Hibridização de Ácidos Nucleicos

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Hibridização 
TODAS AS TÉCNICAS DE HIBRIDAÇÃO TÊM COMO ALVO 
MATERIAL GENÉTICO (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS). 
 
TODA SONDA POSSUI UMA PARTÍCULA QUE CONSEGUE SER 
VISUALIZADA. A SONDA SEMPRE EMITE UM SINAL QUANDO 
ELA SE LIGA À SEQUÊNCIA COMPLEMENTAR. 
 
SONDA - MARCADOR – SINAL – SEQUÊNCIA DE ATUAÇÃO. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
HIBRIDIZAÇÃO E DIAGNÓSTICO 
 
DEFINIDA PELO LOCAL DA REAÇÃO 
 
1. “IN SITU” 
2. MEMBRANA (BLOT) 
 
“IN SITU”: MANTER O TECIDO NATURAL, LÂMINA DE 
MICROSCÓPIO É O MAIS COMUM. USAMOS O TECIDO NO 
LOCAL, NÃO HÁ DESTRUIÇÃO. USA O TECIDO 
DIRETAMENTE, DIFERENTEMENTE DA MEMBRANA. 
 
A HIBRIDAÇÃO IN SITU É UM MÉTODO QUE PERMITE 
IDENTIFICAR O LOCUS CROMOSSÓMICO ONDE SE LOCALIZA 
UMA DETERMINADA SEQUÊNCIA DE DNA PREVIAMENTE 
CLONADA. ESTE MÉTODO TEM COMO PRINCÍPIO A 
COMPLEMENTARIDADE DAS BASES QUE REAGE A 
ORGANIZAÇÃO DE DNA. 
ESTA TÉCNICA É UTILIZADA PARA A DETECÇÃO DE VÍRUS 
(EX: DIVERSOS TIPOS DE HPV E EPSTEIN BARR VÍRUS) 
E DE OUTROS AGENTES INFECCIOSOS EM TECIDOS 
SUSPEITOS DE INFECÇÃO, ALÉM DE CROMOSSOMOS E 
PRODUTOS DA SÍNTESE CELULAR. 
 
 
MECANISMOS DE SINALIZAÇÃO “IN SITU” 
1. CISH: CROMOGÊNCIA. 
2. SISH: PRATA. 
3. FISH: FLUORECENTE. 
 
Hibridização 
 
 
 
 
 
PRINCIPAIS ETAPAS HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE IN 
SITU 
 
FISH 
A HIBRIDIZAÇÃO “IN SITU” FLUORESCENTE (FISH – 
FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) É O MAIS 
MODERNO MÉTODO DE PATOLOGIA MOLECULAR PARA 
DETECTAR ALTERAÇÕES GENÉTICAS EM ASSOCIAÇÃO COM 
A MORFOLOGIA CELULAR, TAIS COMO AMPLIFICAÇÕES, 
FUSÕES E TRANSLOCAÇÕES, QUE PODEM SER IMPORTANTES 
PARA O DIAGNÓSTICO, PROGNÓSTICO E ORIENTAÇÃO 
TERAPÊUTICA DE UM GRANDE NÚMERO DE TUMORES. 
 
O EXAME DE HIBRIDIZAÇÃO “IN SITU” FLUORESCENTE É 
UM MÉTODO DE PATOLOGIA MOLECULAR CARACTERIZADO 
PELA IDENTIFICAÇÃO E LOCALIZAÇÃO DE ÁCIDOS 
NUCLÉICOS ALVO (SEQÜÊNCIAS DE DNA OU RNA), 
ATRAVÉS DA LIGAÇÃO COMPLEMENTAR DE SONDAS 
(SEQÜÊNCIAS DE DNA CONHECIDAS, GERALMENTE OBTIDAS 
COMERCIALMENTE) MARCADAS COM MOLÉCULAS 
FLUORESCENTES (FLUOROCROMOS). A UTILIZAÇÃO DE 
MAIS DE UM FLUOROCROMO NO MESMO MATERIAL PERMITE 
MÚLTIPLAS IDENTIFICAÇÕES DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS 
ATRAVÉS DA OBSERVAÇÃO DE LUZ EM DIVERSAS CORES / 
COMPRIMENTOS DE ONDA. A LÂMINA PRODUZIDA DEVE SER 
OBSERVADA EM MICROSCÓPIO ESPECIAL PARA 
FLUORESCÊNCIA, COM LÂMPADA, LENTES E FILTROS 
ESPECÍFICOS PARA PERMITIR A VISUALIZAÇÃO SELETIVA 
DO COMPRIMENTO DE ONDA DE CADA FLUOROCROMO, 
ALÉM DE SISTEMA FOTOGRÁFICO DIGITAL ESPECIAL DE 
ALTÍSSIMA RESOLUÇÃO PARA CAPTURA, COMPOSIÇÃO E 
ANÁLISE DAS IMAGENS. 
 
