figura 1A);
Se for utilizar milho,colocar os grãos em um recipiente
com algodão úmido para que ocorra a germinação;
Deixar as raízes crescerem até que atinjam
aproximadamente 12 cm, o que demora cerca de 1
semana;
Cada cebola permite montar entre 10 a 20 lâminas.
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O professor pode optar por preparar as lâminas junto com os
estudantes, que serão descartadas após as atividades, ou então
montar lâminas permanentes, que poderão ser utilizadas nas aulas
práticas subsequentes. O preparo desses dois tipos de lâminas é
explicitado a seguir.
Figura 1: (A) Cebola após aproximadamente 1 semana de cultivo;
(B) Retirada dos meristemas apicais das raízes; (C) Material
necessário para a coloração dos componentes celulares: lamparina
de álcool, pinça, placa de Petri e corante orceína acetoclorídrica
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva.
Procedimento
1. Cortar de 3 a 4 raízes em tamanhos de 1 a 2 cm na parte
apical e transferi-las para uma placa de Petri contendo
orceína acetoclorídrica (Figuras 1B e C);
2. Aquecê-las sobre uma lamparina de álcool até a emissão de
vapores sem, contudo, deixar que a solução ferva (Figura
2A);
3. Esfriar por 5 minutos;
4. Repetir esta operação 2 vezes mais e, após o 3º
aquecimento, repousar por 15 minutos;
5. Colocar uma raiz sobre uma lâmina limpa, separar os 2-3 mm
apicais, desprezando o resto da estrutura (Figura 2B);
6. Cobrir com cuidado com uma lamínula, procurando evitar a
formação de bolhas (Figura 2C);
7. Com um lápis ou com a base de uma pinça, bater
suavemente a preparação para se obter uma extensão
unicelular (Figura 2D);
8. Envolver a lâmina com a lamínula em um papel de filtro e
apertar a região da lamínula (Figura 2E) para esmagar as
células;
9. Com um pedaço de papel de filtro, eliminar o excesso de
corante;
10. Vedar a lamínula com esmalte incolor (Figura 2F);
11. Observar ao microscópio óptico à procura de células
coradas (Figura 3).
Figura 2: Procedimentos para a manufatura da lâmina: (A)
Aquecimento das raízes até a emissão de vapores; (B) Isolamento
dos meristemas apicais; (C) Cobertura com a lamínula; (D)
Esmagamento com a pinça; (F) Esmagamento com papel filtro e
retirada do excesso de corante e (F) Vedação
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva.
Produzindo lâminas permanentes
Caso seja de interesse obter lâminas permanentes, em vez de
vedar o material com o esmalte, pode-se utilizar um meio de
montagem (verniz, bálsamo do Canadá, Entellan® ou Permount®),
seguindo o procedimento abaixo:
1. Colocar a lâmina com a lamínula virada para baixo em um
vidro relógio com ácido acético 50% até esta se soltar;
2. Deixar a lâmina secando em um suporte e colocar a
lamínula em um frasco contendo xilol;
3. Passar uma lamínula nova em xilol e colá-la com uma gota
de meio de montagem sobre a lâmina que estava secando;
4. Em uma lâmina nova, colocar uma gota de meio de
montagem e colar sobre ela a lamínula mantida no xilol.
Figura 3: Lâmina de células de raiz de cebola observada ao
microscópio óptico em aumento de 40 vezes
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva.
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A mitose é convencionalmente dividida em quatro fases: prófase,
metáfase, anáfase e telófase, de acordo com as características da
cromatina (Figura 4). As características de cada uma delas são
descritas a seguir:
Prófase: a membrana do núcleo está se desmontando e, ao
mesmo tempo, se inicia a condensação gradual das
cromátides. No início, vemos inúmeros “fios” emaranhados
(as cromátides) que, ao longo desta fase, vão ficando
grossos e se posicionando no centro da célula;
Prometáfase: Ao final da Prófase e início da Metáfase, uma
fase intermediária chamada prometáfase pode ser
identificada. Esta é muitas vezes confundida com a Metáfase,
porém, nela, os cromossomos não estão totalmente
condensados;
Metáfase: As cromátides irmãs alcançam o grau máximo de
condensação, sendo denominados de cromossomos, e os
seus centrômeros são posicionados no centro da célula, a
chamada placa equatorial. Lembrando que, de acordo com o
preparo da lâmina, os cromossomos metafásicos poderão
estar menos ou mais espalhados no campo de visão;
Anáfase: As cromátides irmãs dos cromossomos começam a
se separar e a se descondensar. Portanto, nela podemos ver
dois grupos de cromátides migrando em direção aos polos
opostos da célula;
Telófase: Pode ser confundida com a Anáfase, uma vez que
também temos as cromátides separadas nos dois polos da
célula. Contudo, nela, as cromátides estão visivelmente
descondensadas formando o que parecem ser dois núcleos
em uma mesma célula. A célula, por sua vez, começa a
sofrer citocinese e ter a membrana que envolve o núcleo
restaurada. Lembrando que neste tipo de procedimento não é
possível observar a citocinese.
Procedimento
1. Para a execução dessa atividade é preciso ter em mãos
lâminas recém-preparadas ou permanentes, contendo raiz de
cebola ou de milho fixadas e coradas;
2. Estas lâminas devem ser observadas ao microscópio óptico,
procurando-se identificar as células que apresentem as
diversas fases da mitose;
3. Desenhar as diferentes fases da mitose, tentando ressaltar os
aspectos mais importantes de cada uma delas.
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1. Quando, durante o ciclo celular, tem lugar a duplicação do
material genético e quando os cromossomos atingem o seu
grau máximo de condensação?
2. Qual seria a diferença entre cromátides irmãs e não irmãs? E
entre cromossomos homólogos e não homólogos?
3. Em quais situações os organismos pluricelulares
apresentarão células se dividindo por mitose?
Figura 4: Imagem de células de raiz de cebola obtidas por
microscopia ótica em aumento de 1000 vezes: (A) Célula em
Intérfase; (B a E) Prófase; (F) Prometáfase; (G e H) Metáfase; (I a
K) Anáfase e (L e M) Telófase
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva.
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JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A.
Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
OBTENÇÃO DE CÉLULAS METAFÁSICAS EM
ANIMAIS
Carlos Roberto Maximiano da Silva
Maria José Sparça Salles
Wagner José Martins Paiva
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A melhor fase do ciclo celular para se observar os cromossomos
é a metáfase, pelo fato deles atingirem o máximo de condensação,
tornando evidente tanto as cromátides como a posição dos
centrômeros. Isso permite detectar possíveis alterações
cromossômicas estruturais e numéricas nos organismos, bem como
comparar as estruturas cromossômicas entre diferentes espécies.
Para facilitar a obtenção de células metafásicas, utiliza-se células ou
tecidos com alto índice de proliferação celular, tais como os
linfócitos e a medula óssea. Os linfócitos do sangue periférico,
apesar de fornecerem culturas de curta duração, são de fácil
obtenção, podendo ser empregados em exames rotineiros de
laboratório. Além disso, o seu uso evita o sacrifício dos animais, o
que não acontece quando se opta pelo tecido de medula óssea. Isso
porque, em espécies de pequeno porte, como ratos e
camundongos, isso é feito a partir da retirada do fêmur. Em
organismos maiores, como os humanos, pode-se fazer uma punção
da medula do osso esterno ou da crista ilíaca. Uma vantagem em se
analisar metáfases de medula óssea é a possibilidade de verificação
do efeito de mutagenicidade in vivo. O teste citogenético de
mutagenicidade in vivo, considerado de curta duração, detecta o
potencial que um composto químico tem de induzir alterações
estruturais e numéricas nos cromossomos da espécie. Nesse tipo
de estudo, normalmente são utilizados animais jovens, tecidos com
alto índice de proliferação celular e com um tempo de ciclo mitótico
relativamente curto.
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Apresentar as técnicas de obtenção de metáfases a partir de
linfócitos do sangue periférico e da medula óssea, que podem ser
utilizadas tanto em atividades de aulas práticas como na rotina de
laboratóriosde estudos citogenéticos.
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Os procedimentos aqui trabalhados utilizam reagentes tóxicos.
Portanto, é necessário extremo cuidado ao manipulá-los. Deve-se
utilizar luvas e jaleco durante todo o procedimento, manter os
reagentes em ambiente adequado e verificar com antecedência se
há todo o material disponível para os procedimentos. Ademais,
todas as normas de bioéticas devem ser seguidas quando for
necessário sacrificar animais.
Atividade I – Obtenção de células metafásicas a partir de
linfócitos do sangue periférico
Caso se deseje trabalhar essa atividade com os estudantes, é
importante lembrar que são necessárias 72 horas para a incubação
dos linfócitos em meio de cultura contendo fito-hemaglutinina, mais
2 horas de tratamento com colchicina, antes de se iniciar o processo
de preparo, coloração e montagem das lâminas. Como alternativa, o
professor pode programar e executar em sala de aula somente as
etapas posteriores ao tratamento com a colchicina.
Material
1 a 5 mL de sangue periférico;
Ácido acético (PA);
Colchicina 4 x 105 M;
Corante Giemsa;
Fito-hemaglutinina (PHA);
Heparina sódica (5000 UI);
Meio de cultura para linfócitos (RPMI-1640-Gibco);
Metanol (PA);
Solução hipotônica de KCl (0,075 M);
Soro bovino fetal estéril;
Tampão Sörensen [(NaH2 PO4) 0,2 M + (Na2HPO4.H2O) 0,2
M];
Centrífuga de 800 a 1000 rpm;
Estufa à temperatura de 37°C;
Seringa e agulha descartáveis;
Frascos de cultura (estéreis), tubos de ensaio, pipetas
Pasteur, lâminas, lamínulas e lamparina de álcool.
