3 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR

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ANÁLISE QUÍMICA INSTRUMENTAL
Espectrofotometria de 
absorção molecular
INTRODUÇÃO
• Técnica de determinação da concentração de
espécies químicas mediante a absorção de
energia radiante (luz).
• A luz é uma fonte de energia, caracterizada pelos
diversos comprimentos de onda e que apresenta
a propriedade de interagir com a matéria, sendo
que parte de sua energia é absorvida pelos
elétrons da eletrosfera dos átomos constituinte
das moléculas.
INTRODUÇÃO
• O princípio de espectrofotometria é deixar incidir
luz em uma molécula e detectar a quantidade de
luz que foi transmitida pela espécie.
• O instrumento usado na espectrofotometria
UV/VIS é chamado de espectrofotômetro.
• Uma amostra é inserida no caminho óptico do
aparelho e luz UV e/ou visível em um certo
comprimento de onda é incidida na amostra e o
espectrofotômetro mede o quanto de luz foi
transmitida.
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
• A absorção de radiação depende da estrutura
da molécula e é característica para cada
substância química.
• A cor das substâncias se deve a absorção de
certos comprimentos de ondas da luz branca
que incide sobre elas, deixando transmitir aos
nossos olhos apenas aqueles comprimentos
de ondas não absorvidos.
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
• A região do visível compreende comprimentos 
de onda que vão de 400 a 800 nm. 
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
• Quando um feixe de luz policromática (luz
branca) incide um objeto, este meio material
irá absorver certos comprimentos de onda,
transmitindo os comprimentos de onda não
absorvidos, os quais são percebidos como
uma cor.
• Esta radiação transmitida é definida como
complementar à cor absorvida.
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
A cor vista em um objeto é devido aos comprimentos 
de onda transmitidos. Os demais comprimentos de 
onda são absorvidos.
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
• Quando um feixe de radiação eletromagnética
atravessa uma camada transparente de um
material, certas freqüências são absorvidas.
• Nesse processo a energia eletromagnética é
transferida para átomos, íons ou moléculas que
compõem a amostra. A absorção promove essas
partículas do estado fundamental para um ou
mais estados excitados de maior energia.
• A quantidade de energia da radiação incidente
que não foi absorvida é transmitida da solução.
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
E
Colisão e absorção
do fóton
Fótons de radiação
incidente
energia
e- em orbital preenchido
promoção
Fótons não
absorvidos
Absorção de radiação
ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO
• Um cromóforo ou grupo cromóforo é a parte
ou conjunto de átomos de uma molécula
responsável por sua cor.
• Substância que tem elétrons capazes de
absorver luz na região do visível.
Corante Vermelho Congo
Cromóforo
PRINCÍPIOS DA TÉCNICA
• Um feixe de luz com intensidade P0 é incidido sobre
uma região de uma solução que contém os átomos
capazes de absorver parte dessa radiação;
• Após passar pela região, ele terá uma nova
intensidade P, menor do que P0, pois uma parte da
luz foi absorvida.
• A nova intensidade, que é transmitida, é medida pelo
detector.
PRINCÍPIOS DA TÉCNICA
• Como P depende de P0, há que se garantir que P0
é sempre igual nas diferentes medições. 
• A intensidade de P depende da intensidade de P0,
da concentração dos átomos na região, da
distância percorrida pelo feixe de luz, do λ que
incide e, é claro, do tipo de átomo ou molécula.
• Mede-se a razão P/ P0. Essa razão é chamada de 
transmitância (T), definida como: T = P/P0.
• Utiliza-se também a porcentagem de
transmitância (%T), onde %T = 100 T. Os valores
de T vão de 0 a 1, e a porcentagem de T vai de 0 a
100.
PRINCÍPIOS DA TÉCNICA
• A transmitância não estabelece uma relação
linear com a concentração, mas sim uma
relação exponencial inversa.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
 
 
T
ra
n
s
m
it
â
n
c
ia
Concentração, mg L
-1
T = 10
-k.c
PRINCÍPIOS DA TÉCNICA
• Alguns fatores como pequenas dispersões e 
reflexão da radiação na cubeta e na solução 
prejudicam a análise da amostra.
PRINCÍPIOS DA TÉCNICA
• SOLUÇÃO: a leitura da solução de interesse é
feito contra uma outra solução conhecida como
“branco”.
• A solução “branco” contém todas as espécies que
fazem parte da solução com exceção dos átomos
ou moléculas absorventes (espécie de interesse).
