Prova 01 - Resumo - Virologia Geral

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PROVA 01 – RESUMO – VIROLOGIA GERAL COMPARADA
Técnicas em Virologia
Amostras clínicas: sangue, fezes, raspagem de mucosas
* Armazenamento em freezer -80 ºC
* Após pegar material: eliminar contaminação bacteriana
- por filtração;
- por centrifugação.
Isolamento viral de infecções em animais
* Cultura celular
- Céls primárias de fibroblastos;
- Linhagens estabelecidas de camundongos (3T3);
- Linhagens estabelecidas humanas (HeLa).
*Efeito citopático: possibilita averiguar infecção das céls por vírus
- As céls mudam de forma;
- Formação de sincício (grandes estruturas arredondadas).
* Placa viral: placa parecida com a de 96 poços; diluições das qtds amostrais de vírus.
- Onde houver vírus: formação de “halos” apontando onde há partículas virais;
- Vacina com vírus atenuado: a cada diluição, maior variabilidade genética >> mais chances de sobreviver um vírus mais susceptível.
Isolamento viral de infecções em plantas
* Inoculação mecânica ou por vetores
Identificação viral
* Morfologia (ex. microscópio eletrônico);
- Identificação de famílias
	- Vírus de animais: morfologias muitos diferentes de vírus DNA e RNA;
	- Vírus de plantas: comumente mais alongados.
* Sorologia (ex. ELISA, western blot, teste rápido);
- Diagnóstico
	- Busca por anticorpos na amostra (placa de ELISA preparada com o antígeno): detecção indireta;
	- Busca por antígenos: detecção direta.
- Anticorpos
	- Policlonal:
1) injeta partícula viral em animal (geralmente coelho);
2) diferentes anticorpos para um mesmo alvo.
	- Monoclonal:
1) Injeta partícula viral em animal (geralmente camundongo);
2) retira baço >> fusão dessas céls com céls de mieloma;
3) Contagem de hibridomas/ μL >> “diluições” (na placa: só usa poços contendo um hibridoma).
Obs.: Morfologia + Sorologia
- Microscópio de fluorescência;
- Immunogold.
* Molecular (ex. PCR, Microarranjos).
- Diagnóstico
	- PAGE: peso dos segmentos virais;
	- SSCP: genotipagem (single strand conformation polymorphism);
		- Agrupa as diferenças de estrutura;
1) PCR: desnaturação dos produtos;
2) Eletroforese: as fitas têm o mesmo tamanho, mas têm estruturas diferentes (visualizado pela diferença de altura das bandas).
	- HCA: captura híbrida
1) Desnaturação dos produtos e hibridização com a sonda de RNA;
2) Captura do híbrido com anticorpos;
3) Detecção do híbrido por quimioluminescência.
	- Dot-blot: auto-radiografia
	- Microarranjo: coloração diferenciada;
	- NGS: next generation sequence
		- que tipo de patógeno tem na amostra.
Taxonomia de vírus
Diferentemente de outros organismos, a classificação não é pelo modelo Lineu (já que vírus não se reproduz, como definir o que é uma espécie?);
* Por risco biológico:
	Categoria
	A
	B
	C
	Definição
	Maior risco de morte; alta disseminação
	Razoavelmente fácil de disseminar; baixa mortalidade; diagnóstico avançado
	Fáceis de produzir e disseminar; potencial para altos índices de mortalidade
	Exemplos
	Ebola, Anthrax
	Hepatite A, Virus do Nilo
	Influenza, Raiva, Febre Amarela
* Hierarquia:
	Hierarquia
	Ordem
	Família
	Subfamília
	Gênero
	Espécie
	Sufixo
	Virales
	Viridae
	Virinae
	-
	-
- Pra definir espécie: depende do gênero (sequenciamento);
- Para representar o gênero: Espécie tipo
- Nome da espécie confirmado: itálico
Nomenclaturas
* De acordo com a estrutura e morfologia
1) Ácido Nucleico
- Fita simples ou fita dupla;
- Linear ou circular;
- Segmentado ou não-segmentado;
- DNA ou RNA.
