Relatório Espectrofotometria

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS-CCE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA-DBQ
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL- 4965/003
ESPECTROFOTOMETRIA DE PROTEÍNAS
Acadêmicos: 
Denys Marcel de Moraes Fertonani R.A.: 115213
Gabriella Pereira Furio R.A.: 109383
Guilherme Hannoun Giudai R.A.: 104890
Isabela Batistella Regodanso R.A.: 109568
 
Docente:
Paulo Sérgio Alves Bueno
Maringá-PR
Fevereiro de 2022
1. INTRODUÇÃO
A espectrofotometria é um método empregado em determinações baseadas nas
concentrações do analito, na qual faz uso das propriedades de absorção de energia
eletromagnética das partículas (átomos e moléculas). Essa técnica é empregada para detectar,
identificar e quantificar moléculas, de forma que se determina a concentração da solução, por
meio da medida da quantidade de fótons absorvida pela amostra (absorção de luz das
moléculas).
No espectrofotômetro a luz passa por uma fenda e por um prisma com o comprimento
de luz selecionado, que em seguida incide no compartimento com a amostra, e sai do
compartimento como energia emergida que é detectada e expressa pelo equipamento na
forma de absorbância. A figura 1 demonstra os principais componentes do
espectrofotômetro.
Figura 1- Os principais componentes do espectrofotômetro.
(Fonte: NELSON,D.L ; COX, M.M)
Cada milímetro sucessivo do comprimento do caminho da solução absorvente em uma
célula não absorve uma quantidade constante de luz, mas uma fração constante da luz que
incide sobre ela. Entretanto, com uma camada absorvente de comprimento de caminho fixo, a
absorbância, A, é diretamente proporcional à concentração do soluto absorvente. O
coeficiente de extinção molar varia com a natureza do composto absorvente, do solvente e do
comprimento de onda, e também com o pH se a substância que absorve que absorve a luz está
em equilíbrio com um estado de ionização que possui diferentes propriedades de absorção.
(NELSON, D.L; COX, M.M)
A fração da luz incidente absorvida por uma solução em um determinado
comprimento de onda está relacionada à espessura da camada de absorção e à concentração
da substância que absorve (NELSON, D.L; COX, M.M) . Essas duas relações são
combinadas na lei de Lambert-Beer, descrita como:
(Equação 1. Lei de Lambert-Beer).𝐴 = ε. 𝑐. 𝑙
Na qual a absorbância (A) é a medida de absorção de energia pela substância em
solução, (ε) é uma constante característica da solução que está relacionada com o
comprimento de onda, (c) é a concentração da solução e (l) é a distância percorrida pela luz,
que no caso dessa técnica é determinada pela cubeta, recipiente no qual a luz atravessa.
A equação 1 pode ser expressa em relação a luz incidente I0 e a luz emergente
(transmitida) I , onde I0 > I pois a natureza da luz permite que ela sofra reflexão e refração
ao entrar em contato com a cubeta e com a solução, ela também pode se perder em meio as
partículas em solução e ainda ser absorvida pela solução . Dessa forma a lei de Lambert-Beer
será:
(Equação 2. Lei de Lambert-Beer em função da luz).𝑙𝑜𝑔
𝐼
0
𝐼 = ε. 𝑐. 𝑙
A lei de Lambert-Beer pressupõe que a luz incidente é paralela e monocromática (de
um único comprimento de onda) e que as moléculas de solvente e soluto são orientadas
aleatoriamente. A expressão I0 / I é denominada absorbância e designada A. (NELSON,
D.L; COX, M.M)
Os desvios relacionados à Lei de Lambert-Beer são considerados como desvios reais e
aparentes. Onde os desvios reais estão relacionados a desvios verdadeiros que limitam a
aplicação da lei, já os desvios aparentes estão relacionados a limitação do espectrofotômetro
ou ainda química e física.
Os desvios reais estão relacionados com: a variação do índice de refração com a
concentração e raramente ocorre em soluções com concentrações inferiores a 0,01mol.L-1, e
com a interação dos centros absorventes onde em concentrações altas as moléculas dos soluto
ficam tão próximas que a distribuição de suas cargas e a capacidade para absorver as
radiações de um determinado comprimento de onda se alteram.
Os desvios físicos estão interligados com a falta de monocromaticidade da radiação,
com a resposta não linear da fotocélula na qual o dispositivo deve ser sensível o suficiente
para identificar pequenas intensidades de radiação, e com a flutuações da fonte que podem
ser ajustados com um estabilizador de corrente. Os desvios químicos estão correlacionados
com associações moleculares na qual há interação entre soluto e solvente na solução e com
deslocamentos químicos.