• É usada para definir absorbância zero; Abranco = 0.
Utilizando-se essa solução em comparação com a
solução da amostra, garante-se que todos os
sinais de absorbância são resultantes do analito.
LEI DE LAMBERT-BEER
• Em certas condições, a intensidade da luz
transmitida obedece à lei de Lambert-Beer
como mostrado na equação a seguir:
T = I/I0 = 10
-abc
onde:
a é uma constante característica do soluto
(absortividade);
b a distância que a luz atravessa;
c a concentração da solução.
LEI DE LAMBERT-BEER
• O valor de transmitância pode ser convertido em 
absorbância através da seguinte relação:
A = -log(T)
• Como a lei de Lambert-Beer é válida, a
absorbância A é igual a .b.c e é proporcional à
concentração, tornando o espectrofotômetro um
medidor de concentração seletivo para a
molécula que tem um pico de absorção no
comprimento de onda sob estudo.
LEI DE LAMBERT-BEER
A = .b.c
 = absortividade molar; 
b = percurso ótico, cm;
c = concentração da espécie absorvente, mol L-1.
• Esta equação é a base matemática da análise
quantitativa na espectrofotometria de absorção.
LEI DE LAMBERT-BEER
VALIDADE DA LEI DE BEER
- Efeitos de espalhamento, reflexão e refração
são desprezíveis pois são compensados pela
utilização da solução do “branco”;
- A concentração do soluto é pequena
suficiente para que as moléculas dissolvidas
atuem de forma independente;
- O caminho óptico a ser percorrido é
constante.
LEI DE LAMBERT-BEER
• Através da Lei de Beer observa-se que a
absorbância de uma determinada espécie é
diretamente proporcional à concentração do
analito, portanto essa relação é linear.
ESPECTRO DE ABSORÇÃO
• O espectro de absorção fornece informações qualitativas e
quantitativas sobre o método estudado.
• A primeira etapa do desenvolvimento de um método
espectrofotométrico para a determinação de uma espécie
de interesse presente no meio é a obtenção do espectro
de absorção.
• Esse espectro é montado fazendo-se a leitura de
absorbância da amostra contendo o analito padrão em
diferentes comprimentos de onda.
• Com o espectro em mãos, observa-se o valor de
comprimento de onda no qual a espécie apresenta maior
valor de absorbância e, então, a partir deste valor de λ é
que serão feitas as leituras de absorbância para a
construção da curva de calibração.
ESPECTRO DE ABSORÇÃO
λ de máxima absorção = 560 nm
CALIBRAÇÃO
• A calibração determina a relação entre a
resposta analítica e a concentração do analito.
• A calibração de uma metodologia pode ser
feita basicamente por dois métodos:
- Método da curva de calibração
- Método da adição de padrão
CALIBRAÇÃO
MÉTODO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO
• Padrões externos são empregados para calibrar instrumentos
quando não há efeitos interferentes advindos da matriz.
• Uma série de padrões externos contendo o analito em
concentrações conhecidas é preparada.
• A calibração é realizada pela obtenção do sinal de
absorbância como uma função da concentração conhecida do
analito.
• Essas medidas são feitas no comprimento de onda de máxima
absorbância do analito e colocadas em uma tabela.
• Uma curva de calibração (curva analítica) é então preparada,
construindo-se um gráfico a partir dos dados e traçando-se,
em seguida, a melhor reta que passa por estes pontos ou
ajustando-os a uma equação matemática adequada.
CALIBRAÇÃO
CALIBRAÇÃO
CALIBRAÇÃO
• O próximo passo é fazer a leitura de absorbância da
espécie que não se conhece a concentração.
• A partir do valor de absorbância lido do
espectrofotômetro, este é ajustado na curva
analítica da seguinte forma: no ponto que
corresponde a este valor de absorbância, uma reta é
traçada até a curva analítica; na sequência uma
outra linha vertical é traçada neste ponto até tocar o
eixo x(que corresponde à concentração da espécie
de interesse). Esse ponto do eixo x encontrado
corresponde à concentração da espécie no meio.
CALIBRAÇÃO
• Valor de absorbância da amostra: 0,150
• Interpolação gráfica
5,35.10-5 mol L-1
CALIBRAÇÃO
• Método dos mínimos quadrados: melhor exatidão
• Obter a equação da reta substituindo o valor de
absorbância em y para encontrar o valor da
concentração em x.
