Imunofluorescência: Conceitos e Aplicações

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
UMUARAMA, 24 DE OUTUBRO DE 2014
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Conceitos Básicos
Imunofluorescência é definida como uma técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares.
São utilizados anticorpos  específicos, marcados com fluorocromo, que absorvem a luz ultravioleta (UV) permitindo sua observação ao microscópio. 
O teste é muito utilizado nos diagnósticos laboratoriais para pesquisas de Anticorpos.
Fluorocromo
São corantes que absorvem a luz UV e emitem luz visível.
Fazem ligações covalentes emitindo coloração diferente da de tecidos, funcionando como marcadores.
São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios, sendo os mais comuns:
Fluresceína (FITC)
Rodamina (TRICT)
Três formas distintas da Imunofluorescência:
Fluorescência específica
Fluorescência não específica
Autofluorescência
O microscópio de leitura pode ser de:
Epiluminescência
Confocal
Microscópios
Microscópio Confocal
Tipos de Reação
Imunofluorescência Direta (IFD)
Conhecida também como técnica de camada simples
Utilizada para detecção de Antígenos em amostras clínicas, com Anticorpos marcados com fluorocromos. 
As etapas compreendem:
Fixação do esfregaço da lâmina;
Tratamento com anticorpo marcado;
Incubação;
Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados;
Visualização no microscópio fluorescente.
Imunofluorescência Direta (IFD)
VANTAGENS
Alta especificidade e sensibilidade;
Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização;
DESVANTAGENS
Alto custo do microscópio de fluorescência;
Necessidade de um conjugado para cada antígeno a ser identificado;
Subjetividade da leitura
Aplicações
Detecção direta de microorganismos em secreções, urina, fezes e em cortes de tecidos
Utilizado na fenotipagem de células tumorais
Em bacteriologia, é usado em laboratório clínico na identificação de Streptococcus do grupo A.
Reação de imunofluorescência direta positiva mostrando formas amastigotas do parasito em esfregaço de aspirado de linfonodo poplíteo de cão naturalmente acometido por leishmaniose visceral, marcadas pelo anticorpo policlonal anti-Leishmania conjugado com fluoresceina.
Imunofluorescência Indireta (IFI)
Também conhecida como técnica de dupla camada
PARA PESQUISA DE ANTÍGENOS
Incuba-se a célula ou o tecido com o anticorpo específico, formando um imunocomplexo.
Realiza-se lavagem para retirar os anticorpos não ligados
A preparação é incubada com conjugado, marcado com fluorocromo.
O preparado é observado em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência Indireta (IFI)
PARA PESQUISA DE ANTICORPOS
Antígenos padronizados são fixados à lâmina
O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para a formação do complexo Ag-Ac
Realiza-se a lavagem para retirada de anticorpos não ligados
A preparação é incubada com o conjugado fluorescente, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno
O preparado é observado em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência Indireta (IFI)
VANTAGENS
Sensibilidade
Especificidade
Reprodutibilidade
De simples padronização e execução
O mesmo conjugado pode ser utilizado em sistemas diferentes 
Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos
Imunofluorescência Indireta (IFI)
DESVANTAGENS
Necessidade de microscópio de fluorescência 
Subjetividade da leitura
Não-automação
Aplicações
Toxoplasmose
Neosporose
Raiva
Campilobacteriose Genital Bovina
Babesiose 
Leishmaniose 
Criptosporidiose 
Estrongiloidose 
Giardiose 
Aspecto de uma reação positiva de imunofluorescência indireta para a detecção de anticorpos contra promastigotas de Leishmania. Os anticorpos humanos ligados aos promastigotas são reconhecidos por anticorpos marcados com fluoresceína.
Anticorpos anti músculo liso observados por imunofluorescência indireta, envolvendo fibras de músculo liso de vasos sanguíneos.
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI - IgM) positiva, com corte parafinado de Schistosoma mansoni.
Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) positiva mostrando formaspromastigotas de Leishmania marcadas pela fluoresceína
As células endoteliais sob o microscópio. Os núcleos são marcados de azul com DAPI, os microtúbulos são marcados de verde por um anticorpo ligado ao FITC e os filamentos de actina são rotulados em vermelho com a faloidina ligada ao TRITC. Células endoteliais da artéria pulmonar bovina (BPAE)
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI – IgG) positiva, com antígeno de Trypanosoma cruzi.
Considerações Finais
As técnicas de Imunofluorescência ainda são utilizadas na rotina laboratorial, mas estão sendo substituídas por testes imunoenzimáticos devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação 
 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
Eder Takeshi 
Heimy Pissinati
Isabelle Ramos
Luciana Heller
Maria Paula Bini
Silvia Sayuri