O espectro de absorção apresentado pelo espectrofotômetro permite encontrar o
comprimento de onda ideal para fazer a leitura da substância uma vez que cada composto
possui uma faixas específica de comprimento de onda que absorve luz, ou seja ele se torna
eficiente para identificação de compostos já que cada composto possui sua própria identidade
(espectros característicos) e para obtenção da faixa espectral onde a energia radiante é
absorvida ao máximo, com parâmetros considerados bastante sensíveis.
2. OBJETIVOS
Obter o espectro da absorvência e o fator de calibração (FC) do complexo
proteína-biureto (albumina). Descobrir a concentração de albumina em uma amostra
desconhecida contendo a proteína comparando-o seu valor de absorbância com o da
literatura.
3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
3.1. MATERIAIS
● Solução padrão de albumina 10 mg/mL;
● Reagente de biureto;
● Água destilada;
● Amostra de albumina com concentração desconhecida;
● 7 Tubos de ensaio;
● 3 Pipetas de 1 mL;
● Cubeta de espectrofotometria de 1 mL (Cuvettes);
● Espectrofotômetro;
● Etiquetas adesivas.
3.2. PROCEDIMENTOS
A. Enumerou-se seis tubos de ensaio de 1 a 6;
B. No primeiro tubo, pipetou-se 0,8 mL de água destilada, 0,2 mL da solução de
albumina e 4 mL do reagente de biureto;
C. No segundo tubo, pipetou-se 0,6 mL de água destilada, 0,4 mL da solução de
albumina e 4 mL do reagente de biureto;
D. No terceiro tubo, pipetou-se 0,4 mL de água destilada, 0,6 mL da solução de albumina
e 4 mL do reagente de biureto;
E. No quarto tubo, pipetou-se 0,2 mL de água destilada, 0,8 mL da solução de albumina
e 4 mL do reagente de biureto;
F. No quinto tubo, pipetou-se 1,0 mL da solução de albumina e 4 mL do reagente de
biureto;
G. No sexto tubo, pipetou-se 1,0 mL de água destilada e 4 mL do reagente de biureto;
H. No sétimo tubo, adicionou-se uma pequena alíquota da amostra desconhecida; 1,00
mL de água destilada e 4,00 mL de biureto;
I. As amostras foram agitadas e deixadas em repouso por, aproximadamente, 10
minutos;
J. Transferiu-se o conteúdo do sexto tubo para a cubeta a fim de realizar a calibração no
espectrofotômetro;
K. Retirou-se a cubeta do espectrofotômetro, a solução foi devolvida para o tubo de
origem e lavou-se com água destilada para a próxima aferição;
L. Transferiu-se o conteúdo do quinto tubo para a cubeta e em seguida, analisou-se a
curva de absorção espectral da proteína;
M. Retirou-se a cubeta do espectrofotômetro, devolveu-se a solução ao tubo original e
lavou-se novamente com água destilada;
N. Transferiu-se o conteúdo do primeiro tubo para a cubeta de espectrofotometria,
analisou-se e anotou-se a absorbância da solução na faixa de 550 nm (faixa espectral
obtida pelo procedimento do tópico L), retirou-se a cubeta do aparelho e devolve-se o
conteúdo para o tubo original;
O. O mesmo procedimento descrito no tópico anterior foi realizado para cada uma das
amostras subsequentes, de 2 a 4.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. ESPECTROFOTOMETRIA DAS SOLUÇÕES DE ALBUMINA
A transição eletrônica dos elétrons entre um nível mais baixo de energia para um nível
mais alto gera um fóton de luz que possui comprimento de onda específico. Esse
comprimento de onda pode ser interpretado pelos olhos humanos na forma de cor, por
exemplo, quando se acende um fósforo, o mesmo possui cor azul-amarela, essa cor se deve a
excitação do elétron que gerou um comprimento de onda e consequentemente uma cor que
foi captada pelos olhos e interpretadapelo cérebro.
Nem todas as cores são captadas aos olhos humanos, apenas as cores que
correspondem a parte visível do espectro eletromagnético, como representado na Figura 2,
não conseguimos ver nem 10% de todas as ondas eletromagnéticas existentes, apenas as que
compreendem de 400nm a 700nm.
Figura 2. Espectro eletromagnético.
