Etiquetas de afinidade para purificar proteínas (Tags)

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Seminário de Biofísica de Proteínas
Antonia
Camila
Guilherme
Mini-Review: Etiquetas de afinidade para purificação 
de proteínas
Etiquetas de afinidade
● Fizemos nossa proteína recombinante! E agora, como recuperá-la?
Características importantes que as tags devem ter
● Versáteis (se liguem tanto em N como em C terminal).
● Tamanho curto
● Capacidade de ser clivada
● Causar quase nada de efeito sobre a estrutura e função da nossa 
proteína de interesse
● Compatível com vários sistemas de expressão
● Ser imunodetectável por anticorpos baratos
● Custo-benefício
Etiquetas de afinidade 
Epitope tags Protein/domain tags
Sequência curta de 
aminoácidos. Não influencia 
na estrutura da proteína
Sequência de alguns kDa. Proteínas ou 
domínios de proteínas altamente solúveis. 
Geralmente ajudam na solubilidade da 
proteína. Podem influenciar na estrutura 
nativa da proteína.
Tandem 
affinity 
purification
-> combinação de 
várias tags, torna 
o processo mais 
eficiente.
Etiquetas de afinidade 
Epitope tags Protein/domain 
tags
His
FLAG
HA
V5
Myc
Strep
GST
MBP
SUMO
CBD
NusA
Halo
FATT
Etiquetas de afinidade 
Epitope tags Protein/domain 
tags
His
FLAG
HA
V5
Myc
Strep
GST
MBP
SUMO
CBD
NusA
Halo
FATT
Poly histidine tag
6-10 resíduos de histidina consecutivos
A tag mais simples e mais utilizada.
Eluída por imidazol, que compete com a histidina, ou por redução do pH, 
que torna o anel protonado e então não interage mais com a resina.
FLAG-tag
3x FLAG
Sítio de enteroquinase 
interno facilita a clivagem.
Octapeptídeo
‘DYKDDDDK’ 
Para proteínas mais difíceis:
HA-tag
● Derivação dos aminoácidos 98-106 da hemaglutinina (HA) do vírus de 
influenza humana.
‘YPYDVPDYA’
● Não interfere na 
estrutura protéica.
● Eluição associada 
a anti-HA não é 
muito eficiente.
V5-tag
14 resíduos de aminoácidos 
‘GKPIPNPLLGLDST’
● Derivada de um epítopo 
do Simian Virus (SV5)
● Existe uma tag mais 
curta de 9 resíduos 
‘IPNPLLGLD’
Myc-tag
● Peptídeo sintético, de 
sequência 
‘EQKLISEEDL que 
corresponde aos 
aminoácidos finais da 
proteína Myc humana.
● Usada com sucesso para 
imuno-purificar proteínas 
expressas em Arabidopsis 
após transformação com 
Agrobacterium.
Streptavidin tag
● Pode ser usada em vários sistemas: mamíferos, bactérias, fungos etc.
● Não interfere no folding da proteína, tornando ela ideal.
● Não é necessária remoção da tag após purificação
Etiquetas de afinidade 
Epitope tags Protein/domain 
tags
His
FLAG
HA
V5
Myc
Strep
GST
MBP
SUMO
CBD
NusA
Halo
FATT
GST (glutathione S-transferase) tag
● GST tem alta afinidade por 
glutationa reduzida, então fica fácil 
purificar.
● A GST tem 26kDa e é altamente 
solúvel.
● Geralmente ligada ao N terminal
● Pode acabar se dimerizando, então 
é importante removê-la após 
purificação.
Maltose binding protein (MBP)
● MBP é uma proteína de 42kDa, codificada 
pelo gene mal E.
● É responsável por aumentar solubilidade.
● Geralmente está no N terminal.
● Se liga a amilose.
● Eluição usando maltose.
CBP (chitin binding protein) tag
● Usada para produzir proteínas 
extracelulares eucarióticas que 
geralmente não se expressam bem 
em bactérias.
● Pode ser recuperada usando resina 
com quitina ou beads magnéticos 
com quitina.
● Eluição por adição de DTT, induz 
clivagem da ‘intein’
SUMO (Small ubiquitin-related modifier) tag 
● Funciona tanto como chaperona como iniciadora do folding proteico.
● Funciona bem tanto em procariotos como em eucariotos.
● Aumenta os níveis de expressão da proteína recombinante e sua 
solubilidade.
Eluição
quando com 
HisTag: pH, 
imidazol
Halo tag
● Permite eficiente captura de proteínas expressas em E.Coli.
Tobacco Etch Virus protease
Protein of Interest
Nus A
● Aumenta solubilidade das 
proteínas em fusão.
● Promove hairpin folding e 
terminação.
● Não tem afinidade com 
nenhuma resina cromatográfica, 
usada geralmente em 
combinação com His-tag.
● É recomendável clivar após 
purificação.
FATT (Flag-Acidic-Target-Tag)
● Tecnologia nova
● Purificação de enzimas extracelulares e fragmentos de anticorpos.
IMAGE NOT FOUND
Clivagem de tags e métodos de remoção
● A maioria das tags possuem 
um sítio de clivagem por 
protease integrado entre a tag 
e a proteína
● A atividade da protease libera a 
tag da proteína
Enterokinase
● Protease mais usada para N-terminal
● Reconhece polipeptídeos de 5 
aminoácidos 
‘DDDDKX’
● A FLAG-tag (DYKDDDK) possui um 
sítio de identificação interno da 
enterokinase
‘
TEV (Tobacco Etch Virus)
● Protease de sítio específico
● Reconhece sequência com 7 
aminoácidos
‘EXXYXQS’ 
Sequência ideal - ‘ENLYFQS’
● É ativo em vários substratos e faz 
clivagem em baixas temperaturas
Thrombin
● Clivagem resulta na conservação de 
dois aminoácidos no lado C-terminal 
do ponto de quebra da proteína alvo
● Sítio ideal - ‘X4X3PR [K]X1’X2’
● X4 e X3 são hidrofóbicos e X1’ e X2’ 
são não-ácidos
● Incorporação de 5 resíduos de glicina 
entre o sítio da protease e a tag do 
N-terminal melhora a clivagem
Factor Xa
● Clivagem no peptídeo de 4 aminoácidos ‘IE [D]GRX’
● Pode ocorrer em temperaturas de 4 a 25 C
● Normalmente cliva de forma não específica e não eficiente
Rhinovirus 3C Protease
● Sequência ideal de aminoácido - ‘ETLFQGP’
● Atividade catalítica mais alta que a protease TEV em temperaturas baixas
● Versão comercial em forma de uma glutationa S-transferase (GTS)
PreScission Protease
Estratégia de purificação
Split Intein Mediated Ultra-Rapid Purification of Tag-less Protein (SIRP)
● Método de rápida clivagem envolvendo um DnaE intein de Nostoc 
punctiforme
● O sistema anula clivagem prematura da proteína durante expressão e 
gera quase completa remoção da etiqueta em menos de 30 minutos em 
temperatura ambiente
● O segmento intein causa pouca interferência na expressão da proteína 
recombinada