Procedimento
As metáfases para as análises dos cromossomos serão obtidas
segundo a técnica modificada de Moorhead et al. (1960), que
consiste dos seguintes passos:
1. Dependendo do tamanho do animal, coletar de 1 a 5 mL de
sangue periférico – do plexo oftálmico, do tecido circulatório
dos membros etc – com uma seringa descartável contendo
0,1 mL de heparina;
2. Manter a seringa em posição vertical, com a agulha voltada
para cima, até a sedimentação das hemácias;
3. Em uma capela estéril, transferir 0,5 mL do plasma para um
frasco contendo 7,5 mL de meio de cultura RPMI 1640 à
temperatura ambiente, 2 ml de soro bovino fetal e 0,2 mL de
fito-hemaglutinina;
4. Manter o frasco encubando em estufa em temperatura
constante de 37°C por 72 horas;
5. Adicionar 0,1 mL de solução de colchicina 4 x 105 M ou
0,00l6% ao frasco de cultura para cada 5 mL de meio;
6. Manter incubado por 2 horas;
7. Transferir o conteúdo do frasco para um tubo de ensaio e
centrifugar a 800/1.000 rpm por 5 minutos, desprezando o
sobrenadante;
8. Com auxílio de uma pipeta Pasteur, ressuspender as células
sedimentadas suavemente em 10 mL de solução hipotônica
de KCl 0,075 M aquecida a 37°C;
9. Manter o material em estufa a 37°C por 10 minutos;
10. Centrifugar a 1.000 rpm por 5 minutos, desprezando o
sobrenadante;
11. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, ressuspender o
sedimento em 5 mL de fixador Carnoy modificado (3 partes
de metanol para 1 parte de ácido acético) recém-preparado
(este deve ser preparado no início do processo e não pode
ser armazenado, pois degrada rapidamente, formando
aldeído acético);
12. Centrifugar a 1.000 rpm por 5 minutos, desprezando o
sobrenadante;
13. Repetir os passos 11 e 12;
14. Fazer a diluição necessária, com algumas gotas de fixador,
de acordo com a quantidade de material obtido;
15. Distribuir 3 gotas deste material em lâminas limpas e
conservadas em água gelada, inclinando-as levemente;
16. Após secagem, corar com uma solução de Giemsa diluído em
tampão Sörensen (1:30), preparado momentos antes do uso,
durante 5 minutos;
17. Lavar em água corrente e deixar secar;
18. Observar as lâminas ao microscópio óptico, inicialmente com
objetiva de 10X e, quando localizar uma metáfase, centralizar
no campo e passar para a objetiva de 40X;
19. Em seguida, observar com a objetiva de 100X (não esquecer
de utilizar o óleo de imersão);
20. Escolher uma metáfase, observá-la com a objetiva de 100X,
desenhar os cromossomos e classificá-los em seus
respectivos grupos, de acordo com o tamanho e posição do
centrômero, conforme especificado na Figura 1.
Figura 1: Classificação dos cromossomos de acordo com a posição
do centrômero
Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza.
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Essa técnica pode ser empregada em roedores, aves e outros
animais de pequeno porte. Para a apresentação em aula, sugerimos
que se utilize ratos de laboratório e que o animal seja abatido
seguindo as normas éticas. Para animais de médio e grande portes,
considerar a possibilidade de obtenção de medula óssea a partir da
punção do osso esterno. Essa técnica também permite analisar os
efeitos de um mutagênico nos cromossomos, de animais que
receberam recentemente alguma substância mutagênica.
Material
Um camundongo ou um rato;
Ácido Acético (PA);
Água destilada;
Colchicina 0,1 M;
Corante Giemsa;
Éter;
Metanol (PA);
Solução hipotônica de KCl (0,075 M);
Tampão Sörensen [(NaH2 PO4) 0,2 M + (Na2HPO4.H2O) 0,2
M];
Estufa à temperatura de 37°C;
Centrífuga de 800 a 1000 rpm;
Bisturi, alfinetes, tesoura, gazes, algodão, lâminas, lamínulas,
pipeta Pasteur, Beckers, tubos de ensaio, seringa com agulha
e lamparina.
Procedimento
1. Injetar na cavidade peritoneal do animal 1 mL de colchicina
0,1 M para cada 100 g de peso e aguardar 2 horas (Figura
2B);
2. Anestesiar o animal com éter, dissecá-lo na região dos
fêmures (procedendo a partir da face externa e região
posterior da coxa evitará o corte da artéria femoral e o
sangramento, o que atrapalha o processo de extração),
descarnando e limpando completamente (Figura 2C e D);
3. Extrair os fêmures e cortá-los na região das epífises (Figura
2E);
4. Com auxílio de uma seringa, injetar 10 mL de solução
hipotônica no canal ósseo para a retirada da medula,
vertendo o conteúdo de cada fêmur em um tubo de ensaio
diferente (Figura 2F);
5. Homogeneizar com a pipeta Pasteur ou com a própria seringa
com agulha
6. Manter o tubo de ensaio em estufa a 37°C de 10 a 15
minutos;
7. Centrifugar por 10 minutos a 1.200 rpm;
8. Desprezar o sobrenadante e agitar para ressuspender as
células;
9. Colocar 3 mL de fixador Carnoy modificado (3 partes de
metanol para 1 parte de ácido acético) recém-preparado (este
deve ser preparado no início do processo e não pode ser
armazenado, pois degrada rapidamente, formando aldeído
acético);
10. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, ressuspender as
células;
11. Centrifugar por 5 minutos a 1.200 rpm, descartando o
sobrenadante;
12. Repetir os passos 9 a 11;
13. Ao sedimento, acrescentar 0,2 mL de fixador Carnoy
modificado e ressuspender o material com uma pipeta
Pasteur;
14. Preparar as lâminas pelo método de espalhamento, pingando
um ou duas gotas da suspensão de células em lâminas
limpas contendo um filme de água destilada gelada,
mantendo-as inclinadas a aproximadamente 45° durante o
processo;
15. Após a secagem das lâminas, corar com uma solução de
Giemsa diluído em tampão Sörensen (1:30), preparado
momentos antes do uso, durante 5 minutos;
16. Após 5 minutos, lavar as lâminas em água corrente e colocar
para secar ao ar livre;
17. Observar ao microscópio óptico, inicialmente com objetiva de
10X e, quando localizar uma metáfase, centralizar no campo
e passar para a objetiva de 40X;
18. Em seguida, observar com a objetiva de imersão;
19. Escolher uma metáfase, desenhar os cromossomos e
classificá-los em seus respectivos grupos, de acordo com o
tamanho e posição do centrômero (Figura 1).
Figura 2: Extração do fêmur de um roedor: (A) Material necessário;
(B) Injeção de colchicina na cavidade peritoneal; (C) Dissecação a
partir da face externa da coxa; (D) Exposição do fêmur; (E) Corte na
região da epífise e (F) Injeção solução hipotônica no canal ósseo
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva e Cynthia Marcon Cunha.
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1. Qual a finalidade de se adicionar fito-hemaglutinina ao meio
de cultura durante a incubação e por que os linfócitos devem
ser incubadospor até 72 horas em meio de cultura?
2. Qual seria a finalidade do uso de colchicina durante o
processo de obtenção de células metafásicas?
3. Por que as células metafásicas precisam passar por uma
solução hipotônica antes de serem fixadas?
4. O que pode ser observado ao microscópio óptico quando se
utiliza a objetiva de 10X? Qual é o aspecto das metáfases
com esse grau de amplificação?
5. Quando usamos a objetiva de 40X é possível determinar o
número e a forma dos cromossomos? E na objetiva de
imersão (100X), qual será o aspecto dos cromossomos?
6. Qual seria a utilidade prática de se obter células metafásicas?
Em que situações isso é normalmente realizado?
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GUERRA, M. Introdução à Citogenética Geral. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1988.
KASAHARA, S. Práticas de Citogenética. Ribeirão Preto: SBG, 2001.
MOORHEAD, O. P.; NOWELL, P. C.; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M.
HUNGERFORD, D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from
human peripheral blood. Experimental Cell Research, v. 20, n.3, p. 613-16.1960.
SIVIERO, F. Biologia Celular: bases moleculares e metodologia de pesquisa. São
Paulo: Roca, 2013.
OBTENÇÃO DE CÉLULAS MEIÓTICAS DE
PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE MILHO
Carlos Roberto Maximiano da Silva
Ana Lúcia Dias
Lucia Giuliano Caetano
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A meiose (do grego meiosis = divisão ao meio) é o processo de
divisão celular pelo qual as espécies de reprodução sexuada
costumam formar os seus gametas. Os organismos que realizam
este tipo de reprodução possuem dois conjuntos de cromossomos,
cada um herdado de um de seus parentais. Por esse motivo, eles
são chamados de diploides (ou 2n). Por outro lado, os gametas
produzidos por esses indivíduos possuem apenas um conjunto
cromossômico, sendo por isso chamados de haploides (n). Pelo fato
de os descendentes serem formados pela união de gametas
haploides de seus parentais, a meiose garante que o número
cromossômico da espécie se mantenha o mesmo ao longo das
gerações.