(Fonte: Slides radiação UFRGS).
Cada comprimento de onda possui uma cor absorvida e uma cor transmitida,
ou seja, quando vemos que nossa solução está violeta, não significa que ela está
absorvendo todas as outras cores e refletindo apenas a violeta. Para entender esse fato,
é necessário estudar as cores complementares, tal como representada na Figura 3.
Figura 3. Cores complementares.
(Fonte: Cores Complementares - Toda Matéria).
Se a solução apresenta cor violeta (transmitida), remete-se a uma absorção da cor
oposta ao violeta, que de acordo com a figura acima, é a amarela-esverdeado (absorvida) em
aproximadamente 380-430 nm. A Tabela 1 mostra todas as possíveis cores que podemos
enxergar em uma solução conjuntamente com sua cor absorvida e comprimento de onda.
Tabela 1. Dados sobre colorações e diferentes comprimentos de onda.
Cor da solução Cor complementar absorvida Comprimento de onda (nm)
Amarelo esverdeado Violeta 380-430
Amarelo Azul 430-475
Laranja Verde azulado 475-495
Vermelho Azul esverdeado 495-505
Púrpura Verde 505-555
Violeta Amarelo esverdeado 555-575
Azul Amarelo 575-600
Azul esverdeado Laranja 600-620
Verde azulado Vermelho 620-700
Uma das funções da técnica de espectrofotometria é identificar uma substância
desconhecida por meio de seu espectro característico tanto no ultra violeta, visível ou
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infravermelho conjuntamente com o estudo das concentrações das soluções medindo o
quanto ela consegue absorver em um dado comprimento de onda.
De acordo com a metodologia empregada na prática, a solução de albumina foi levada
ao espectrofotômetro e foi realizada uma varredura em todo o espectro a fim de encontrar um
ponto onde a proteína apresentasse sua maior absorção, tal como representado na Figura 4.
Figura 4. Varredura do espectro eletromagnético visível para a proteína de albumina.
(Fonte: Os autores).
A proteína albumina apresentou melhor absorção no comprimento de onda de 550
nanômetros, ou seja, utilizaremos essa exata onda a qual a energia radiante foi absorvida ao
máximo pela amostra.
Por motivo da proteína ser incolor, o reagente Biureto é adicionado junto à solução a
fim de formar um complexo de cor violeta com a proteína. O reagente pode ser sintetizado tal
como representado na Figura 5 pela decomposição térmica da uréia em aproximadamente
180 °C.
Figura 5. Decomposição térmica da uréia e formação do reagente de Biureto.
(Fonte: [Experimentos de bioquímica (unesp.br)]).
Interagindo com átomos de nitrogênio das ligações peptídicas das proteínas, tal como
na Figura 6, ao Biureto forma-se quatro ligações peptídicas para cada íon central do
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complexo de cobre, dando a cor púrpura à solução e facilitando sua leitura no
espectrofotômetro uv-vis.
Figura 6. Complexo de cobre-proteína e suas ligações peptídicas.
(Fonte: [Experimentos de bioquímica (unesp.br)]).
A metodologia do Biureto é utilizada a fim de determinar a concentração de uma
proteína em uma determinada amostra, que de acordo com a Lei de Lambert-Beer, a
intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração da proteína, como representado
na Equação 1. A relação de proporcionalidade é direta, ou seja, quanto maior for a
concentração da amostra, maior será sua absorção.
4.2. CURVA DE CALIBRAÇÃO
Para se construir o espectro de absorção é necessário preparar diferentes diluições da
solução de albumina, tal como representado na Tabela 2. O tubo de ensaio 6 representa o
“branco”, ou seja, uma solução que contém todos os componentes do experimento (água e
biureto) exceto pelo componente a ser medido pelo equipamento (albumina). Já o tubo de
ensaio 7 representa uma amostra desconhecida a ser determinada por meio da absorbância e
comparação com a literatura.
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Tabela 2. Valores volumétricos e de concentração para as diluições da albumina.
Tubos Albumina (mL) Água (mL) Biureto (mL) Concentração de
solução (mg/mL)
1 0,20 0,80 4,00 2,00
2 0,40 0,60 4,00 4,00
3 0,60 0,40 4,00 6,00
4 0,80 0,20 4,00 8,00
5 1,00 – 4,00 10,00
6 – 1,00 4,00 –
7 – 1,00 4,00 –
No espectrofotômetro, inicialmente foi selecionado o comprimento de onda de
550nm, e em seguida leu-se o tubo de ensaio 6 que contém a solução “branco” a fim de
“tarar” o valor de absorbância para desconsideração da água e do biureto, medindo-se apenas
a absorbância da albumina, como representado na Tabela 3.
