Principais Métodos de detecção e quantificação de microorganismos em alimentos

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UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
FARMÁCIA 
 
 
 
DANIEL LACERDA DE AZEVEDO 
INGRID MARQUES PEREIRA 
KAMILLA GONÇALVES DA CUNHA FERREIRA 
LILIANE GUIMARAES DE ASSUNÇÃO FARIAS 
MILENA GUERRA RODRIGUES 
MIQUELY DO COUTO LOPES 
RAQUEL CAROLINE ARAUJO DE SOUZA 
SYMON DA COSTA CRUZ 
TAIANARA DE SOUZA CASTRO 
TAMARA JANE DE ALMEIDA ALVARENGA 
VANESSA PAIVA VIEIRA 
 
 
 
ATIVIDADE PRÁTICA SUPERVISIONADA 
 Principais métodos de identificação e quantificação de microrganismos em alimentos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANAUS - AM 
2022
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DANIEL LACERDA DE AZEVEDO 
INGRID MARQUES PEREIRA 
KAMILLA GONÇALVES DA CUNHA FERREIRA 
LILIANE GUIMARAES DE ASSUNÇÃO FARIAS 
MILENA GUERRA RODRIGUES 
MIQUELY DO COUTO LOPES 
RAQUEL CAROLINE ARAUJO DE SOUZA 
SYMON DA COSTA CRUZ 
TAIANARA DE SOUZA CASTRO 
TAMARA JANE DE ALMEIDA ALVARENGA 
VANESSA PAIVA VIEIRA 
 
 
 
Principais métodos de identificação e quantificação de microrganismos em alimentos 
 
 
 
 
Atividade prática supervisionada apresentado ao 
Instituto de Ciências e Saúde da Universidade 
Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do 
de nota parcial para a disciplina APS. 
 
Orientador: Prof. Fábio Raphael Moreira Cáuper 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manaus - AM 
2022 
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INTRODUÇÃO 
Inicialmente, a análise microbiológica de alimentos era utilizada para testar o produto cuja 
liberação dependia do resultado dela. Lotes com resultados negativos eram liberados para a 
distribuição, enquanto os lotes positivos eram reprocessados ou descartados. Embora essa 
abordagem tenha reduzido a liberação de produtos contaminados ao mercado, não ajudou a 
prevenir produtos contaminados ou melhorar de maneira eficiente a produção. Atualmente, a 
abordagem mais eficaz de segurança de alimentos tem por objetivo eliminar os patógenos 
alimentares por meio de uma atuação proativa, considerando desde os ingredientes até o 
produto, ou seja, utilizando a implementação do sistema de Análise de Perigos e Pontos 
Críticos de Controle. Prevenindo a entrada dos patógenos no processo produtivo ou 
reduzindo-os a níveis aceitáveis, e com controle microbiano nos locais críticos, o produto 
deve sair de acordo com as especificações desejadas. Portanto, hoje, o foco da segurança de 
alimentos está baseado na prevenção e no controle dos processos. Analisar amostras 
ambientais e de alimentos quanto à presença de bactérias patogênicas, deteriorantes, fungos e 
toxinas, é uma prática-padrão para garantir a segurança e a qualidade do alimento. 
 
1- OBJETIVO 
Demonstrar os principais métodos de identificação e quantificação de microrganismos em 
alimentos utilizados em diversos setores da indústria alimentícia. 
 
TIPOS DE MÉDOTOS 
CONVENCIONAIS 
Os métodos convencionais de cultivo de células normalmente requerem vários dias antes de a 
colônia do organismo-alvo ficar visível, obtendo um resultado contestável do teste. Apesar 
dessa limitação, muitos métodos convencionais são reconhecidos e aprovados para uso 
internacional pelas ISO ou FDA, e são procedimentos considerados como o “padrão ouro”, 
aos quais todos os outros são comparados. Os métodos convencionais são relativamente fáceis 
de utilizar, porém requerem pessoal. do laboratório treinado para preparo de amostras e 
interpretação dos resultados. Boas práticas laboratoriais são necessárias para o preparo da 
amostra e dos meios, e a maior parte do material necessário é consumível e descartável. Existe 
uma grande quantidade de companhias que produzem meios desidratados, meios prontos em 
placas e placas para amostragens. 
 
 
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IMUNOLÓGICOS 
Os métodos imunológicos são, em sua maioria, baseados na afinidade da ligação antígeno-
anticorpo e utilizam a tecnologia do ensaio imunoenzimático indireto (ELISA). Anticorpos 
com alta especificidade a um antígeno do organismo-alvo são ancorados em uma superfície 
sólida, como as cavidades de uma placa de microtitulação. Se estiver presente na amostra, o 
antígeno-alvo irá ligar-se ao anticorpo, e o organismo não alvo será removido por lavagens 
subsequentes. Um segundo conjugado de anticorpo a uma enzima (p. ex., horseradish 
peroxidase) é então adicionado, o qual se ligará ao complexo superfície-célula-anticorpo 
preexistente, formando o que é conhecido como um “sanduíche anticorpo-antígeno-anticorpo”. 
A presença da célula-alvo é visualizada pela adição do substrato da enzima, resultando em 
uma reação colorimétrica ou fluorescente, cuja intensidade determina a presença ou a 
ausência do organismo-alvo na amostra original. 
 