A = 2587,6 CCd(II) + 0,012
A = 2587,6 CCd(II) + 0,012
0,150 = 2587,6 CCd(II) + 0,012
CCd(II) = 5,33.10
-5 mol L-1
CALIBRAÇÃO
MÉTODO DA ADIÇÃO DE PADRÃO
• O método da adição de padrão é muito útil na
análise de amostras complexas nas quais o
efeito de matriz é significativo.
• A matriz é o meio no qual se encontra a
espécie de interesse (analito) que será
analisado.
• Ex: sangue, tinta, solo, leite, bebidas, dentre
outras.
CALIBRAÇÃO
MÉTODO DA ADIÇÃO DE PADRÃO
• Toma-se inicialmente uma alíquota de volume conhecido
da amostra e faz-se uma diluição a um certo volume final e
mede-se a absorbância.
• Em seguida, toma-se outra alíquota da amostra de mesmo
volume e adiciona-se certo volume de solução padrão de
concentração conhecida e dilui-se ao mesmo volume final e
mede-se a absorbância.
• Esse último procedimento é realizado mais algumas vezes
com concentrações diferentes da solução padrão e os
valores de absorbância são medidos e listados em uma
tabela.
• Em seguida esses valores tabelados são colocados em um
gráfico e a reta é extrapolada até tocar o eixo x.
CALIBRAÇÃO
MÉTODO DA ADIÇÃO DE PADRÃO
Alíquotas de 10 mL de uma amostra de água natural
foram pipetados para balões volumétricos de 50,00
mL. Volumes exatos de 0,00; 5,00; 10,00; 15,00 e 20,00
mL de uma solução padrão contendo 11,1 ppm de Fe3+
foram adicionados em cada balão, seguidos de excesso
de íon tiocianato para formar um complexo de
coloração vermelha. Após a diluição ao volume do
balão, as respostas de absorbância para cada uma das
cinco soluções foram respectivamente: 0,240; 0,437;
0,621; 0,809; e 1,009. Calcule a concentração de Fe3+
na amostra.
CALIBRAÇÃO
MÉTODO DA ADIÇÃO DE PADRÃO
CALIBRAÇÃO
MÉTODO DA ADIÇÃO DE PADRÃO
• Utilizando-se a equação da reta têm-se que quando y = 0 o valor
de x corresponde à concentração de Fe3+ presente na amostra, por
isso:
A = 0,1721.Cferro + 0,2412
0 = 0,1721.Cferro + 0,2412
|Cferro | = 1,40 ppm
• Essa é a concentração de Fe3+ presente no primeiro balão (no qual
não foi adicionado Fe3+) após a diluição. Foram diluídos 10 mL de
amostra de água em um balão de 50 mL, ou seja, o fator de
diluição é 5 (50/10), ou seja, a amostra encontra-se 5 vezes mais
concentrada e, então, a concentração de Fe3+ na amostra é
1,40 x 5 = 7,00 ppm.
MISTURA DE CROMÓFOROS
• Esse método é utilizado quando se quer
analisar duas espécies misturadas que
absorvem na região do visível.
• Os espectros de absorção desses cromóforos
vão se sobrepor numa determinada faixa de
comprimento de onda.
MISTURA DE CROMÓFOROS
• No λmax de x existe uma contribuição de y e no
λmax de y existe uma contribuição de x. Neste
caso, em cada λ o valor de absorbância total
corresponde a AX + AY.
• A partir disso, escolhe-se os λmax de cada um dos
compostos, onde cada um deles tem a maior
sensibilidade. Pela Lei de Beer, a contribuição de
cada um deles para a absorbância total em cada
comprimento de onda será:
A = AX + AY
MISTURA DE CROMÓFOROS
DESVIOS DA LEI DE BEER
• Quando a absorbância varia de uma maneira não-
linear em relação à concentração, há um desvio da
lei de Lambert-Beer.
• Na derivação da lei de Beer as seguintes condições
devem ser obedecidas: a radiação incidente deve ser
monocromática, os centros absorventes atuam
independentemente e a absorção ocorre em um
volume de seção transversal uniforme.
• Os desvios na Lei de Beer são de dois tipos: Reais
(envolve as limitações da Lei de Beer) e Aparentes
(desvios relacionados a instrumentação e
manipulação).
