Aula 05 - Experimental 2 - Esterilização de meio de cultura e materiais

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Instituto Federal de Alagoas – IFAL
Disciplina: MIND Data: ......./ ......../ ........ 
Professoras: Iara Barros Valentim
Aluno (a):.......................................................................
Experimento Nº 2: Esterilização de meio de cultura e materiais
1. Objetivos: Acondicionar adequadamente vidrarias, instrumentos e meios de cultura para esterilização.
2. Considerações gerais - Introdução
Processo de esterilização visa eliminar, por remoção ou morte, todos os micro-organismos de um material ou meio. Prática fundamental em todos os procedimentos microbiológicos. Os materiais, a água, os vasilhames utilizados na preparação de meios de cultura e soluções nutritivas para o crescimento de micro-organismo devem ser isentos de qualquer forma de vida. Assim, os termos estéril, esterilizar e esterilização referem-se à ausência total ou destruição total de todos os micro-organismos, ex: flambagem, calor seco e calor úmido sob pressão (autoclavagem). A utilização de calor em ambiente úmido é um dos métodos mais eficazes de destruição de micro-organismos. A autoclave torna-se uma câmara de vapor de água saturado a pressão de 1 atm a uma temperatura de ebulição de 121 ºC durante 15 min. Assim, a morte de todas as formas de vida está assegurada, por isso o calor úmido sob pressão é utilizado na esterilização de meios de cultura que não contenham componentes termolábeis. 
3. Materiais e reagentes
       
	- 3 tubos de ensaio para cada grupo
- Proveta de 100 mL
- Béquer de 100 mL para cada grupo 
- pipeta de 5 mL para cada grupo
- 1 Erlenmeyer de 100 mL para cada grupo
- Espátula, balança, papel alumínio, papel Kraft, algodão hidrófilo, fita, autoclave. 
	- Agar nutriente, 
- água destilada a 60 ºC.
5. Procedimento experimental
	1- Cada grupo deverá preparar 25 mL do meio de cultura Agar nutriente, conforme recomendações do fabricante (Ver o frasco).
2- Colocar água destilada para aquecer até 60 ºC para dissolver o meio.
3- Colocar 10 mL no erlenmeyer, tampe-o com algodão e cubra com papel alumínio e prenda com a fita. Lembrar que sempre agitar o meio para cada transferência. 
4- Transferir 5 mL para cada tubo de ensaio e tampar com rolhas de algodão, reunidos em grupos de até dez tubos, recobertos na parte superior com papel manilha ou alumínio e amarrados com barbante ou fita. Lembrar que sempre agitar o meio para cada transferência.
6- Esterilizar em autoclave a 121º e 1 kgf/cm² por 15 min. Ver instruções*.
	7- Colocar estante (ou Becker) com tubos de ensaio tampados por algodão para esterilizar.
8- No meio tempo que ocorre a esterilização, com a câmara de fluxo laminar ligada, limpar com álcool 70% e papel toalha, ligando em seguida à lâmpada de germicida e deixar atuar por 15 a 20 min. desligando em seguida. Não desligar o fluxo de ar.
9- Ao final do tempo de esterilização do material em autoclave, transferir o material ainda quente para câmara de fluxo laminar, deixando-o esfriar. Lembrar de deixar os tubos de ensaio inclinados. Depois colocá-los na geladeira para usá-lo posteriormente.
*AUTOCLAVE VERTICAL
Procedimentos Operacionais:
1. Verificar o nível da água na caldeira e ajustar se necessário, com água destilada (AJUSTE DO NÍVEL DE ÀGUA).
2. Acionar o aquecimento no máximo e aguardar atingir a ebulição (AQUECIMENTO).
3. Transferir o material preparado para a esterilização, para o cesto (CARGA).
4. Fechar hermeticamente a autoclave (colocar a tampa no lugar e apertar os parafusos)(FECHAR).
5. Abrir a válvula de escape, deixar sair o ar da autoclave até observar um jato contínuo de vapor ( pode-se confirmar a saída de todo o ar pelo teste de condensação)(RETIRADA DO AR).