MOLECULARES 
Os métodos moleculares têm por base principalmente a reação em cadeia da polimerase 
(PCR). Sendo baseado no DNA, o método pode ser de alta precisão e não está sujeito a 
variações devido a expressão da proteína, como pode ocorrer com os métodos imunológicos 
que se baseiam na estrutura da superfície celular. Contudo, a detecção em geral ocorre após a 
demorada etapa de enriquecimento para aumentar o organismo-alvo a cerca de 104. Como nos 
outros métodos, os moleculares necessitam de pessoal treinado no laboratório para análises de 
amostras. 
 
PRINCIPAIS MÉTODOS DE ANÁLISES MICROBIOLÓGICA EM ALIMENTOS 
MEIOS DE CULTURA 
A microbiologia de alimentos convencional requer o uso de caldos e ágares para cultivo do(s) 
organismo(s)-alvo. Esses meios devem suprir as necessidades nutricionais e fisiológicas do 
organismo. Portanto, os meios devem ser desenvolvidos com proteína suficiente, carboidratos, 
minerais e com o pH adequado, e serem incubados sob condições favoráveis de temperatura e 
disponibilidade de oxigênio por um período apropriado. Em termos gerais, meios na forma de 
caldo ou ágar sólido podem ser: 
 (a) não seletivos ou capazes de permitir a multiplicação da maioria dos organismos da 
amostra; 
(b) seletivos para favorecer a multiplicação do organismo-alvo; 
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(c) semisseletivos e diferenciais nos quais o organismo-alvo seja presuntivamente identificado 
com base na morfologia das colônias, incluindo cor na presença de outros organismos. 
 
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL 
A determinação do número mais provável (NMP) de coliformes em uma amostra é efetuada a 
partir de aplicação da técnica de tubos múltiplos. Esta técnica é baseada no princípio de que as 
bactérias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitação, resultando em uma 
suspensão de células bacterianas, uniformemente distribuídas na amostra. A técnica consiste 
na inoculação de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao 
crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma série de 
tubos. Por meio de diluições sucessivas da amostra, são obtidos inóculos, cuja semeadura 
fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da série em que eles foram inoculados; e 
a combinação de resultados positivos e negativos permite a obtenção de uma estimativa de 
densidade das bactérias pesquisadas pela aplicação de cálculos de probabilidade. 
 
 
Figura 1- Técnica de tubos múltiplos. 
 
Fase presuntiva: consiste em fazer a homogeneização e transferência de alíquotas e/ou 
diluições da amostra para tubos de ensaios contendo, no fundo, um tubo invertido para coleta 
de gás (tubo de Durhan), em caldo lauril triptose. Todos os tubos são incubados a 35°C 
durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento positivo de 
coliformes totais. O resultado é identificado pela ocorrência de reação ácida (coloração 
amarelada) ou produção de gás (retida no tudo de Durhan). 
 
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Fase confirmativa: efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de platina) dos 
tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que no anterior, porém 
contendo caldo verde brilhante. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 a 48 horas e 
posterior identificação dos que tiverem crescimentopositivo de coliformes totais, identificado 
pela ocorrência de produção de gás nos tubos de Durhan. 
 
TIPOS DE PLAQUEAMENTO 
PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE 
O método também é conhecido como contagem do número de células viáveis em uma 
determinada população, também denominada Contagem em Placa. Trata-se de um método 
indireto que se baseia no princípio de que cada célula viável, quando presente no meio sólido, 
pode se multiplicar repetidas vezes e origina uma colônia visível a olho nu. A técnica se 
baseia no princípio de que quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de 
material, pode-se obter células individuais, separadas uma das outras, permitindo que o 
crescimento de uma célula não interfira com o da outra. Provavelmente cada colônia isolada é 
descendente de uma única célula e, portanto, uma cultura pura. Partindo da suposição de que 
as células com as quais estamos trabalhando não se agregam, cada uma dará origem a uma 
colônia. Contando as colônias que cresceram nas placas, teremos o número de bactérias da 
cultura que estamos ensaiando. Porém, como algumas bactérias formam agrupamentos ou 
arranjos, não é possível fazer esta relação, ou seja, estabelecer o n.º de colônias e o n.º de 
células. Por isso, o resultado deve ser expresso em UFC (Unidades Formadoras de Colônias). 
 
4.1.4- TÉCNICA POR ESPALHAMENTO “SPREADER PLATE” 
É um método comumente empregado na análise de alimentos. Amostras de alimentos são 
maceradas e diluições do produto são pipetadas em placas de Petri esterilizadas contendo o 
meio de cultura requerida para a análises. Após incubação, as colônias bacterianas são 
contadas em um contador de colônias que pode ser manual ou digital. O método de contagem 
total de microrganismos de alimentos por meio de placas baseia-se no plaqueamento de 
alíquotas do alimento homogeneizado e de suas diluições, onde é utilizado o meio de cultura 
Ágar Padrão para Contagem. A mudança de temperatura e tempo de incubação permite a 
contagem de grupos diferentes de microrganismos como: psicrotróficos, mesófilos, termófilos 
e termodúricos. A contagem é expressa em número de bactérias por mililitro do meio de 
cultura ou UFC/mL. 
 