Tabela 3. Resultados de concentração e absorbância para as soluções diluídas de albumina.
Tubos Concentração (mg/mL) Absorbância (nm)
1 2,00 0,092
2 4,00 0,167
3 6,00 0,266
4 8,00 0,346
5 10,00 0,429
D – 0,129
A partir dos dados tabelados, construiu-se um gráfico, denominado curva de
calibração da albumina, que correlaciona as concentrações molares da proteína nas diferentes
soluções e a absorbância apresentada por elas em cada condição, como graficado abaixo.
Gráfico 1. Curva de calibração para a albumina,
O fator de calibração pode ser calculado de acordo com a Equação 3 a qual
representa a concentração da amostra (C) e sua absorbância (A) obtidos através da Tabela 3.
(Equação 3. Fator de calibração).𝐹𝐶 = 𝐶𝐴 
Realizando os cálculos utilizando a equação acima para os tubos de ensaio 1 a 5, foi
obtido:
FC1 = 21,73 (3.1)
FC2 = 23,95 (3.2)
FC3 = 22,55 (3.3)
FC4 = 23,12 (3.4)
FC5 = 23,31 (3.5)
Utilizando a média aritmética simples para o fator de calibração, obteve-se um valor
médio equivalente a aproximadamente 23,12. Em um primeiro momento, não pôde-se
realizar esse mesmo cálculo para a amostra desconhecida, pois o parâmetro (C) referente a
concentração não foi fornecido, apenas tinha-se dados concernentes à absorbância (A).
Porém, de acordo com a Equação 3, isolando o fator concentração (C) obtém-se:
(3.6)𝐹𝐶 · 𝐴 = 𝐶 
Para calcular a concentração experimental da amostra desconhecida em função da
absorbância medida, aplicou-se a fórmula (3.6). Tendo em vista que a média do fator de
calibração é de 23,12 e a absorbância da amostra desconhecida é de 0,129, substitui-se os
valores na equação para determinar a concentração:
(3.7)𝐶 = 23, 12 · 0, 129 ≃ 3, 0
A concentração da amostra desconhecida é de aproximadamente 3,0 mg/mL
reiterando o comportamento evidenciado pelos dados contidos na Tabela 3, em que mediante
aumento da concentração da proteína na amostra, aumentou-se, também, a absorbância
medida no espectrofotômetro. A amostra desconhecida, então, apresentou absorbância numa
escala entre a aferida para os tubos 1 (0,092 nm) e 2 (0,167 nm) e situação semelhante para as
concentrações (tubo 1 = 2,0 mg/mL e tubo 2 = 4,0 mg/mL).
5. CONCLUSÃO
Através do experimento de espectrofotometria, foi possível uma análise detalhada
acerca da influência das concentrações das proteínas diluídas sob comprimento de onda
absorvido por ela, ou seja, a absorbância de uma determinada molécula aquosa em diferentes
concentrações. Ainda, aprendeu-se o manuseio de instrumentos importantes nos estudos
bioquímicos, no caso, o espectrofotômetro e desenvolveu-se um raciocínio matemático que
possibilitou a obtenção de informações como fator de calibração e curva de calibração.
6. REFERÊNCIAS
Nelson,D.L;Cox, M.M. Lehningher Princípios de Bioquímica. Sexta edição. Sarvier
Editora de Livros Médicos Ltda, São Paulo, SP.
Fundamentos da Espectrofotometria. Disponível em: <
www.ufjf.br/quimica/files/2016/08/Espectrometria-UV-vis.pdf>. Acesso em 06 de fevereiro
de 2022.Espectrofotometria: Análise da concentração de soluções. Disponível em: <
kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/>. Acesso em 06 de fevereiro
de 2022.
http://www.ufjf.br/quimica/files/2016/08/Espectrometria-UV-vis.pdf
https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/
Experimentos de bioquímica. Disponível em:
<https://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.h
tm>. Acesso em 06 de fevereiro de 2022.
Cores complementares. Disponível em:
<https://www.todamateria.com.br/cores-complementares/>. Acesso em 06 de fevereiro de
2022.
Radiação. Disponível em: <https://www.todamateria.com.br/cores-complementares/>.
Acesso em 06 de fevereiro de 2022.