 
CISH 
A HIBRIDIZAÇÃO “IN SITU” CROMOGÊNICA (CISH 
– CHROMOGENIC IN SITU HYBRIDIZATION) É IMPORTANTE 
MÉTODO DE PATOLOGIA MOLECULAR PARA DETECTAR 
ALTERAÇÕES GENÉTICAS EM ASSOCIAÇÃO COM A 
MORFOLOGIA CELULAR, PARTICULARMENTE DETECÇÃO DE 
GENOMA DE VÍRUS, QUE PODEM SER IMPORTANTES PARA 
O DIAGNÓSTICO, PROGNÓSTICO E ORIENTAÇÃO 
TERAPÊUTICA NÃO APENAS DE DOENÇAS INFECIOSAS, MAS 
TAMBÉM DE ALGUMAS NEOPLASIAS, TAIS COMO LINFOMAS 
E O CÂNCER DE COLO UTERINO. 
 
O EXAME DE CISH É UM MÉTODO DE PATOLOGIA MOLECULAR 
CARACTERIZADO PELA IDENTIFICAÇÃO E LOCALIZAÇÃO DE 
ÁCIDOS NUCLÉICOS ALVO (SEQUÊNCIAS DE DNA OU RNA), 
ATRAVÉS DA LIGAÇÃO COMPLEMENTAR DE SONDAS 
(SEQUÊNCIAS DE DNA CONHECIDAS, GERALMENTE OBTIDAS 
COMERCIALMENTE) MARCADAS COM MOLÉCULAS 
CROMOGÊNICAS (I.E., QUE CONFEREM COR ÀS ÁREAS 
MARCADAS), PERMITINDO IDENTIFICAÇÕES DE MATERIAL 
GENÉTICO EM CÉLULAS ATRAVÉS DA OBSERVAÇÃO EM 
MICROSCÓPIO ÓPTICO CONVENCIONAL. 
RESUMIDAMENTE, A TÉCNICA DE ISH CONSISTE NA 
LIGAÇÃO/HIBRIDIZAÇÃO DE UM DNA MARCADO (SONDA) 
COM OS ÁCIDOS NUCLÉICOS PRESENTES EM UM TECIDO, 
DAÍ O TERMO HIBRIDIZAÇÃO “IN SITU”. PARA REVELAR 
Hibridização 
ESSA LIGAÇÃO PODE-SE USAR REVELADORES 
FLUORECENTES (FISH), CROMÓGENOS (CISH), PRATA 
(SISH) OU DUPLA MARCAÇÃO CROMOGÊNICA (DISH). 
 
APLICAÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ASSIM, DESCOBRIMOS AS MUTAÇÕES. O GENE MUDOU DE 
POSIÇÃO, NESSE CASO TRANSLOCOU. 
 
Hibridização 
MECANISMOS DE SINALIZAÇÃO: MEMBRANA (BLOT) 
 
1. NORTHEN BLOT (RNA) 
2. SOUTHERN BLOT (DNA) 
 
“IN SITU” – COLETA, BIÓPSIA OU ESFREGAÇO, UTILIZO 
NO PRÓPRIO TECIDO. 
 
MEMBRANA – TRITURA-SE O TECIDO E EXTRAI-SE TODO 
O DNA/RNA DA AMOSTRA.