	- ssRNA: polaridade positiva >> mRNA >> infecta fácil
	- ssRNA: polaridade negativa >> anticomplementar ao RNA >> RNApol no envelope; se perdê-lo, deixa de ser infeccioso.
2) Capsídeo: capa de ptn que protege o ác. nucleico
- Capsômero: unidades morfológicas
- Icosaédricos, helicoidais ou complexos
3) Envelope: membrana lipídica que envolve nucleocapsídeo
- Podem conter glicoptns ancoradas (espículas);
- Boa parte da cél infectada >> brotamento através da MP.
Taxonomia
* Sistema de Baltimore: modo de classificação que ordena os vírus com base na característica do genoma viral e na forma como ele é transcrito a mRNA. 
* Classificações:
- dsDNA
	Família
	Poxviridae
	Herpesviridae
	Papillomaviridae
	Adenoviridae
	Envelope
	+
	+
	-
	-
	Segm. ác. nucleico
	1, linear: 130-375 kb
	1, linear: 125-240 kb
	1, circular: 7-8 kb
	1, linear: 26-45 kb
	Exemplo
	Varíola
	Herpes
	HPV
	Doenças resp.
- ssDNA
	Família
	Parvoviridae
	Envelope
	-
	Segm. ác. nucleico
	1, linear: 4-6 kb
	Exemplo
	Human Parvovirus B19
- dsRNA
	Família
	Reoviridae
	Envelope
	-
	Segm. ác. nucleico
	10-12, linear: 19-32 kb
	Exemplo
	Rotavirus
- ssRNA positivo
	Família
	Picornaviridae
	Flaviviridae
	Caliciviridae
	Envelope
	-
	+
	-
	Segm. ác. nucleico
	1, linear: 7-9 kb
	1, linear: 10-12 kb
	1, linear: 3-8 kb
	Exemplo
	Febre aftosa
	Febre amarela
	Diarreia suínos
- ssRNA negativo
	Família
	Orthomyxoviridae
	Paramyxoviridae
	Bunyaviridae
	Filoviridae
	Envelope
	+
	+
	+
	+
	Segm. ác. nucleico
	6-8, linear: 10-15 kb
	1, linear: 13-18 kb
	3, linear: 11-19 kb
	1, linear: 19 kb
	Exemplo
	Influenza A
	Caxumba
	Hantavirus
	Ebola
- dsDNA-RT
	Família
	Hepadnaviridae
	Envelope
	+
	Segm. ác. nucleico
	1, linear: 3-4 kb
	Exemplo
	Hepatite B
- ssRNA-RT
	Família
	Retroviridae
	Envelope
	+
	Segm. ác. nucleico
	?
	Exemplo
	AIDS
Replicação de vírus de RNA e de DNA
Obs.: Noções sobre replicação do genoma viral
- Vírus de fita simples (ssRNA +, ssRNA -, ssDNA): precisam de fita complementar ao genoma, que servirá de molde para síntese do material genético;
- Vírus de fita dupla (dsRNA, dsDNA): utilizam cada uma das duas fitas para gerar suas respectivas cópias complementares. 
	- Molécula de DNA sintetizada a partir de DNA;
	- Molécula de RNA sintetizada a partir de RNA. 
- Vírus RT: utilização de intermediários
	- ssRNA-RT: replicam o genoma a partir de um intermediário de DNA;
	- dsDNA-RT: replicam o genoma a partir de um intermediário de RNA.
Vírus de RNA
* Tipos
- ssRNA +
	- Como o genoma possui uma sequência idêntica a do mRNA, e podem ser utilizados prontamente para a síntese de ptns;
	- Comum a síntese de novas cópias positivas do genoma >> fita negativa como molde para a síntese de fitas positivas.
- ssRNA -
	- Por possuírem genoma como sequência complementar ao mRNA, servem diretamente como molde para a produção de fitas +
- ssRNA-RT
	- Genoma +; usa transcriptase reversa (DNA pol RNA dep.) pra produzir uma fita simples de DNA senso negativo que serve de molde à síntese da fita positiva de DNA >> integrada ao genoma do hospedeiro e utilizada para síntese de mRNA viral.