6. Fechar a válvula de escape e acompanhar no manômetro a elevação da pressão (PRESSURIZAÇÂO).
7. Quando a pressão atingir 1 Kgf/cm2 (120°C), reduzir o aquecimento para o ponto médio e ajustar a válvula de segurança e alívio para manter a pressão constante (AJUSTE DA PRESSÂO).
8. Controlar o tempo de esterilização em um cronômetro de acordo com o tipo e a quantidade de material a esterilizar (15 – 45 min) (ESTERILIZAÇÃO).
9. Desligar o aquecimento e esperar a pressão manométrica voltar ao valor inicial (zero), abrir a válvula de escape para equilibrar a pressão (DESPRESSURIZAÇÃO).
10. Abrir a tampa da autoclave e retirar o material esterilizado (DESCARGA).
6. Referências
Perdoncini, Márcia. G. Apostila de Aulas Práticas de Microbiologia, paginapessoal.utfpr.edu.br/geraldo/microbiologia-pratica/aulaspraticasmicro.pdf acessado em 29-09-2017.
7. Questionário
1) Descreva o procedimento necessário para esterilização de materiais em autoclave (placas de Petri,
pipetas, frascos, balões, tubos de ensaio e alças)
2) Como é o processo de funcionamento de uma autoclave?
3) Porque se deve sempre esperar que a autoclave escoe todo o vapor (posição zero do manômetro)
antes de se proceder à abertura da tampa?
4) Como foi preparado o meio de cultura desta aula? Descreva o procedimento.
Experimento Nº 3: Preparação de vidrarias para a esterilização
Preparo de provetas, tubos de ensaio, frascos de Erlenmeyer, frascos Schott e béqueres
- Colocar tampão de algodão hidrófobo e gaze no bocal dos frascos Erlenmeyer e tubos de ensaio. Cobrir com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com barbante, atilho ou fita adesiva tipo crepe.
- Cobrir os bocais dos béqueres com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com fita adesiva tipo crepe, atilho ou barbante.
- Esterilizar em autoclave a 121 °C, por 30 min ou em estufa a 170 °C – 180 °C por 2 horas.
- Identificar o material com data de esterilização e prova de esterilização. Observação: Frascos destinados ao preparo de meios de cultura, que são submetidos à esterilização por autoclave no momento do preparo do meio, dispensam esterilização prévia.
Placas de Petri descartáveis usadas
- Descartáveis - Colocar em saco próprio para autoclave, esterilizar a 121 +/- 1 ºC por 30 minutos e descartar.
- Vidro - Cobrir com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com barbante, atilho ou fita adesiva tipo crepe.
- Esterilizar em autoclave a 121 °C, por 30 min ou em estufa a 170 °C – 180 °C por 2 horas.
- Identificar o material com data de esterilização e prova de esterilização.
Pipetas
- Colocar algodão hidrófobo no bocal das pipetas. 
- Acondicionar em porta-pipetas ou embrulhar em grupos em papel Kraft. 
- Identificar o material com nome, volume, data de esterilização e prova de esterilização. 
- Esterilizar em estufa a 170 °C, por 2 horas ou em autoclave a 121 °C por 30 minutos.
- Identificar o material com data de esterilização e prova de esterilização.
Preparo e esterilização de pinças
- Lavar as pinças com água e detergente.
- Embrulhar em grupos as pinças em papel Kraft ou papel alumínio.
- Esterilizar em autoclave a 121 °C, por 30 min, ou em estufa a 180 °C, por 2 horas.
- Identificar com nome, data de esterilização e prova de esterilização
6. Referências
Preparo de Materiais e Vidrarias para Esterilização https://www.youtube.com/watch?v=Mfw69wG4HzQ, acesso em 12-02-2020.
SALVATORI, ROSÂNGELA UHRIG e cols. LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA: normas gerais, instruções de trabalho e Procedimentos Operacionais Padrões (POP) https://www.univates.br/editora-univates/media/publicacoes/18/pdf_18.pdf, acesso em 20-02-2020.
Vidraria de laboratório: como embalar pipeta para esterilização https://www.youtube.com/watch?v=7KxG3Kve3KE, acesso em 15-02-2020.
Vidraria de laboratório: como preparar o material para ser esterilizado. https://www.youtube.com/watch?v=NDaBux22TZo, acesso em 20-02-2020.
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