DESVIOS DA LEI DE BEER
DESVIOS DA LEI DE BEER
DESVIOS REAIS
a) Interação entre os centros absorventes: a Lei de Beer
assume que os centros absorventes não atuam entre si ou
com outras espécies; isto faz com que a mesma seja
aplicável principalmente a soluções diluídas, em
concentração < 0,010 mol L-1.
b) Elevada concentração do analito: em soluções muito
concentradas a Lei de Beer não se aplica pois a distância
média entre as moléculas diminui a ponto das interações
soluto-soluto ou soluto solvente afetar a capacidade do
analito absorver em um determinado comprimento de
onda da radiação.
DESVIOS DA LEI DE BEER
DESVIOS APARENTES
a) Radiação incidente não é monocromática: a radiação é
considerada não monocromática quando contém uma faixa
larga de λ (banda maior que 5 nm).
Ex: Quando o espectro de absorção do analito é estreito e a
banda de radiação passante pela célula é larga.
Resultado: desvio negativo.
Solução para o problema: utilizar instrumento com banda
espectral passante mais estreita. Empregar, por exemplo,
instrumento com uma largura de banda de 2 nm.
DESVIOS DA LEI DE BEER
b) Quando o composto de interesse emite sinal de fluorescência: o
fenômeno da fluorescência molecular ocorre quando um composto
re-emite a energia radiante absorvida ao invés de convertê-la em
calor.
Resultado: desvio negativo pois chega mais radiação ao detector que
o esperado.
Solução para o problema: posicionar um filtro ótico entre a célula e o
detector para absorver F e deixar passar apenas a radiação I.
DESVIOS DA LEI DE BEER
c) Radiação espúria atinge o detector: essa radiação resulta de
espalhamentos e reflexões na superfície dos espelhos ou grades do
equipamento.
Resultado: desvio negativo pois chega mais radiação ao detector que
o esperado.
Solução para o problema: blindar melhor o equipamento para evitar
que o detector perceba qualquer tipo de radiação que não seja
proveniente do percurso ótico.
DESVIOS DA LEI DE BEER
d) Reflexão e espalhamento da radiação incidente: quando
a radiação é espalhada e desviada, esta não chega ao
detector, dando a falsa impressão que foi absorvida pelo
analito no meio.
Resultado: desvio positivo.
Solução para o problema: evitar material insolúvel na
solução em estudo.
DESVIOS DA LEI DE BEER
e) Desvio causado por alterações no equilíbrio químico: durante
as análises, em algumas situações, algumas reações químicas
podem ocorrer em paralelo e fazer com que ocorra um
aumento ou dimuição da concentração da espécie de intereese
no meio. Isso faz com o sinal analito sofra mudanças.
Resultado: desvio negativo ou positivo, depende da espécie em
estudo.
Soluções para o problema: tamponar o meio; trabalhar em
meio fortemente ácido ou em meio fortemente alcalino.
DESVIOS DA LEI DE BEER
f) Riscos nas paredes da célula: 
Resultado: Sinal de absorbância erroneamente
elevado devido ao desvio da radiação.
Solução: Recomenda-se a troca das cubetas.
DESVIOS DA LEI DE BEER
g) Sujeira nas paredes da célula: Má
manipulação das células onde as marcas dos
dedos de gordura são deixadas nas paredes da
cubeta.
Resultado: Sinal de absorbância
erroneamente elevado.
Soluções para o problema: Manter a área na
qual passará a radiação na cubeta sempre
limpa.
DESVIOS DA LEI DE BEER
h) Ângulo de incidência da radiação sobre a célula
espectrofotométrica diferente de 90o: erro na leitura do sinal de
transmitância provocado pelo mau posicionamento da cubeta
espectrofotométrica no compartimento de amostras.
Resultado: Sinal de absorbância erroneamente elevado. Solução
para o problema: Melhorar o posicionamento da cubeta em
relação ao feixe ótico.
INSTRUMENTAÇÃO
Os espectrofotômetros são instrumentos compostos por:
• Fonte de radiação eletromagnética;
• Sistema de seleção da faixa espectral;
• Compartimento para receber a solução;
• Detector;
• Processador de sinal;
• Dispositivo de leitura.
INSTRUMENTAÇÃO
FONTES DE RADIAÇÃO
• As fontes de radiação são responsáveis pela emissão de
radiação eletromagnética.
• A fonte de radiação (comumente chamada de lâmpada)
ideal para um espectrofotômetroé aquela que apresenta
uma intensidade aproximadamente constante em toda
faixa de comprimento de onda de operação, com pouco
ruído e longo período de estabilidade.
• As fontes que são comumente usadas nos
espectrofotômetros são: as lâmpadas de deutério e as de
tungstênio.
