PCR E SUAS VARIAÇÕES - LABORATÓRIO CLÍNICO

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CENTRO UNIVERSITÁRIO FAESA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
ANGELICA DE OLIVEIRA ARAÚJO
ANNA CAROLINA PAULINO
LÍVIA GARCIA DO NASCIMENTO
WALKER RANGEL
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) E SUAS VARIAÇÕES
VITÓRIA
2022
ANGELICA DE OLIVEIRA ARAÚJO
ANNA CAROLINA PAULINO
LÍVIA GARCIA DO NASCIMENTO
WALKER RANGEL
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PRC) E SUAS VARIAÇÕES
Trabalho acadêmico do Curso de Graduação em Medicina Veterinária, apresentado ao Centro Universitário Faesa como parte das exigências da disciplina de Laboratório clínico, sob orientação do professor Lucas Drumond Bento
VITÓRIA
2022
SUMÁRIO
1. Introdução........................................................................... 04
2. Fundamentos da reação em cadeia da polimerase............ 04
3. Resultados falso-negativo................................................... 07
4. Resultados falso-positivo.................................................... 07
5. Variações da PCR.............................................................. 07
5.1 Reações em cadeia da polimerase da transcrição reversa.................................................................................... 08
5.2 PCR em tempo real........................................................... 08
5.3 Multiplex PCR.................................................................... 08
5.4 Nested PCR...................................................................... 09
5.5 PCR Competitiva............................................................... 09
6. Aplicações da PCR no diagnóstico de doenças infecciosas de animais............................................................................... 10
7. Conclusão.........................................................................
8. Referências bibliográficas............................................
1. INTRODUÇÃO
A reação em cadeia da polimerase, popularmente conhecida como PCR, é uma técnica laboratorial cuja utilização tem se tornado cada vez mais frequente nos diversos ramos da medicina veterinária, especialmente, para dar o diagnóstico de doenças infecciosas.
Tal técnica foi desenvolvida em 1980 por Karry Mullis e tem como princípio a replicação in vitro do DNA (REGITANO, 2007), sendo assim, é possível se fazer cópias do DNA utilizando elementos básicos do processo natural de replicação do material genético. 
A PCR, foi uma grande revolução para a área da biologia molecular, e se tornou um método rápido, sensível e capaz de gerar cópias de DNA suficiente para análise se há presença ou não de agentes infecciosos (TECSA), o que possibilita identificar se há ou não presença de agentes patogênicos e que possam causar diversas doenças no organismo animal, além de ser possível diagnosticar doenças de caráter genético, análise da expressão de genes e, mais comumente visto na medicina humana, identificação de indivíduos.
Diante disso, com o estudo e aprimoramento da técnica de PCR, algumas variações deste método convencional foram surgindo, a exemplo da RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR e ainda, a PCR Competitiva (VIEIRA, 2013). Cada uma destas técnicas, são grandes avanços nos métodos moleculares de auxílio diagnostico, haja visto que algumas delas, facilitaram a quantificação da expressão gênica em um tecido animal, como é o caso da RT-PCR (LADEIRA; ISAAC; FERREIRA, 2011)
2. FUNDAMENTOS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
O objetivo da PCR, é multiplicar um fragmento específico de ácidos nucleicos de modo que a partir de uma única molécula de DNA seja possível gerar até cem bilhões de moléculas similares em uma reação (SAIKI, 1988)
Sendo assim, de acordo com Regitano (2007), para que a reação ocorra, alguns componentes são essenciais, conforme ilustrado na figura 1: 
1. Enzima DNA polimerase termoestável, sendo a mais utilizada a Taq na quantidade de 1 a 4U / microlito de solução.
2. Pares de primers, que são os nucleotídeos responsáveis por iniciar a polimerização, 
3. Reagentes como o MgCl2, que tem fundamental importância para a atividade enzimática, haja visto que é responsável por doar íons de magnésio a DNA polimerase. 