Este mecanismo de divisão celular ocorre em duas etapas
sucessivas, de tal forma que, a partir de uma célula diploide, são
originadas quatro células haploides. Além disso, outros fenômenos
de grande importância genética também ocorrem durante a meiose,
tais como a sinapse, com o pareamento de cromossomos
homólogos; a permuta, que envolve a troca de partes entre os
cromossomos homólogos; e a segregação do material paterno e
materno, com a distribuição ao acaso dos cromossomos pareados
para os dois polos da célula. Isso resulta em células haploides com
conjuntos cromossômicos únicos em termos de combinações
genéticas.
Devido a todos esses processos, a divisão meiótica é complexa.
Mas, para efeito didático, ela é dividida em meiose I (divisão
reducional) e meiose II (divisão equacional). A meiose I consta da
prófase I (subdividida em leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e
diacinese), metáfase I, anáfase I, telófase I e intercinese (com a
formação das díades). A meiose II consta da prófase II, metáfase II,
anáfase II e telófase II (com a formação das tétrades). A Figura 1
esquematiza algumas das principais etapas do processo de divisão
meiótico.
Figura 1: Esquema representando algumas das fases do processo
de divisão meiótica: (A) Célula em intérfase com 2n = 4
cromossomos; (B) Metáfase I; (C) Anáfase I; (D) Células filhas
produzidas no final da primeira divisão meiótica, contendo um
cromossomo de cada par; (E) Metáfase II; (F) Anáfase II e (G)
Células filhas (gametas) produzidas após a segunda divisão
meiótica com n = 2 cromossomos
Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza e Carlos R. M. da Silva.
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Preparar lâminas a partir de anteras de milho para a identificação
e observação das diferentes fases da meiose em microscópio
óptico.
M�������
Anteras de milho de diferentes idades;
Fixador (3 partes de álcool para 1 de ácido acético);
Corante carmim propiônico e/ou orceína;
Ácido acético a 60%;
Microscópio óptico;
Frascos de armazenamento, isqueiro, lâminas, lamínulas,
estiletes, pinças, pregos, placas de Petri, esmalte incolor,
lupa, papel filtro, papel sulfite e lápis.
P��������� � ���������
O milho (Zea mays) é um excelente material para a visualização
das diferentes fases da meiose por ser facilmente cultivável, permitir
a obtenção de uma grande quantidade de anteras (onde são
formados os grãos de pólen) a partir do seu pendão e apresentar
cromossomos grandes e em pequena quantidade (2n = 20). Para se
ter sucesso na realização dessa prática, as anteras deverão ser
colhidas na fase em que o milho ainda esteja soltando os pendões.
Estas deverão ser expostas e fixadas em uma solução de ácido
acético e álcool (3:1) de 12 a 24 horas, seguido de duas trocas
deste fixador, com espaçamento de 4 horas entre elas. Após 4 horas
da última troca, pode-se guardar no congelador ou no freezer por
tempo indeterminado.
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1. Limpar lâminas e lamínulas e colocá-las em uma estante ou
suporte (Figura 2A);
2. Separar o material que será utilizado na preparação das
lâminas (Figura 2B);
3. Retirar do congelador o frasco com as anteras fixadas,
deixando que alcancem a temperatura ambiente;
4. Colocar as anteras em uma placa de Petri com água a
temperatura ambiente, deixando-as por 10 minutos;
5. Separar as anteras (Figura 2C) de diferentes regiões do
pendão para se obter células em diferentes fases da meiose –
no ápice do pendão estarão as anteras mais claras, onde as
fases iniciais da meiose serão mais frequentes, e na base do
pendão estarão as anteras mais amareladas, com as fases
finais da meiose;
6. Transferir as anteras – no máximo 3 delas – para uma lâmina
limpa e, com o auxílio de uma lupa e agulhas, separar as
anteras das brácteas (Figura 2D), sendo estas últimas
descartadas;
7. Colocar sobre as anteras uma gota do corante carmim
propiônico (Figura 2E);
8. Cortar as anteras e esmagá-las levemente com as agulhas
para que as células se soltem (Figura 2F);
9. Passar um prego sobre a lâmina, sem tocá-la, para que o
material se core melhor (Figura 2G);
10. Aquecê-la levemente e cobrir com uma lamínula;
11. Envolver a lâmina com um pedaço de papel filtro dobrado ao
meio; apoiar com os dedos entre as duas extremidades da
lamínula, para que esta não se movimente e, com o polegar,
apertar para realizar o esmagamento das células (Figura 2H);
12. Vedar as bordas da lamínula com o esmalte incolor e esperar
que este seque;
13. Observar ao microscópio óptico, procurando por células que
apresentem as diferentes fases da meiose;
14. Desenhar as células com as diferentes fases da meiose,
procurando destacar os seus aspectos mais relevantes;
15. Ordenar as imagens, de acordo com as fases da divisão
meiótica;
16. Para facilitar a identificação das células em diferentes fases
da meiose, basta comparar as imagens obtidas ao
microscópio com aquelas apresentadas na Figura 3.
Figura 2: Coloração das anteras de milho – (A e B) Material
necessário para o preparo das lâminas; (C) Separação das anteras;
(D) Retirada das brácteas; (E) Coloração; (F) Dilaceração do tecido;
(G) Intensificação da ação do corante e (H) esmagamento do
material após a colocação da lamínula
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva e Renata da Rosa.
Figura 3: Fases da meiose – (A) Leptóteno; (B) Zigóteno; (C)
Paquíteno; (D) Diplóteno; (E) Diacinese; (F) Metáfase I; (G) Anáfase
I; (H) Telófase I – note, no meio da célula, o início da citocinese,
separando-a em duas; (I) Prófase II; (J) Metáfase II; (K) Anáfase II;
(L) Telófase II – em início da citocinese na célula esquerda; (M)
Citocinese e (N) Tétrades
Fonte: Elaborada por Carlos R. M. da Silva.
B����������� ��������
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A.
Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
MEIOSE EM TESTÍCULOS DE GAFANHOTO
Renata da Rosa
Raquel Bozini Gallo
Thayná Bisson Ferraz Lopes
I���������
A meiose éa divisão celular responsável pela formação dos
gametas. Nos animais, ela apresenta os mesmos estágios
encontrados nas células vegetais. Entretanto, os tecidos onde
ocorre são diferentes. Nos animais, a meiose acontece nos ovários
das fêmeas e nos testículos dos machos. Dentre os insetos, os
gafanhotos constituem um ótimo material para estudos meióticos em
células animais, pelo fato de muitas espécies desse grupo
possuírem um número pequeno de cromossomos (comumente 2n =
24), cromossomos grandes, além de apresentarem uma grande
quantidade de células em diferentes estágios da meiose. Esses
fatores em conjunto facilitam bastante os estudos citogenéticos.
Para esse tipo de análise, o ideal é que os meiócitos, ou seja, as
células em meiose, sejam obtidos de gafanhotos machos. Isso
porque os ovários das fêmeas possuem uma baixa taxa meiótica,
além de normalmente se apresentarem repletos de ovos com muito
vitelo, o que dificulta a análise dos cromossomos. Por esse motivo,
é importante saber identificar o tecido testicular dos machos e retirá-
los com muito cuidado, para que as células não sejam rompidas. Os
testículos estão posicionados lateralmente no abdome dos
gafanhotos, logo acima da inserção do último par de pernas. Eles
possuem uma coloração esbranquiçada e um formato semelhante a
um “cacho de bananas”.
Ademais, as condutas éticas quanto ao uso de animais devem
ser sempre seguidas. Por isso, antes de se eutanasiar um animal,
ele deve ser anestesiado para a retirada do tecido e, quando for o
caso, o restante das estruturas corporais deve ser descartado em
lixo hospitalar apropriado.
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Preparar lâminas a partir de testículo de gafanhoto para
identificação e observação das diferentes fases da meiose em
microscópio óptico convencional.
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Placas com cera ou isopor para fixar os insetos;
Soro ou solução fisiológica;
Solução fixadora (3 partes de álcool para 1 de ácido acético);
Corante orceína lacto-acética;
Ácido acético 60%;
Microscópio óptico;
Frascos de armazenamento, isqueiro, microtubos, lâminas,
lamínulas, estiletes, pinças, tesouras, alfinetes, seringas com
agulhas, placas de Petri, esmalte incolor, lupa, papel filtro,
papel sulfite e lápis.
A�������� I – R�������� �� ���������� �� ���������
Esta etapa pode fazer parte da atividade prática, ou então, ser
anterior a ela. Neste caso, os testículos poderão ser armazenados
em freezer até o momento do uso.
Procedimento
1. Material necessário: pinça, alfinetes, tesoura, microtubo,
solução fisiológica, solução fixadora e um suporte para fixar o
inseto, que pode ser uma placa com cera ou parafina (Figura
1A);
2. Anestesiar o gafanhoto, por meio de congelamento ou
eterização, para que este não sinta dor ou sofrimento durante
o procedimento;
3. Com o animal anestesiado, fixe-o com alfinetes na placa com
cera ou parafina (Figura 1B) e exponha o abdome (Figura
1C);
4. Com a tesoura, faça um corte longitudinal na região dorsal do
abdome (Figura 1D);
5. Fixe o tecido epidérmico com alfinetes para facilitar a
visualização dos testículos (Figura 1E);
6. Aplicar solução fisiológica suficiente para cobrir todos os
tecidos (Figura 1E), a fim de manter os tecidos nutridos;
7. Retirar os testículos com uma pinça (Figura 1F);
8. Colocá-los em um microtubo contendo solução fixadora
(Figura 1G), mantendo-os por 30 minutos (Figuras 2F e 2G);
9. Trocar a solução fixadora e repetir os passos 7 e 8 mais uma
vez (Figura 1H);
10. Armazenar o testículo em freezer a -20ºC, até o momento do
preparo das lâminas.