INSTRUMENTAÇÃO
FONTES DE RADIAÇÃO
• As lâmpadas de deutério são utilizadas para excitação na
região do ultravioleta, (espectro de emissão na região entre
160 e 380 nm) e as de tungstênio para excitação na região do
visível e infravermelho próximo (espetro de emissão na região
entre 380 e 2500 nm).
INSTRUMENTAÇÃO
SELETORES DE FAIXA ESPECTRAL
• O seletor de faixa espectral nos espectrofotômetros é o monocromador.
Este aparato tem como função selecionar um feixe de radiação
monocromático capaz de variar dentro de ampla faixa do espectro.
Componentes essenciais de um monocromador:
• Fenda de entrada da radiação (direciona a radiação incidente sobre um
primeiro espelho, fornecendo uma imagem ótica retangular),
• Sistema colimador (primeiro espelho que reflete um feixe paralelo da
radiação incidente, que foi direcionada pela fenda de entrada, sobre um
sistema de dispersão);
• Sistema de dispersão (dispersa a radiação refletida pelo espelho em
diferentes comprimentos de onda);
• Lente focalizadora (responsável por focalizar a radiação de comprimento de
onda desejado na fenda de saída);
• Fenda de saída da radiação (responsável pelo isolamento da banda
espectral desejada que será incidida sobre a amostra contida em uma
cubeta).
INSTRUMENTAÇÃO
MONOCROMADOR
GRADE DE DIFRAÇÃO
INSTRUMENTAÇÃO
CÉLULA ESPECTROFOTOMÉTRICA
• A célula espectrofotométrica, também conhecida como
cubeta, é o compartimento no qual a solução a ser
analisada é colocada para análise. As células mais
utilizadas são as cubetas com percurso óptico de 1 cm.
INSTRUMENTAÇÃO
CÉLULA ESPECTROFOTOMÉTRICA
• Os principais materiais de construção das cubetas
são: quartzo, vidro e plástico. Dependendo da região
do espectro na qual se opera, escolhe-se a cubeta de
material mais adequado.
INSTRUMENTAÇÃO
DETECTORES
• O detector tem como função transformar o sinal de
radiação incidente em sinal de corrente elétrica.
• Principal tipo de detector: fotomultiplicadora.
• Um tubo fotomultiplicador é formado por um tubo de vidro
ou de quartzo sob vácuo, no qual existe um conjunto de
placas metálicas interligadas com carga positiva, os
fotodinodos, sucessivamente, em potencial crescente.
INSTRUMENTAÇÃO
DETECTORES
• Quando a radiação incide sobre estas placas metálicas elas
induzem uma corrente elétrica. Em função do fato destas
placas estarem interligadas e de uma diferença de potencial
elétrico estar sendo aplicada entre elas, esta fotocorrente é
amplificada por um circuito eletrônico adequado, de modo
que um sinal de corrente elétrica pode ser detectado e
registrado.
INSTRUMENTAÇÃO
REGISTRADOR DE SINAL
• O sistema de registro de sinal é um transdutor que converte o
sinal processado num sinal compreensível ao operador. Em
alguns casos, o sistema de registro já fornece a concentração
do analito.
• No espectrofotômetro o sinal de corrente é convertido em
tensão e o resultado é mostrado na forma de sinal de
transmitância ou absorbância em um mostrador digital.
TIPOS DE ESPECTROFOTÔMETROS
Os espectrofotômetros podem ser divididos
em dois tipos:
• FEIXE SIMPLES
• FEIXE DUPLO
TIPOS DE ESPECTROFOTÔMETROS
• Ambos os equipamentos operam segundo o
mesmo princípio e se utilizam dos mesmos
componentes;
• A principal diferença reside no fato que em um
espectrofotômetro de feixe simples toda a
radiação incidida passa pela amostra e, dessa
forma, o ajuste do branco é feito no equipamento
e em seguida a leitura do valor de absorbância da
amostra é lido no equipamento.
TIPOS DE ESPECTROFOTÔMETROS
TIPOS DE ESPECTROFOTÔMETROS
• Em um de feixe duplo as leituras do branco e da
amostra são feitos simultaneamente pois a
radiação incidida passa por um divisor de feixe o
qual alternadamente direciona o feixe de luz para
a amostra ou para uma cela de referência várias
vezes por segundo.
• Ganha-se em operacionalidade em um
equipamento com feixe duplo pois a obtenção de
um espectro em determinado intervalo de
comprimento de onda ocorre em poucos
minutos.
TIPOS DE ESPECTROFOTÔMETROS