4. Desoxinucleotídeos (dNTP’s), que serão a base para a síntese de fitas novas, ou também chamadas de fitas-filhas. Sendo estes compostos por nucleotídeos. 
5. Uma fita molde de DNA que esteja, preferencialmente, livre de impurezas. 
6. Solução tampão, que será fundamental para manter o pH nos valores ideais para que a reação ocorra (entre 8,3 e 9).
Figura 1. Componentes fundamentais da Reação em cadeira da polimerase (Adaptado de BARBOZA, 2015)
Para que tal processo ocorra, conforme representado na figura 2, há o envolvimento de três etapas sendo elas:
1ª Desnaturação do molde de DNA por meio do calor, com temperaturas variantes entre 94 e 95°C;
2ª Anelamento de primers à sequência alvo na fita simples que fora formada;
3ª Extensão dos primers por meio de uma enzima, DNA polimerase, que atua entre 72 a 78°C.
Após este processo, há reinício do ciclo. 
Figura 2. Esquema representativo da reação em cadeia da polimerase. Círculo em vermelho representa o primer e a seta amarela simboliza a DNA polimerase (Adaptado SILVA, 2014).
O processo de polimerização do DNA, ocorre de maneira exponencial, sendo assim cada fita nova de DNA que é formada por meio dos primers, serve de base para a síntese de uma nova fita, conforme ilustrado na imagem 3. Diante disso, ao final do primeiro ciclo, tem-se duas fitas, no segundo ciclo, quatro ampliações são formadas, no terceiro oito, no quarto dezesseis e assim sucessivamente. Vale ressaltar que a síntese, ocorre na direção 5’ – 3” das fitas de DNA.
Imagem 3. Esquema ilustrativo do processo de polimerização (Adaptado de Reação Polimerásica em Cadeia (PCR).
3. RESULTADOS FALSO-NEGATIVO
A PCR por se tratar de um método altamente específico e sensível, pode trazer resultados considerados “falso-negativo”. Este ocorre quando o paciente está positivo para uma determinada doença, entretanto o resultado do teste de PCR dá negativo. 
Dentre os fatores que podem acarretar neste resultado, podem ser citados a carga viral baixa, de forma que não seja possível detectar com tanta facilidade a presença do patógeno, além da resposta imune do hospedeiro, ou seja, o organismo do animal trabalha para combater a infecção de forma rápida, conseguindo eliminar o antígeno por completo ou grande parte dele, dificultando a identificação deste.
4. RESULTADOS FALSO-POSITIVO
Diferentemente do que ocorre com os resultados falso negativo, quando há um indivíduo que não se encontra positivo para determinada doença e o resultado da PCR diz que ele é, denomina-se “falso positivo”.
Estes podem acontecer por uma reação cruzada com outros patógenos que sejam morfologicamente parecidos ou ainda, por falhas técnicas na execução do exame que levaram a um falso resultado positivo.
5. VARIAÇÕES DA PCR
A PCR convencional, ao longo dos anos, serviu como base de estudos voltados para a aprimoração dos métodos moleculares de auxílio diagnóstico e, como consequência houve o desenvolvimento de variantes da PCR.
Segundo (29-diagnostico-laboratorial), as existentes variações da reação em cadeia da polimerase, tem por objetivo melhorar a especificidade e a eficiência da reação, de forma a se tornarem cada vez mais específicas para cada aplicação. Sendo assim, dos tipos de reação de PCR mais comuns, podem ser listados o RT- PCR, PCR em tempo real, Multiplex PCR, Nested PC além da PCR competitiva (VIEIRA, 2013).
5.1 Reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa
A Reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa (RT-PCR), é uma técnica de PCR na qual usa-se como base para desenvolvimento da técnica um fragmento de RNA que será convertido em DNA complementar (cDNA). O uso da RT-PCR, é muito útil especialmente no estudo de expressões gênicas, haja visto que ao analisar o RNA mensageiro, por exemplo, é possível identificar quais proteínas estão sendo expressas (VIEIRA, 2013).
Assim, este método ocorre em duas etapas sendo a primeiradelas a transcrição reversa, na qual há síntese de uma fita de DNA por meio de um template, ou seja, um molde de RNA através de uma reação de catalização realizada por uma enzima chamada transcriptase reversa. O produto desta reação, é a formação do cDNA (VIEIRA, 2013).
Em seguida, no produto gerado aplica-se a técnica da PCR. 
5.2 PCR em tempo real