Figura 1: Procedimento para a retirada dos testículos de gafanhoto:
(A) Material necessário; (B) Fixação do inseto; (C) e (D) Exposição e
corte do abdome; (E) Fixação do tecido epidérmico e aplicação de
solução fisiológica; (F) e (G) Retirada e transferência dos testículos
e (H) Manutenção em solução fixadora
Fonte: Elaborada por Renata da Rosa.
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Esta etapa visa obter lâminas semipermanentes de células em
meiose para observação ao microscópio óptico. Sendo assim, é
preciso ter em mãos os testículos de gafanhotos previamente
extraídos e fixados.
Procedimento
1. Material necessário: pinça, seringas com agulhas, esmalte
incolor, isqueiro, testículos fixados, ácido acético 60%,
corante orceína lacto-acética, papel filtro, lápis, papel sulfite e
microscópio óptico;
2. Limpar lâminas e lamínulas;
3. Separar material para ser utilizado (Figura 2A);
4. Retirar os testículos do microtubo (Figura 2B);
5. Colocá-los sobre uma lâmina e retirar um único túbulo,
retornando o restante para o microtubo (Figura 2C);
6. Cobrir com ácido acético 60% por 10 minutos (Figura 2D),
evitando colocar uma gota muito grande (o excesso pode ser
retirado com um pedaço de papel filtro);
7. Com o auxílio de estiletes, dilacerar o material até que não se
veja algum tipo de grumo, evitando assim que as células
fiquem sobrepostas (Figura 2E);
8. Com o material dilacerado, pingar uma gota do corante
orceína lacto-acética e, com um isqueiro, esquentar
cuidadosamente para melhor fixação do corante (Figuras 2F e
2G);
9. Cobrir com uma lamínula (Figura 2H);
10. Envolver a lâmina com um pedaço de papel filtro dobrado ao
meio;
11. Apoiar com os dedos entre as duas extremidades da
lamínula, para que esta não se movimente e, com o polegar,
apertar para realizar o esmagamento das células (Figura 2I);
12. Vedar a lamínula com o esmalte incolor e esperar que este
seque (Figura 2J);
13. Observar ao microscópio óptico, procurando por células que
apresentem as diferentes fases da meiose;
14. Desenhar essas células, procurando destacar os aspectos
mais relevantes da meiose;
15. Ordenar as imagens, de acordo com as diferentes etapas da
divisão meiótica.
Figura 2: Procedimento para a coloração das células meióticas de
testículos de gafanhoto: (A) Material necessário; (B) Retirada dos
testículos do microtubo; (C) Transferência para uma lâmina; (D)
Colocação de ácido acético; (E) Dilaceração do tecido; (F)
Coloração; (G) Aquecimento; (H) Cobertura com lamínula; (I) Uso de
papel filtro para o esmagamento e retirada do excesso de corante e
(J) Vedação com esmalte incolor
Fonte: Elaborada por Renata da Rosa.
Observações
É importante preparar várias lâminas, pois é comum não se
encontrar todas as fases da meiose em uma única lâmina. Sendo
assim, os estudantes podem trocar as lâminas entre si, para que
consigam observar a maior quantidade de etapas desse processo
de divisão celular.
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1. Na Figura 3 são apresentadas algumas fases da meiose de
gafanhotos. Quais delas você encontrou nas lâminas que
preparou ou estudou? Quais são as características de cada
fase que você encontrou?
2. O que são quiasmas e em qual fase do ciclo de divisão
meiótico é possível identificá-los? Por quê?
3. Os gafanhotos possuem sistema de determinação sexual
XX/X0. Em quais das fases foi possível identificar os
cromossomos sexuais? Como eles aparecem?
4. Quais são as principais diferenças entre a meiose em células
vegetais e animais?
Figura 3: Algumas fases da divisão meiótica em gafanhotos: (A)
Interfase; (B) Prófase I – leptóteno; (C) Prófase I – zigóteno; (D)
Prófase I – paquíteno; (E) Prófase I – diplóteno; (F) Prófase I –
diacinese; (G) Metáfase I; (H) Metáfase II; (I) Anáfase II; (J)
Telófase. As setas indicam o cromossomo X
Fonte: Elaborada por Raquel Bozini Gallo e Thayná Bisson Ferraz Lopes.
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GUERRA, M.; SOUZA, M. J. Como observar cromossomos: um guia de técnicas
em citogenética vegetal, animal e humana. Ribeirão Preto: Fundação de
Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto, 2002.
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A.
Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
UNIDADE 2 - ESTUDOS
CARIOTÍPICOS
ANÁLISE CARIOTÍPICA E MONTAGEM DE
CARIÓTIPOS
Ana Lucia Dias
Carlos Roberto Maximiano da Silva
I���������A descrição das características do conjunto cromossômico de
uma espécie é denominada de cariótipo. Este conjunto de
cromossomos se originou na fecundação, quando duas células
haploides (n) se fusionam para formar uma célula diploide (2n). Com
isso, um organismo costuma possuir cada cromossomo em
duplicata. Cada espécie possui normalmente um cariótipo típico com
número e morfologia cromossômica próprios. O Quadro 1 mostra a
variação na quantidade de cromossomos observada em algumas
espécies de animais domésticos. Podemos perceber números
cromossômicos bastante próximos, como na cabra (2n = 60), no
asno (2n = 62) e no cavalo (2n = 64); idênticos, como no búfalo, no
gado e na cabra, todos com 2n = 60; ou, então, bastante
discrepantes, como no porco (2n = 38) e no cão (2n = 78).
Entretanto, isso é apenas uma pequena amostra do que pode ser
encontrado na natureza. Como exemplo de variação máxima
possível da quantidade de cromossomos em uma célula somática, o
nematoide parasita de cavalo, Parascaris univalens, possui apenas
2 cromossomos, contra os 1.260 cromossomos encontrados na
planta Ophioglossum reticulatum (Ophioglossaceae).
Quadro 1: Número cromossômico diploide (2n) para algumas
espécies de mamíferos
Nome comum Gênero e espécie 2n Nome comum Gênero e espécie 2n
Búfalo Bison bison 60 Cabra Capra hircus 60
Gato Felis catus 38 Cavalo Equus caballus 64
Gado Bos taurus/B. indicus 60 Humano Homo sapiens 46
Cão Canis familiaris 78 Porco Sus scrofa 38
Asno Equus asinus 62 Ovelha Ovis aries 54
Fonte: Elaborado pelos autores.
Caracterização dos cromossomos metafásicos
Cariótipo ou cariograma é a descrição clara e precisa das
características do conjunto cromossômico de uma determinada
espécie. A área da biologia que faz uso de estudos cariotípicos é
conhecida como citogenética. Para a caracterização e identificação
dos cariótipos, alguns aspectos dos cromossomos são observados.
Por exemplo, cada cromossomo mitótico apresenta uma região
estrangulada denominada centrômero ou constrição primária que é
um ponto de referência citológico básico e divide os cromossomos
em dois braços: p ou C para o braço curto e q ou L para o longo
(Figura 1). A princípio, as características mais evidentes de um
cariótipo são a posição do centrômero, bem como o número e o
tamanho dos cromossomos. Quanto à posição do centrômero, os
cromossomos podem ser classificados em: metacêntricos,
submetacêntricos, acrocêntricos e telocêntricos. Este parâmetro
pode ser definido numericamente por meio da chamada razão entre
braços (r = q/p), seguindo-se a regra presente na Figura 1.
Figura 1: Nomenclatura cromossômica, baseada no tamanho dos
seus braços curtos e longos
Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza
Com base na posição do centrômero e no tamanho dos
cromossomos estes são pareados dois a dois. Estes pares são
formandos por cromossomos do mesmo tamanho e com a mesma
posição de centrômero, sendo chamados de cromossomos
homólogos. A montagem de um cariótipo inicia-se pelos pares
maiores e que tenham uma mesma posição centromérica, e
termina-se com os pares menores, conforme exemplificado na
Figura 2. Para os organismos que têm cromossomos sexuais, tanto
os do sistema XX/XY quanto os do sistema ZZ/ZW, um dos sexos
não formará pares idênticos para tais cromossomos
(respectivamente, os machos no sistema XX/XY e as fêmeas no
sistema ZZ/ZW). Isso pode ser visto na Figura 2, onde o
cromossomo X não está pareado com o cromossomo Y, uma vez
que ambos são heteromorfos. Lembrando que os cromossomos não
sexuais são também chamados de autossomos.
Figura 2: Cariótipos de suínos (Sus scrofa; 2n = 38) fêmea e
macho, com dois cromossomos sexuais e 36 autossomos. Observe
os cromossomos sexuais, indicados como XX e XY
Fonte: Elaborada por Juceli Gonzalez Gouveia
Após a montagem do cariótipo, costuma-se fazer um esquema,
chamado de idiograma (Figura 3), para que os cromossomos sejam
melhores analisados e identificados, bem como para anotar
alterações ou regiões de interesse nestes.
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Demonstrar como os cromossomos de uma ou mais espécies
são analisados e classificados.