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 Figura 2- Técnica por espalhamento ou “Spreader Plate”. 
 
TÉNICA EM MISTURA (“POUR PLATE”) 
É também conhecida como técnica em profundidade. Nesta a amostra é diluída em tubos 
diluentes e adicionadas alíquotas em uma placa de Petri esterilizada vazia, onde 
posteriormente será adicionado ágar liquefeito (fundido), e após solidificação, as placas serão 
incubadas. Como alguns microrganismos são retidos abaixo da superfície do ágar durante a 
solidificação, a placa mostrará colônias na superfície e colônias situadas logo abaixo da 
mesma. Esta técnica é recomendada para isolamento de microrganismos móveis ou quando há 
suspeita de microrganismos anaeróbios e muito utilizado para a contagem microbiana em 
diferentes diluições, em uma análise de alimento. 
 Figura 3- Técnica por derramamento ou “Pour Plate”. 
 
MÉTODOS RÁPIDOS 
As novas tecnologias para a identificação de patógenos são mais rápidas do que os métodos 
convencionais e estão cada vez mais automatizadas. Os procedimentos convencionais são, por 
natureza, trabalhosos e consomem muito tempo. Por isso, inúmeros métodos rápidos têm sido 
desenvolvidos para encurtar o tempo entre a coleta da amostra de alimento e a obtenção do 
resultado. 
ELISA 
Os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) são amplamente utilizados em microbiologia de 
alimentos. O ELISA em geral é realizado utilizando anticorpos mono e policlonais sobre 
placas para capturar o antígeno-alvo. O antígeno capturado é então detectado usando um 
segundo anticorpo conjugado a uma enzima. A adição de um substrato facilita a visualização 
do antígeno-alvo. Os métodos ELISA oferecem especificidade e podem ser automatizados. 
 
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TÉCNICAS DE BIOLUMINESCÊNCIA DE ATP 
A molécula de adenosina trifosfato (ATP) é encontrada em todas as células vivas (eucarióticas 
e procarióticas). Dessa forma, sua presença indica que existem células vivas. O limite de 
detecção é por volta de 1pg de ATP, o que é equivalente a 1.000 células bacterianas com base 
na suposição de 10-15g de ATP por célula. Entretanto, a bioluminescência por ATP é usada 
sobretudo como um método de monitoramento da higiene, e não para a detecção de bactérias. 
A bioluminescência por ATP pode ser utilizada como meio de monitoramento do regime de 
limpeza, sobretudo em um ponto crítico de controle (PCC) em sistemas de Análise de Perigos 
e Pontos Críticos de Controle (APPCC). 
 
 
MÉTODOS PARA TIPIFICAÇÃO MOLECULAR 
A tipificação de micro-organismos é uma ferramenta importante para a investigação de surtos 
e fiscalização, tanto em âmbito nacional como internacional. A tipificação molecular precisa 
ter alto poder discriminatório para poder distinguir isolados relacionados dos não relacionados. 
Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) 
A PFGE é aplicada em muitas bactérias, sendo um dos métodos de fiscalização mais 
amplamente utilizados; ver Seção 1.12.3. Em geral é o método de genotipificação de escolha, 
ou “padrão ouro”, ao qual outros métodos de genotipificação são comparados. O CDC, como 
também outras autoridades sanitárias, padronizaram o método PFGE para alguns patógenos 
específicos. Esse é o método atualmente utilizado no PulseNet para as atividades de vigilância 
das infecções de origem alimentar por Salmonella, E. coli O157, Shigella spp., L. 
monocytogenes, C. jejuni e norovírus. 
 
ANEXO 
 
Link de acesso para o vídeo: <https://drive.google.com/file/d/1PVZZjXFkNvZsHGJj-
r99BA0RosiZA4M3/view?usp=drivesdk> 
 
 
 
 
 
 
https://drive.google.com/file/d/1PVZZjXFkNvZsHGJj-r99BA0RosiZA4M3/view?usp=drivesdk
https://drive.google.com/file/d/1PVZZjXFkNvZsHGJj-r99BA0RosiZA4M3/view?usp=drivesdk
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REFERÊNCIA 
 
FORSYTHE, S. J. Métodos de detecção e caracterização. In: FORSYTHE, S. J. 
Microbiologia da segurança dos alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2013. p. 295-325. 
 
ONÓRIO, DANIELI FERREIRA; SEIXAS, FLÁVIO AUGUSTO VICENTE. Uso de FT-
NIR para a identificação e quantificação de microrganismos em alimentos. Uningá Review 
Journal, v. 3, n. 1, p. 3-3, 2010. 
 
COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO. Norma Técnica n. 5