A PCR em tempo real, é um método semi-quantitativo (qPCR), que se baseia na PCR tradicional, todavia, além de amplificar, simultaneamente, ela determina medidas quantitativas ao longo dos ciclos da PCR, tornando-se uma ferramenta mais rápida, específica e sensível, dando a capacidade de quantificar o DNA durante as reações (MELO, 2012). 
5.3 Multiplex PCR
Tem mais de um segmento genômico amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específicos. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados (VIEIRA, 2013). Como extensão ao uso prático do PCR, essa técnica tem o potencial de produzir uma economia considerável de tempo e esforço dentro do laboratório sem comprometer a utilidade do experimento (PREMIER BIOSOFT).
As reações multiplexais tem suas vantagens que é o aumento da eficiência com a diminuição de tempo, custo e esforço sem comprometer a fiabilidade dos resultados, aumento do número de genes que podem ser amplificados de uma vez e as desvantagens são a presença de múltiplos primers pode levar a hibridação entre primers e a adição de um primer errado a um molde e a necessidade de tempo extra para separa, for electroforese (FERREIRA, 2021)
O PCR multiplexais tem suas aplicações na identificação de patógenos, análise de mutações genética, análise de deleção genética. Quantificação de moldes, detecção de RNA e estudos forenses (PREMIER BIOSOFT).
5.4 Nested PCR
O princípio da Nested PCR (nPCR) é o mesmo da PCR convencional, o que vai diferenciar é a origem da amostra contendo o material genético que será utilizado na reação. Na Nested PCR é utilizado o produto da PCR (extração de DNA viral), adicionando primers específicos para ocorrer a amplificação do produto para determinada situação. 
A especificidade de cada primer é medida a partir de amostras contaminadas com o vírus. Pode ser utilizado como amostra tecidos, soros ou cama de aviário.
A Nested PRC é bastante utilizada para identificar a presença de retroviroses, como AIE (anemia infecciosa equina) e o vírus da anemia das galinhas (CAV). Portanto, a nPCR poderia ser adotada como diagnóstico confirmatório ou adicional à sorologia, contribuindo para as medidas de controle e identificação de retroviroses (SANTOS, 2011)
5.5 PCR competitiva
Na PCR competitiva, sequências estranhas ao material competem pela ligação de enzimas e os primers à sequência alvo. Normalmente, esse fragmento é construído inserindo a mesma região de anelamentos primers de outra sequência qualquer, sendo que o produto final deste DNA construído difere do produto alvo pelo tamanho do par de bases da banda. (VIEIRA, 2010). A construção de um fragmento como este pode ser vista abaixo:
Neste caso, as enzimas de restrição são usadas para cortar dois fragmentos de DNA: Gene SDF1α (alvo) e gene β-actina. Após a digestão enzimática, fragmentos na borda do SDF 1α podem se conectar com o interior do fragmento β-actina, forma híbridos de tamanho maior (~80pb), mas amplifica com primers específicos para SDF1α. Esta mistura é adicionada à reação em uma quantidade predeterminada, e após a reação a densidade óptica das bandas no gel de amplificação é quantificada no programa de medição de densidade de imagem. Este método é usado em alguns kits para detectar certas doenças virais, geralmente em laboratórios, clínicas e bancos de sangue. (PINHAL, 2015).
6. APLICAÇÕES DA PCR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS DE ANIMAIS
Por ser uma técnica altamente sensível, específica e capaz de identificar o DNA de patógenos em amostras clínicas como leite, fezes, sangue, secreção, urina e tecidos, de forma bem mais rápida do que uma cultura bacteriana ou fúngica, por exemplo, o PCR tem se tornado uma ferramenta importantíssima na medicina veterinária, haja visto que é uma peça fundamental para o diagnóstico de doenças nos animais. 
Assim, este método é capaz de identificar microrganismos de caráter zoonótico, a exemplo da Brucella abortus e Mycobacterium bovis diretamente do tecido do animal acometido, o que garante ao patologista um diagnóstico mais rápido e assertivo. Além de ser possível o reconhecimento daqueles patógenos com crescimento in vitro mais lento ou de difícil isolamento, como é o caso da Leptospira spp. (HAAS e TORRES, 2016).
Atualmente, a aplicação da PCR é possível para identificação de uma ampla gama de patógenos que podem ocasionar diversas doenças, como mostra a tabela 1.
	Espécie animal
	Doença
	Agente etiológico
	Amostra clínica
	Referência
	