M�������
Uma cópia das fotografias de metáfases de diferentes
espécies, disponíveis nos Apêndices para cada estudante ou
grupo de estudantes;
Papel sulfite para montagem dos cariótipos;
Tesoura e cola em bastão.
Figura 3: Idiograma de suínos (Sus scrofa; 2n = 38) fêmea (A) e
macho (B). Compare o idiograma com o cariograma apresentado
anteriormente
Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza e Carlos R. M. da Silva
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Essa atividade pode ser feita individualmente ou em grupo, da
seguinte maneira:
1. Recortar os cromossomos, um a um (de cada animal em
separado) e ordená-los de acordo com o tamanho (do maior
ao menor) e semelhança morfológica (posição do centrômero
e tamanho de braços);
2. Classificar os cromossomos, seguindo a nomenclatura
cromossômica descrita na Figura 1;
3. Se os cromossomos sexuais puderem ser reconhecidos,
colocá-los separados, por último;
4. Depois de organizado, colar os cromossomos no sulfite,
seguindo o modelo organizacional apresentado na Figura 2;
5. Quando possível, classificar os cariótipos de acordo com o
sexo cromossômico.
Q������� � ����� �����������
1. Qual seria o número diploide de cada espécie analisada?
2. Identifique os cariótipos de acordo com o sexo cromossômico
e dê a constituição cromossômica (número de automossomos
e cromossomos sexuais) de cada um.
3. Diferencie cada espécie em relação aos tipos cromossômicos
(forma e quantidade).
B����������� ��������
GODAY, C.; PIMPINELLI, S. Cytological analysis of chromosomes in the two
species Parascaris univalens and P. equorum. Chromosoma, v. 94, n. 1, p. 1-10,
1986.
GUERRA, M. Introdução à citogenética geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
1988.
NICHOLAS, F. W. Introdução à genética veterinária. Porto Alegre: ARTMED,
1999.
PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A.
Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 6. ed. Tradução de
Cláudia Lúcia Caetano de Araújo. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
APÊNDICES
Fonte: Elaborado por Mariana Campaner Usso e Fábio Hiroshi Takagui.
Fonte: Elaborado por Juceli Gonzalez Gouveia.
CITOGENÉTICA HUMANA
Wagner José Martins Paiva
Maria Eliane Longhi Barroso
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A citogenética humana é o estudo dos cromossomos humanos
por meio de sua estrutura e herança, organizado em um cariótipo.
Cariótipo, termo originário do grego karyon (κόμβου) = “nó” e typos
(τύπου) = tipo, é uma representação de forma clara e precisa das
características do conjunto cromossômico de uma espécie. Utiliza-
se cariótipos em estudos de comparação da constituição
cromossômica das espécies, para examinar a variação entre
indivíduos de uma mesma espécie, para estudos evolutivos, dentre
outras aplicações. No Homo sapiens, o cariótipo é essencial como
diagnóstico relacionado às alterações numéricas e estruturais dos
cromossomos, bem como no diagnóstico pré-implantação, pré-natal
e na citogenética do câncer. Portanto, em um cariótipo, procura-se
representar a disposição dos cromossomos em pares homólogos de
forma sistemática para descrever o complemento cromossômico,
normal ou anormal, de um indivíduo, de um tecido ou de uma
linhagem celular.
A citogenética humana se inicia com Flemming, em 1882. No
entanto, somente a partir da década de 1950 é que este campo de
pesquisa se desenvolveu, quando Tjio e Levan (1956) verificaram
que o número correto de cromossomos da espécie humana era de
46 cromossomos nas células diploides e não 48 cromossomos como
apontavam estudos anteriores. A mesma dupla observou que a
colchicina impedia a progressão da célula além da metáfase e que
uma solução hipotônica permitia o espalhamento dos cromossomos
na célula metafásica nas lâminas de microscopia. Outros fatores
que incrementaram a citogenética foram o desenvolvimento do
método de cultura de leucócitos periféricos por Moorhead et al.
(1960) e a utilização dafito-hemaglutinina, um agente mitogênico
sobre estas células, conforme descrito por Nowel (1960). Com estas
técnicas estabelecidas, foi possível organizar os cromossomos
humanos em diferentes grupos, baseados em seu tamanho e
localização do centrômero. Isso facilitou a sua contagem e
identificação, bem como a detecção de aberrações cromossômicas
numéricas, como a trissomia 21 na síndrome de Down (LEJEUNE;
GAUTIER; TURPIN, 1959), 45,X0 na síndrome de Turner (FORD et
al., 1959), 47,XXY na síndrome de Klinefelter (JACOBS; STRONG,
1959), trissomia 13 (PATAU et al., 1960) e trissomia 18 (EDWARDS
et al., 1960). A primeira descrição de uma anomalia envolvendo uma
aberração estrutural foi o caso hoje chamado de cromossomo
Filadélfia, envolvendo os cromossomos 9 e 22. Este foi visto em um
paciente com leucemia mieloide crônica (NOWELL;
HUNGERFORD, 1960).
A análise citogenética foi melhorada com o desenvolvimento de
protocolos de coloração descritos inicialmente por Caspersson,
Zech e Johansson (1970), que apresentavam o bandamento por
utilização de Quinacrina fluorescente (Banda Q), o que permitiu a
diferenciação dos cromossomos do mesmo grupo. Posteriormente,
outras técnicas de coloração foram desenvolvidas, como o
bandamento G, R, C e NOR, cada uma com suas propriedades e
aplicações peculiares. Estes padrões de bandas são semelhantes a
códigos de barras que permitem aos citogeneticistas identificar
cromossomos, detectar sutis deleções, inversões, inserções,
translocações, locais frágeis e outros rearranjos mais complexos.
Atualmente, o mais utilizado é o bandamento G, por seu custo e
eficiência.
Quanto a organização do cariótipo humano, os cromossomos
metafásicos foram classificados primeiramente em sete grupos, por
sugestão de Patau na Conferência de Denver em 1960 e posteriores
revisões nas Conferências de Londres em 1963 e Chicago, em
1966. Várias revisões ocorreram até que, em 1978, foi estabelecido
“O Sistema Internacional de Nomenclatura em Citogenética
Humana” (ISCN) que teve sua última revisão em 2012 em Seattle,
EUA, resultando no ISCN (2013) que estabelece os atuais
parâmetros da citogenética humana.
O� ������� ������������
Os cromossomos metafásicos constituem o melhor material para
os estudos cariotípicos devido ao seu elevado grau de
condensação. Esta característica facilita a observação tanto de
cromátides como da posição dos centrômeros. Um fator importante
nos estudos citogenéticos é a utilização de células oriundas de um
tecido com alto índice mitótico que levarão a um bom número de
metáfases analisáveis. O cariótipo pode representar o conjunto de
cromossomos somáticos (2n) ou gaméticos (n) da espécie, podendo
ser apresentado na forma de cariograma ou idiograma. O
cariograma é construído a partir da imagem de uma metáfase real
em que todos os cromossomos estejam bem corados e
individualizados, conforme o bandamento utilizado. O termo
idiograma é reservado para a representação esquemática do
cariótipo “ideal”, utilizando valores médios da posição do centrômero
e o tamanho de cada cromossomo do conjunto haploide. Na
construção de um cariótipo, os cromossomos metafásicos dessa
imagem são emparelhados. Após a análise visual, estes são
enumerados em uma ordem determinada e, no caso humano,
divididos e classificados em 7 grupos (A-G), mais os cromossomos
sexuais, conforme demonstrado na Figura 1. Isto pode ser feito
manualmente, recortando-se os cromossomos dessa imagem, ou a
partir de softwares especiais. O número cromossômico dentro de
uma espécie é, geralmente, constante e, no caso humano, o número
diploide (2n) é de 46 cromossomos.
O tamanho dos cromossomos metafásicos varia de
aproximadamente 0,5 μm até cerca de 36 μm em todos os
eucariotos. O tamanho médio na maioria das espécies é de
aproximadamente 5 a 6 μm. O tamanho cromossômico pode ser
caracterizado pela porcentagem de cada cromossomo em relação à
extensão total do conjunto haploide. De acordo com a posição do
centrômero, os cromossomos podem ser classificados em:
metacêntrico, submetacêntrico, acrocêntrico e telocêntrico (não
existente na espécie humana), conforme o tamanho dos braços do
cromossomo. Esta posição centromérica pode ser definida
numericamente pela razão de braços (r) e pelo índice centromérico
(ic), conforme as equações abaixo:
r =
q
e ic =
p x 100
p p + q
onde, p = comprimento do braço curto e q = comprimento do braço
longo, ambos em μm.
Consequentemente, os cromossomos são agrupados em:
Cromossomo r ic
Metacêntrico 1,00 – 1,49 50,0 – 40,1
Submetacêntrico 1,50 – 2,99 40,0 – 25,1
Acrocêntrico 3,00 – ∞ 25,0 – 0,01
Telocêntrico ∞ 0
Fonte: Elaborado pelos autores.