- dsRNA
	- Uma fita é positiva, outra negativa; fita negativa usada como molde para síntese de mRNA, no citosol, com auxílio de uma RNA pol RNA dep.
	- No núcleo; auxílio de enzimas celulares. 
* Organização genômica para replicação
- Proteínas virais na extremidade 5’
	- CAP 5’: típico de mRNA eucariótico, é uma ptn que protege o mRNA na extremidade 5’ contra ação de ribonucleases, ao mesmo tempo que atrai ribossomos >> cópia do mRNA;
	- VPg: ptn ligada ao genoma viral, agindo como primer durante síntese de RNA. (Relacionado com RpRd)
- Proteínas virais na extremidade 3’
	- Cauda de poli-A: típico de mRNA eucariótico, é uma estrutura composta com muitos resíduos de adenina >> ligação de ptns específicas, para proteger contra a degradação enzimática. (Relacionado com RpRd)
	- tRNA-like: sequências de RNA com estrutura terciária parecida ao tRNA, que adiciona aas na extremidade 3’ para encapsulamento e aumento da estabilidade do RNA, além de ser potenciador da tradução. 
* Estratégia de tradução de proteínas virais
- Considerando que o mRNA de eucariotos são monocistrônicos (codificam apenas um polipeptídeo), mas o viral é policistrônico, foi necessário algumas estratégias para resolver esse impasse:
	- RNA subgenômico (sgRNA): RNA de tamanho menor que o RNA genômico, envolvidos na produção de ptns capsidiais (promotor pra RpRd) >> mesma sequência 3’; início 5’ diferente.
	- Poliproteína: todainformação genética contida no genoma viral pode estar codificada em apenas uma ORF, a partir da qual um único mRNA é produzido >> várias ptns virais concatenadas, que posteriormente serão clivadas em sequências peptídicas individuais.
	- Combinação de sgRNA com poliproteína
	- Segmentação de genoma: cada ORF é codificada por um segmento de RNA genômico diferente, os quais são traduzidos separadamente. (ex. Influenza A)
* Outras proteínas virais
- Estrutural: Nucleocapsídeo, Core protein, Proteína de membrana (Glicoproteína)
- Não-estrutural: RNA Pol, Protease (poliproteína), Metiltransferase, Helicase, Co-enzima, Inibidor de Apoptose/RNAi/Citocina	
Vírus de DNA
* Tipos 
- ssDNA
	- Possuem fita positiva ou negativa; para a síntese de mRNA, há produção de uma fita complementar ao genoma, gerando uma dupla fita que serve como molde para a transcrição;
	- Transcrição no núcleo, com auxílio de DNA pol DNA dep.
- dsDNA
	- ORFs em ambas as fitas de DNA >> moldes diretos para síntese de mRNA;
	- Se transcrever no núcleo: usam RNA pol II celular pra síntese de mRNA;
	- Se transcrever no citosol: RNA pol DNA dep.
- dsDNA-RT
	- Síntese de mRNA no núcleo, usando RNA pol II;
	- Transcrição reversa ocorre após a replicação do genoma viral.
* Organização genômica para replicação: DpDd
- Origem da DNA pol
- Limitações ao usar DNA pol
	- DdDP sempre requere Primer; 
	- Muitas proteínas assessoras são necessárias: primase, helicase, topoisomerase, ligase
- Ciclos de replicação
	- Parvoviridae: Human parvovirus B19
		- ss-DNA; linear; não-envelopado, DpDd celular
		- Não sintetiza primer >> replicação por Self Priming (genoma se dobra)
	- Adenoviridae: Human adenovirus C
		- ds-DNA; linear; não-envelopado; DpDd viral
		- Não sintetiza primer >> Protein Priming (síntese de primer de ptn pré-terminal; DBP se liga para deslocar a segunda fita formando um loop, e incluindo uma segunda origem, e assim sucessivamente)
	- Herpesviridae: Human herpesvirus 1
		- ds-DNA; linear; envelopado; DpDd viral
		- Não sintetiza primer >> circularização genômica
	- Poxviridae: Vaccinia vírus, Variola virus
		- ds-DNA; circular; envelopado; DpDd viral
		- Não sintetiza primer.