Aves
	Micoplasmose
	Mycoplasma
gallisepticum
	Suabe traqueal, pulmão,
traquéia
	Wang et al,
1997
	
	Clamidiose
	Chlamydophila
psittaci
	Suabe traqueal, fezes
pulmão, traqueia, fígado
	Sachse et al.,
2009b
	
	Coriza Infecciosa
das galinhas
	Avibacerium
paragallinarum
	Suabe traqueal, traquéia,
pulmão
	Chen et al,
1996
	
	Anemia Infecciosa das galinhas
	Vírus da anemia
infecciosa das galinhas
	Sangue total, baço, fígado, timo
	Rozen e
Skaletsky, 2000
	
	Campilobacteriose genital
	Campylobacter fetus
subsp.venerealis
	Lavado prepucial, sêmen,
muco cervical, feto e placenta
	Hum et al., 1997
	
	Rinotraqueite
	Herpesvírus bovino
	Sêmen
	Van
	Bovinos
	infecciosa
	1
	
	Engelenburg
et al., 1993
	
	Leucose enzoótica
	Vírus da leucemia
	Tumores, células
mononucleares
	Spadetto e
Dias, 2013
	
	Babesiose
	Babesia boviseB. bigemina
	Sangue total
	Buling et al., 2007
	
Cães
	Leptospirose
	Leptospira spp.
	Urina
	Akuzawa et al.
2001
	
	Leishmaniose
	Leishmania spp.
	Sangue total, pele, baço,
fígado e linfonodos
	Assis et al.,
2010
	
	Cinomose
	Vírus da cinomose
	Sangue total, urina,
descarga nasal e saliva
	Shin et al.,
2004
	
	Parvovirose
	Vírus da
parvovirose
	Fezes
	Strottmann et
al., 2008
	
Gatos
	Batolenose
	Bartonella henselae
e B. quintana
	Sangue total
	Souza et al.,
2010
	
	Imunodeficência
	Vírus da
imunodeficiência
	Sangue total
	Arjona et al.,
2007
	
	Leucemia
	Vírus da leucemia
felina
	Sangue total
	Arjona et al.,
2007
	
	Peritonite
infecciosa felina
	Coronavírus felino
	Fezes, soro, fluido ascítico,
omento, rins, fígado, baço
	Herrewegh et
al., 1995
	
Ovinos e caprinos
	Aborto enzoótico
	Chlamydophila
abortus
	Feto abortado e placenta
	Thiele et al.,
1992
	
	Linfadenite caseosa
	Corynebacterium
pseudotuberculosis
	Pús de abscessos
	Pacheco
	
	Língua azul
	Vírus da Língua
azul
	Sangue, baço e linfonodos
	Hofmann et al.
2008
	
	Artrite e encefalite caprina
e Medi-Visna
	Vírus da Artrite/encefalite caprina e vírus da
MV
	Leite, úbere e membrana sinovial
	Deandres et al., 2005
	
Equinos
	Anemia Infecciosa
	Vírusda anemia
infecciosa
	Sangue periférico
	Nagarajan &
Simard, 2001
	
	Arterite Viral
	Vírus da arterite
	Fluido nasofaríngeo e conjuntival, sangue e sêmen
	Miszczak et al., 2011
	