Figura 1: Cariótipo idealizado com um idiograma e um cromossomo
normal corado (CTG). Note que há a formação de par entre o
idiograma e a foto cromossômica real e que, no total, são
apresentados 48 pares e não 46, pelo fato de estarem
representados os dois cromossomos sexuais. Consequentemente,
em um cariótipo normal, indivíduos do sexo masculino terão 22
pares autossômicos e, nos cromossomos sexuais, um cromossomo
X e um Y. Por sua vez, indivíduos do sexo feminino terão 22 pares
autossômicos e, nos cromossomos sexuais, dois cromossomos X
Fonte: Elaborada por Wagner J. M. Paiva
C������������ ��� ����������� ������� ��� ����������
G
O bandamento G é atualmente o método de diferenciação dos
cromossomos mais utilizado nos laboratórios de citogenética
humana. Neste método, após a obtenção das lâminas com as
metáfases, se realiza um tratamento com tripsina e posterior
coloração com Giemsa (GTG banding: G-bands by trypsin using
Giemsa). Nesta técnica de bandamento, obtêm-se bandas claras e
escuras. As claras compreendem regiões ricas em GC e as escuras,
em AT. Isso é semelhante ao obtido com o bandamento Q, porém,
com um risco e custo bem menor ao laboratório. Na descrição da
coloração obtida, as regiões e bandas cromossômicas são
numeradas do centrômero para o telômero (Telômero ←
Centrômero → Telômero), conforme exemplificado na Figura 2.
Assim, região é área do cromossomo localizada entre 2 bandas
marcadoras adjacentes e banda é a parte do cromossomo que se
distingue dos segmentos adjacentes por ser mais clara (negativa) ou
mais escura dentro de uma região. Um braço que não tenha banda
marcadora consistente é constituído apenas por uma região.
Figura 2: Nomenclatura utilizada para se referir a uma determinada
região cromossômica
Fonte: Elaborada por Wagner J. M. Paiva
Para designar a localização da região e da banda, quatro itens
são necessários: (1) o número do cromossomo, (2) o símbolo do
braço, (3) o número da região e (4) o número da banda dentro
dessa região. Esses dados são colocados sem espaçamento ou
pontuação. Se houver a subdivisão de uma banda, um ponto
decimal é posto após a designação da banda original, seguido pelo
número atribuído a cada sub-banda. Por exemplo, no caso da região
9p21 (Figura 2), se 9p21 for subdividida, as sub-bandas serão
denominadas 9p21.1, 9p21.2 e 9p21.3, sendo que a sub-banda
9p21.1 é proximal ao centrômero e a 9p21.3 distal, de acordo com o
ISCN (2013). Dessa forma, os cromossomos humanos são
agrupados em A, B, C, D, E, F e Sexuais em um cariótipo normal
(hipotético), considerando-se as suas características individuais, tais
como o tamanho, posição do centrômero e padrão de bandamento
GTG (Figura 1).
A seguir, são apresentadas as características dos cromossomos
humanos quando feito o bandamento CTG e a tipificação das suas
regiões e bandas. São dadas as características gerais do grupo,
cromossomo e seus braços, bem como suas regiões e bandas em
um total mediano de 400 a 450 bandas cromossômicas. Os valores
entre parêntesis indicam o total de regiões presentes em cada braço
cromossômico:
Grupo A – apresenta os maiores cromossomos
do cariótipo humano
Cromossomo 1 – o maior cromossomo da espécie:
p(3): Região 1 com banda pequena e intensidade de coloração média próxima ao
centrômero, seguida por banda negativa. Região 2 com banda de tamanho médio,
mais corada e com uma banda negativa maior.Região 3 com banda escura e
mais 3 bandas pouco coradas, intercaladas por 4 bandas negativas.
q(4): Região 1 com banda escura abaixo do centrômero de tamanho variável
(devido a heterocromatina). Região 2 com uma banda pouco corada e intercalada
por 2 negativas maiores. Região 3 com banda escura de tamanho médio seguida
de uma negativa. Região 4 com banda de coloração média seguida de negativa e
banda menor, próxima ao telômero.
Cromossomo 2 – o segundo maior cromossomo da espécie e o
maior submetacêntrico:
p(2): Região 1 com banda negativa próxima ao centrômero, seguida por banda
escura, pequena e coloração média e, novamente banda negativa e outra escura.
Região 2 com banda clara e outra média, intercaladas por 3 bandas negativas.
q(4): Região 1 com banda negativa seguida de outra de intensidade clara. Região
2 inicia-se com banda negativa seguida por banda escura. Região 3 tem 2 bandas
escuras intercaladas por 3 bandas negativas.
Cromossomo 3 – o terceiro maior cromossomo humano e no
qual as bandas podem parecer simétricas:
p(2): Região 1 com banda escura junto ao centrômero, seguida por banda
negativa e outra menos corada. Região 2 com 2 bandas negativas
intercaladas por uma banda escura e, no final, outra banda escura junto ao
telômero.
q(2): Região 1 com banda negativa logo abaixo do centrômero de tamanho
variável, seguida de banda escura. Região 2 com duas bandas escuras e
outra clara, intercaladas por 4 bandas negativas.
Grupo B – os cromossomos são
submetacêntricos bem acentuados
Cromossomo 4 – submetacêntrico, onde o braço curto é bem
menor e, em geral, é mais escuro:
p(1): Região 1 com banda escura entre duas bandas negativas.
q(2): Região 1 com uma banda negativa junto ao centrômero seguida de
banda escura. Região 2 constituída de duas bandas negativas seguida de
duas bandas escuras, alternadamente. Região 3 com banda escura entre
duas bandas negativas.
Cromossomo 5 – submetacêntrico, onde o braço curto é bem
menor; ligeiramente mais claro que o cromossomo 4:
p(1): Região 1 com banda clara junto ao centrômero e, posteriormente,
uma banda escura entre outra banda negativa.
q(3): Região 1 com uma banda escura entre duas bandas negativas.
Região 2 com uma banda escura contígua à região 1 e à banda quatro,
seguida de uma banda negativa e outra corada. Região 3 com duas
bandas negativas intercaladas por uma banda corada.
Grupo C – maior grupo de cromossomos, sendo
todos submetacêntricos de tamanho médio
Cromossomo 6 – o maior do grupo, com quatro bandas
escuras evidentes no braço q:
p(2): Região 1 com uma única banda escura próxima ao centrômero. Região 2
com 3 bandas negativas intercaladas por banda escura e outra mais clara
próxima ao telômero.
q(2): Região 1 com duas bandas escuras separadas por banda negativa. Região
2 com três bandas negativas intercaladas por duas bandas coradas, sendo uma
de coloração escura e outra média, em sequência.
Cromossomo 7 – o segundo maior do grupo, com banda bem
característica próxima ao telômero no braço p:
p(2): Região 1 com banda escura e fina junto ao centrômero e outra
também fina, intercaladas por duas bandas negativas. Região 2 de
coloração média seguida de banda negativa terminal.
q(3): Região 1 com banda negativa média junto ao centrômero. Região 2
uma banda escura e tamanho médio, e uma negativa em sequência.
Região 3 com banda média de cor escura e uma banda clara, intercaladas
entre bandas negativas.
Cromossomo 8 – apresenta bandas escuras e finas:
p(2): Região 1 com banda negativa junto ao centrômero, seguida de
banda de coloração clara e fina. Região 2 com banda clara e fina entre
duas bandas negativas.
q(2): Região 1 com duas bandas negativas entre uma banda fina de
coloração média. Região 2 com duas bandas escuras sendo a última,
ligeiramente, maior e mais escura, entremeadas por uma banda negativa,
que também ocorre após a última banda escura de tamanho relativamente
grande.
Cromossomo 9 – próximo ao centrômero, apresenta uma
região de heterocromatina de tamanho variável de
características herdáveis:
p(2): Região 1 com banda curta e coloração de intensidade média próxima
ao centrômero e uma banda negativa. Região 2 com banda escura e outra
mais difusa, intercaladas por duas bandas negativas, sendo a última até o
telômero.
q(3): Região 1 com banda clara de tamanho variável desde o centrômero
(devido a heterocromatina), seguida por banda negativa. Região 2 com
duas bandas escuras entremeadas por uma banda negativa, seguidas de
banda negativa terminal.
Cromossomo 10 – apresenta bandas escuras e claras e um
braço q bem característico, com bandas bem claras:
p(1): Região 1 com três bandas negativas, intercaladas por uma de
coloração clara média e outra muito clara.
q(2): Região 1 com uma banda negativa junto ao centrômero. Região 2
com banda escura e espessa, seguida de outras duas bandas escuras e
finas entre três bandas negativas.
Cromossomo 11 – apresenta duas bandas escuras bem
definidas em cada braço dos cromossomos:
p(1): Região 1 com banda escura em meio a duas bandas negativas.
q(2): Região 1 com uma banda fina e escura junto ao centrômero, seguida
de banda negativa e outra escura e grande. Região 2 com uma banda
negativa grande, seguida de uma banda clara e fina e outra banda negativa
fina.
Cromossomo 12 – o braço p é bem menor do que o q:
p(1): Região 1 apresenta uma banda escura centralizada entre duas
bandas negativas.
q(2): Região 1 apresenta uma banda escura e fina, contígua ao
centrômero, seguida de uma banda negativa de tamanho médio, uma
banda de coloração mediana e outra negativa bem fina. Região 2 com
uma banda média e escura seguida de banda negativa grande, depois
banda clara e fina seguida de banda negativa terminal.
Grupo D – cromossomos acrocêntricos e com
satélites nos seus braços curtos
Cromossomo 13 – com duas bandas escuras bem
características e centrômero bem corado:
p(1): Região 1 pouco corada sendo, em grande parte, possível observar os
satélites mais corados.
q(3): Região 1 com banda fina e clara entre duas bandas negativas.
Região 2 com uma banda escura e outra negativa. Na Região 3,
novamente uma banda escura e outra negativa, esta última sendo terminal.
Cromossomo 14 – apresenta duas bandas escuras bem
características e centrômero com coloração mediana:
p(1): Região 1 pouco corada e em grande parte é possível observar os satélites
mais corados, de modo semelhante ao cromossomo 13.
q(3): Região 1 inicia-se com banda negativa e banda escura, conseguinte à
região 2. Região 2 inicia com a região 1 em uma banda escura (existe a
possibilidade de visualizar uma separação se houver maior distensão
cromossômica) e segue com uma banda negativa bem fina, uma banda clara
também bem fina e depois outra banda negativa maior. Região 3 tem início com
uma banda escura pequena e uma banda negativa terminal.
Cromossomo 15 – apresenta, como um todo, pouca coloração:
p(1): Região 1 pouco corada e, em grande parte, é possível observar os
satélites mais corados de modo semelhante aos cromossomos 13 e 14.
q(2): Região 1 com banda fina e coloração média entre duas bandas
negativas. Região 2 apresenta banda estreita de média coloração entre
duas bandas negativas, seguida de uma banda clara, outra banda negativa
maior, uma banda clara bem fina e uma banda de coloração média fina,
tendo entre si uma banda negativa e junto ao telômero, outra banda
negativa.
Grupo E – todos submetacêntricos
Cromossomo 16 – submetacêntrico, no entanto, devido a
variação de região heterocromática muitas vezes parece
metacêntrico:
p(1): Região 1 é única com três bandas negativas intercaladas por duas
bandas claras e finas.
q(2): Região 1 com banda escura próxima ao centrômero de tamanho
variável, seguida de uma banda negativa. Região 2 com banda escura de
tamanho médio entre duas bandas negativas.
Cromossomo 17 – um pouco menor que o 16, com menos
bandas e coloração menos intensa:
p(1): Única região, apresenta uma banda clara e estreita entre duas
bandas negativas.
q(2): Região 1 com banda negativa e outra clara efina, próximas ao
centrômero. Região 2 com banda negativa grande, seguida de banda
escura e depois outra banda negativa terminal.
Cromossomo 18 – o menor do grupo, sendo submetacêntrico e
bem acentuado:
p(1): Braço com uma única região, com banda negativa ocupando-o quase
todo e com uma banda junto ao telômero, clara e fina.
q(2): Região 1 com banda fina negativa, seguida de banda escura
mediana. Região 2 com banda negativa grande, uma escura mediana,
seguida de outra banda negativa terminal, bem fina.
Grupo F – metacêntricos pequenos, ligeiramente
menores que o cromossomo 18 e pouco maiores
que os cromossomos do grupo G
Cromossomo 19 – apresenta uma banda escura em torno do
centrômero e bandas negativas em quase toda extensão dos
dois braços, sendo o restante pouco corado:
p(1): Banda negativa em quase toda extensão do braço sendo, às vezes,
difícil a sua visualização.
q(1): Banda negativa em quase toda extensão do braço, seguido de uma
banda clara junto ao telômero.
Cromossomo 20 – muito semelhante ao 19, no entanto,
apresenta bandas mais evidentes:
p(1): Braço com uma região, com banda de tamanho e coloração mediana,
intercalada por duas bandas negativas.
q(1): Única região com uma banda negativa grande, seguida de banda
clara e outra banda negativa terminal.
Grupo G – acrocêntricos pequenos (os menores
da espécie) e com satélites no braço p
Cromossomo 21 – tem uma banda escura em torno do
centrômero e bandas negativas em quase toda extensão dos
dois braços:
p(1): Uma única região que apresenta variação de tamanho e intensidade
de coloração, com os satélites as vezes mais corados.
q(2): Região 1 constituída de banda negativa fina próxima ao centrômero e
região 2 com banda mediana e escura seguida por banda negativa grande
e terminal.
Cromossomo 22 – composto quase que totalmente por bandas
negativas:
p(1): A única região presente tem variação de tamanho e coloração com
os satélites as vezes mais corados.
q(1): Região com apenas com uma banda clara e fina entre duas bandas
negativas.
Sexuais – dois cromossomos que podem ser
pares homólogos (2 cromossomos X) ou não
homólogos (1 cromossomo X e um Y) no sexo
heterogamético:
Cromossomo X – de tamanho semelhante aos cromossomos
do grupo C e com 3 bandas escuras bem características:
p(2): Região 1 é uma banda negativa próxima ao centrômero. Região 2
com banda média e escura bem marcada e outra de coloração média,
intercaladas entre bandas negativas.
q(2): Região 1 com banda negativa junto ao centrômero. Região 2 com
banda mediana e escura bem evidente, seguida de banda negativa
grande, uma banda escura e outra banda negativa terminal.
Cromossomo Y – acrocêntrico e ligeiramente maior que os
cromossomos do grupo G. Normalmente não apresenta satélite
no seu braço curto, como os cromossomos 21 e 22. Tem um
tamanho variável entre os indivíduos, mas é constante em um
mesmo indivíduo:
p(1): Única região, com banda negativa mediana seguida de banda de
coloração média e bem fina junto ao telômero.
q(1): Braço com única região que inicia com bandas finas, sendo uma de
coloração negativa e outra mediana. Depois apresenta outra banda
negativa seguida de banda escura até o telômero, que é de tamanho
variável, conforme o indivíduo.
O�������
Introduzir elementos básicos da classificação dos cromossomos
humanos e da montagem de um cariótipo com o método mais usual
dentro dos serviços de aconselhamento genético.
M�������
Uma cópia das Fotografias de metáfases humanas,
disponíveis nos Apêndices para cada estudante ou grupo de
estudantes;
Papel sulfite para montagem dos cariótipos;
Tesoura e cola em bastão.
P�����������
Essa atividade pode ser realizada individualmente ou em grupo,
da seguinte maneira:
1. Preparar as folhas de sulfite para a montagem do cariograma,
visando a identificação de cada par cromossômico dentro de
cada grupo, conforme modelo da Figura 1;
2. Classificar os cromossomos de cada metáfase, conforme as
regras do ISCN 2013, descritas no item “Classificação dos
cromossomos humanos via bandamento G”;
3. Recortar os cromossomos e colá-los na sua posição
correspondente no cariograma.
Q������� � ����� �����������
1. Quantos cromossomos foram identificados em cada
metáfase?
2. Os cariótipos montados correspondem a indivíduos do sexo
masculino ou feminino?
3. Os cariótipos correspondem a uma pessoa citogeneticamente
normal? Como você chegou a essa conclusão?
4. Qual seria o diagnóstico para os cariótipos considerados
anormais? Quais as características clínicas (físicas e
neuropsicológicas) dos indivíduos que apresentarem tais
resultados?
P��� ���������
1. Discuta qual foi a maior dificuldade encontrada na
classificação dos cromossomos.
2. Qual a importância das modernas técnicas de identificação
dos cromossomos?
3. Qual a importância em se identificar indivíduos afetados por
alterações citogenéticas?
4. Além dos achados citogenéticos proporcionados por esta
prática, existem outras alterações citogenéticas registradas
pela literatura?
B����������� ��������
CASPERSSON, T.; ZECH, L.; JOHANSSON, C. Differential binding of alkylating
fluorochromes in human chromosomes. Experimental Cell Resarch, v. 60, n. 3, p.
315-319, 1970.
EDWARDS, J. H.; HARNDEN, D. G.; CAMERON, A. H; CROSSE, V. M.; WOLFF,
O.H. A new trisomic syndrome. Lancet, v.1, n.7128, p. 787-790, 09 Apr. 1960.
FORD, C. E.; JONES, K. W.; POLANI, P. E.; DE ALMEIDA, J. C.; BRIGGS J. H. A
sex-chromosome anomaly in a case of gonadal dysgenesis (Turner’s syndrome).
Lancet, v.1, n.7075, p. 711-713, 04 Apr. 1959.
JACOBS, P. A.; STRONG, J. A. A case of human intersexuality having possible
XXY sex-determining mechanism. Nature, v. 2, p. 164-167, 1959.
LEJEUNE, J.; GAUTIER, M.; TURPIN, R. Etude des chromosomes somatiques de
neuf enfants mongoliens. Comptes Rendus Academies des Sciences, Paris, v.
248, p. 1721-1722, 1959.
MOORHEAD, O. P.; NOWELL, P. C.; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M.
HUNGERFORD, D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from
human peripheral blood. Experimental Cell Research, v. 20, n.3, p. 613-16.1960.
NOWEL, P. C. Phytohaemagglutinin: An initiator of mitosis in cultures of normal
human leukocytes. Cancer Research, v. 20, p. 462-466, 1960.
NOWELL, P. C.; HUNGERFORD, D. A. A minute chromosome in human
granulocytic leukemia. Science, v. 142, p. 1497, 1960.
PATAU, K.; SMITH, D. W.; THERMAN, E.; INHORN, S. L. WAGNER, H. P. Multiple
congenital anomaly caused by an extra autosome. Lancet, v.1, n. 7128, p. 790-
793, 09 Apr. 1960.
SHAFFER, L. G.; McGOWAN-JORDAN, J.; SCHMID, M. (Ed.). ISCN 2013: An
International System for Human Cytogenetics Nomenclature. Basel: Karger, 2013.
TJIO, J. H.; LEVAN, A. The chromosome number of man. Hereditas, v. 45, p. 1-6,
1956.
APÊNDICES
Fonte: Elaborados por Wagner J. M. Paiva e Maria E. L. Barroso.