	Influenza
	Vírus influenza A
	Secreção respiratória
	Quinlivan et
al., 2005
	
	Piroplasmose
	Theileria equi e
Babesia caballi
	Sangue total
	Alhassan et al
2005
	
Suínos
	Doença de Aujeszky
	Herpesvírus suídeo 1
	Cérebro, tonsilas, fluido nasal e faríngeo
	Fonseca
Júnior et al., 2013
	
	Influenza
	Vírus da influenza
A
	Pulmão e suabe nasal
	Slomkaet al
2010
	
	Síndrome Respiratória e Reprodutiva dos
Suínos
	Vírus da síndrome respiratória e reprodutiva
	Tonsilas, pulmão, linfonodos, baço, soro sanguíneo e fluidos orais
	Wernike et al., 2012
	
	Peste Suína Clássica
	Vírus da peste suína clássica
	Tonsilas, baço, rins, linfonodos, porção distal
do íleo, sangue e soro,
	McGoldrick et al., 1998
Tabela 1. Aplicação da PCR para diagnóstico de doenças infecciosas em espécies animais de interesse veterinário (Adaptado de HAAS e TORRES, 2016).
7. CONCLUSÃO
A técnicade PCR, que possibilita a multiplicação in vitro de um fragmento de DNA, bem como as suas variações o RT-PCR; Multiplex; Nested e em tempo real, apresenta alta sensibilidade e especificidade. Tal fato possibilitou que estes métodos se tornassem, atualmente na medicina veterinária, o padrão-ouro para detecção de diversos patógenos de maneira rápida e confiável, possibilitando a identificação de doenças infecciosas com uma taxa de diagnósticos assertivos muito alta e sem que haja necessidade de microrganismos viáveis na amostra biológica. 
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
BARBOZA, Natália Rocha. Reação em cadeia da polimerase – PCR. 2015
SANTOS, E.M. et al. Avaliação da nested PCR em comparação aos testes sorológicos IDGA e ELISA para o diagnóstico da anemia infecciosa equina, 2011. Disponível em: <https://doi.org/10.1590/S0102-09352011000200004>. 
FERREIRA, Marco Antônio Macieira. Desenvolvimento de uma ferramenta multiplex-PCR para a detecção de Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi e Yersinia ruckeri em peixes de aquacultura. Escola superior de turismo e tecnologia do mar, 2021
HAAS, Dionei Joaquim e TORRES, Ana Caroline Doyle. Aplicações das técnicas de PCR no diagnóstico de doenças infecciosas dos animais. Revista Científica de Medicina Veterinária, n° 26, 2016.
LADEIRA, P. R. S., ISAAC, C., FERREIRA, M. C. Reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real. Rev. Med. P. 47-51, 2011
MELO, A. N., et al. Aplicação da técnica de PCR na reprodução animal. Rev. Bras. Reprod. Animal, Belo Horizonte, v.36, n.2, p.105-112, 2012.
Premier Biosoft – Accelerating Research in Life Sciences. Multiplex PCR. Disponível em: < www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html>. Acesso em: 26 de abril de 2022.
PINHAL, Maria. et al. Tecnologia de PCR e RT-PCR em tempo real e suas aplicações na área médica, novembro de 2015.
Reação Polimerásica em Cadeia (PCR). Disponível em: <www.dbbm. fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf>. Acesso em: 26 de abril de 2022.
TECSA – Tecnologia em sanidade animal. Diagnóstico molécular: quais as vantagens e quando usar? p.1-3
VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. p.1-18, 2013. 
REGITANO, L. C. A. et al. Protocolos de Biologia Molecular Aplicada à Produção Animal. Embrapa Pecuária Sudeste, 1ª ed., cap. 5, p. 14-16, 2007.
SAIKI, R.K. et al. Direct enzymatic amplification of de DNA with thermostable DNA polymerase. Science, v. 239, n. 4839, p. 487-491, 1988.
SILVA, Aline Maria. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). USP, 2014
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