UNIDADE 3 - BIOLOGIA MOLECULAR
CONSTRUINDO UM MOLDE DA MOLÉCULA DE
DNA
Rogério Fernandes de Souza
Fernanda Simões de Almeida
Leda Maria Koelblinger Sodré
I���������
A vida é caracterizada por uma extraordinária diversidade, mas
as instruções codificantes de todos os organismos vivos estão
escritas a mesma linguagem genética – a dos ácidos nucleicos. O
Ácido Desoxirribonucleico ou simplesmente DNA é a molécula dos
seres vivos para armazenar e transmitir as informações genéticas
que orientarão a estruturação e o funcionamento do organismo. O
DNA é um polímero de unidades estruturais chamadas
nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por um grupamento
fosfato, um açúcar (desoxirribose) e uma base nitrogenada
(adenina, timina, guanina ou citosina). Os nucleotídeos são unidos
covalentemente entre si para a formação de cada fita da molécula
de DNA. Isso ocorre por meio de ligações fosfodiéster, nas quais um
grupamento fosfato une o átomo de carbono 5’ de uma pentose com
o carbono 3’ de uma outra. E as duas fitas são estabilizadas a partir
de ligações de hidrogênio que se formam entre as bases
nitrogenadas: adenina pareando-se com a timina e citosina
pareando-se com a guanina. O DNA consiste em doisfilamentos
nucleotídicos que se helicoidizam um ao redor do outro para formar
uma dupla-hélice. Os açúcares e fosfatos ficam do lado externo da
hélice, e as bases ficam empilhadas no interior. Os dois filamentos
têm polaridade inversa e são complementares, unidos por pontes de
hidrogênio entre as bases nitrogenadas de cada filamento.
O�������
Construir um molde didático tridimensional da molécula de DNA
para permitir que os estudantes consigam perceber os principais
aspectos relacionados à estrutura e ao papel dessa molécula no
armazenamento e transmissão da informação genética.
M�������
Uma cópia dos moldes de pares de bases (A-T = Adenina-
Timina) e (G-C = Guanina-Citosina), disponíveis nos
Apêndices, para cada grupo de estudantes;
Canudos plásticos de refresco (de uma única cor para cada
molécula);
Cordonê ou barbante fino;
Palitos de madeira para picolé;
Cola branca ou em bastão;
Fita crepe;
Furadeira elétrica com broca pequena para madeira (7/64 ou
4,0 mm);
Tesoura ou estilete;
Papel sulfite colorido (duas cores).
P��������� � ���������
A quantidade de material apresentada a seguir permite a
construção de um molde da molécula de DNA. O professor deverá
calcular a quantidade de material a ser preparado de acordo com o
número de equipes e proceder da seguinte maneira:
1. Separar 12 palitos de sorvete, amontoá-los em grupos de 6
palitos, passar uma fita crepe nas duas bordas para mantê-
los unidos e para diminuir o risco de esses serem partidos
durante a perfuração;
2. Com o auxílio de uma furadeira elétrica com broca para
madeira, fazer um furo próximo a cada ponta dos palitos de
sorvete, para permitir que o molde seja montado;
3. Para ajudar a diferenciar os pares de nucleotídeos, o molde
A-T pode ser impresso ou xerocado em uma cor de sulfite e o
molde G-C em uma outra cor.
P�����������
Essa prática deve ser realizada por diferentes grupos de
estudantes, a fim de que estes possam comparar as semelhanças e
diferenças (em termos de sequências nucleotídicas) entre os moldes
construídos. Pode-se pedir, inclusive, que estes transcrevam e
traduzam as suas moléculas de DNA.
1. Recortar os moldes A-T e G-C nas regiões indicadas;
2. Cortar os canudos de refresco em pedaços iguais de 3,5 cm;
3. Cortar duas tiras de aproximadamente 1,5 m de barbante e
fazer um nó em uma das pontas de cada tira;
4. Dobrar um molde (A-T ou G-C) na região pontilhada e colar
em um palito de sorvete, conforme demonstrado na Figura
1(A), de modo a permitir que um mesmo par de bases possa
ser visto dos dois lados;
Figura 1: Forma de montagem do molde de DNA: (A) Dobrar cada
molde de bases nitrogenadas na região pontilhada, indicada pelas
setas, e colar em um palito de sorvete. (B) Montar o molde de DNA,
usando o barbante, os canudinhos de refresco e os moldes colados
nos palitos de sorvete
Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza.
1. Passar cada uma das tiras de barbante em um dos furos de
um palito de sorvete que não tenha nenhum molde colado, de
acordo com o esquema da Figura 1(B)
2. Enfiar um pedaço de canudo em cada barbante, seguido de
um palito de sorvete com o molde colado, repetindo esse
procedimento até acabarem todos os moldes;
3. Finalizar com um canudo e um palito de sorvete sem nenhum
molde, fazendo um nó em cada fita de barbante;
4. Usar os dois palitos das pontas (sem moldes) como apoio
para demonstrar como a molécula de DNA se dobra (com giro
para a direita) para formar a dupla hélice.
Q������� � ����� �����������
1. A estrutura montada é baseada no modelo de Watson e
Crick, proposto em 1953. Olhando para ela quais são as
principais conclusões que se pode tirar sobre o modelo de
duplo filamento da molécula de DNA?
2. Comparando o modelo construído com os de seus colegas,
em que ele é diferente?
3. Observando a molécula construída discuta onde estaria
contida a informação genética?
4. Considerando que cada molécula construída pelos grupos
seja um gene, como poderia ser a definição, a esse nível, do
que seria um gene?
B����������� ��������
PIERCE, B. A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Tradução de Paulo A.
Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 6. ed. Tradução de
Cláudia Lúcia Caetano de Araújo. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
APÊNDICES
Fonte: Elaborado por
Rogério F. de Souza.
Fonte: Elaborado por Rogério F. de Souza.
UNIDADE 4 - GENÉTICA QUALITATIVA
E QUANTITATIVA
NOÇÕES DE PROBABILIDADE APLICADA À
GENÉTICA
Rogério Fernandes de Souza
I���������
Qual seria a chance de alguém ser atingido por um meteorito ou
de ganhar na loteria? Ou de Maíra e João, que tiveram meninas nas
três primeiras gestações, venham a ter agora um menino, na sua
quarta gravidez, conforme representado no heredograma da Figura
1? Esses exemplos, embora tão distintos, compartilham uma coisa
em comum: eles envolvem situações futuras para as quais ainda
não sabemos os resultados e que poderão acontecer pelo menos de
duas maneiras diferentes. Mas, seria possível determinar com
exatidão a chance de ocorrência de cada um desses eventos? Bem,
existe uma área da ciência, chamada de Estatística, que se utiliza
de teorias probabilísticas para calcular a possibilidade que eventos
como esses, que ocorrem de uma maneira regular, venham a se
repetir no futuro.
Figura 1: João e Maíra tiveram três filhas. Qual seria a
probabilidade da quarta criança ser um menino?
Fonte: Elaborada por Rogério F. de Souza.
Mas, o que seriam as teorias probabilísticas e como elas podem
responder a tais tipos de questões? Do Latim probare =
provar/testar, probabilidade é a palavra usada em estatística para se
referir a situações que podem ter diferentes resultados. E o que
sorte e azar têm a ver com probabilidade? Bem, de um modo geral
chamamos de sorte quando obtemos um resultado que nos é
vantajoso, como ganhar na loteria. Por outro lado, se nos for nocivo,
como nascermos com uma doença hereditária, falamos de azar.
Acontece que as teorias probabilísticas usadas pelos estatísticos
são ferramentas muito úteis justamente porque permitem que
calculemos a chance de termos sorte ou azar em uma série de
situações. E embora, à primeira vista, elas pareçam complicadas ou
deem a impressão de que servem apenas para resolver coisas sem
muita importância, como determinarmos a chance de alguém ser
atingido por um meteorito, elas estão definitivamente inseridas na
nossa sociedade. Das análises feitas em uma previsão eleitoral,
passando pelo lançamento de satélites em órbita da Terra até os
testes de eficiência de novos medicamentos para o combate ao
câncer, tudo isso é apoiado por cálculos probabilísticos e por testes
estatísticos. E, embora não resolvam o nosso problema de origem
hereditária, elas podem nos ajudar mostrando, por exemplo, quais
serão os riscos de passarmos essa mesma característica para os
nossos descendentes. Ou seja, as teorias probabilísticas e a
estatística nos ajudam nas tomadas de decisões. Em determinadas
áreas da genética, ter esse tipo de informação é uma questão
crucial.
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Para entendermos duas das principais regras das teorias
probabilísticas muito utilizadas em genética, podemos programar
uma série de sorteios com moedas comuns. Por exemplo, se
alguém lançar uma moeda para o alto e eu apostar que ela cairá
com a cara voltada para cima, qual será a chance que eu acerte?
Neste caso, como demonstrado na Figura 2A, existem dois eventos
ou situações possíveis: Evento 1, ela cair com a cara voltada para
cima e, Evento 2, ela cair com a coroa voltada para cima. Por esse
motivo, dizemos que o nosso espaço amostral, ou seja, o total de
eventos possíveis, é 2. Como eu apostei em apenas uma de duas
possibilidades, a probabilidade (P) que eu ganhe será:
P(sortear cara) =
Sortear cara
=
1
ou 0,5 (50%)Espaço amostral 2
Podemos agora estender o nosso raciocínio para dois sorteios
independentes. Sorteios independentes são aqueles onde o
resultado de um deles não interfere no resultado dos outros, como
acontece quando